其它的分子诊断检测技术 ppt课件.ppt

其它的分子诊断技术,分子诊断学,可以检测基因突变的方法及其优缺点,本章内容,1基因突变相关知识和检测技术的复习和总结2基因变异检测技术3脉冲电场凝胶电泳4分子影像,1基因突变相关知识和检测技术的复习和总结,1-1染色体突变（chromosomemutation）指染色体结构和数量的变异（包括：缺失、重复、倒位和易位），致染色体遗传病*涉及的基因较多*可经光学显微镜分析有丝分裂中期染色体来检出*可在细胞的有丝分裂间期用标记探针检出（染色体原位杂交）,有丝分裂各期特征,间期：DNA复制以及有关蛋白质合成前期：膜仁消失现两体。即核膜核仁消失，出现纺锤体染色体中期：形数清晰赤道齐。即染色体形态、数目清晰，整齐分布在赤道板附近后期：点裂数增匀两极。即着丝点分裂染色体均匀分布在细胞两极末期：两消两现重开始。即纺锤体、染色体消失，核膜核仁出现，重新开始分裂,细胞分裂的中期：形数清晰赤道齐-染色体形态、数目清晰，整齐分布在赤道板附近,纺锤体清晰可见。这时候，每条染色体的着丝点的两侧，都有纺锤丝附着在上面，纺锤丝牵引着染色体运动，使每条染色体的着丝点排列在细胞中央的赤道板上。分裂中期的细胞，染色体的形态比较固定，数目比较清晰，便于观察清楚,Dual-colorFISH检测白血病细胞间期核的费城染色体BCR基因呈红色，ABL基因呈绿色，融合基因呈黄色,融合基因费城染色体（BCR-ABL）的检测,显示这段附加的染色体来源于2号染色体(M-FISH),9号染色体短臂上的附加段来自？（Rx-FISH),细胞分裂中期的染色体,1相关知识和检测技术的复习和总结,1-2缺失、重复和插入（涉及多个碱基）引起移码突变，即DNA片段中某一位点插入或丢失一或几个（非3或非3的倍数）碱基时，可致其后的全部编码顺序发生错位的一种突变1-3点突变（pointmutation）是肿瘤和遗传病发生的主要分子机制(癌基因激活和抗癌基因失活等），是基因突变分析的主要内容,点突变的类型,点突变：即单碱基替换（singlebasesubstitution）指由单个碱基改变发生的突变，包括：*转换（transition)：一种嘌呤被另一种嘌呤取代或一种嘧啶被另一种嘧啶取代*颠换（transversion）：嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤,1-4点突变的检测方法,1）PCR+探针：PCR-ASO等2）PCR+其它技术：PCR-SSCP,PCR-RFLP3）连接酶链反应（LCR）4）PCR+DNA芯片技术5）PCR+DNA测序:实行单分子测序后，勿需PCR.6)PCR扩增阻碍突变系统,镰贫的ASO探针法检测一对探针（20bp左右），标记后用于杂交检测,等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleatide,ASO）,突变型遗传病的直接基因诊断,产前诊断,SSCP,RFLP：基因结构的改变导致酶切位点数目变化，因此酶切产生的片段的长度和数目也随之改变；通过与正常对照组比较，即可推断被分析的目的片段是否有结构改变,A,G,总长10kb酶切后3和7kb,图8-14LCR反应原理示意图,优势：能够准确分析基因序列中单个碱基突变。因此，在遗传病、肿瘤诊断、细菌和病毒的分型及致病力的鉴定中具有重要作用,LCR,遗传性耳聋基因检测芯片（图）乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片耐药性结核杆菌基因突变检测芯片,2基因变异检测技术,2-1PCR扩增阻碍突变系统2-2寡核苷酸连接实验2-3温度梯度凝胶电泳和变性凝胶电泳2-4变性高效液相色谱法(自学）2-5错配接合蛋白质截短测试法,1989年在PCR基础上发展起来的、通过PCR和凝胶电泳检测DNA中各种已知点突变的新方法PCRamplificationrefractorymutationsystem又：PCRamplifcationofspecificalleles,PASAalleles-specificPCR,ASPCR,2-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS),1)基本原理TaqDNA聚合酶无35外切酶活性，不能纠正3端的错配，因此对于Taq酶的扩增，3端必须完全配对，以实现高效扩增当PCR的引物的3端与模板之间存在错配时，PCR的扩增效率极差，甚至完全不扩增即“扩增阻碍”,2-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS),1-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS),设计两个5端引物，突变点位于其3端A:与正常DNA互补（其3端与突变基因不匹配)B:与突变DNA互补（其3端与正常基因不匹配)设计一个公用的3端引物（C）利用这2对引物分别扩增样本（A,C/B,C）然后,电泳检测,1-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS),结果：*突变引物(B,C)扩增突变基因，正常基因扩增受阻*正常引物(A,C)扩增正常基因，突变基因扩增受阻,结果判读,2）应用（1）检测单个位点的突变（2）检测多个位点的突变：借鉴多重PCR原理，可同时检测4-6种等位基因突变位点（3）基因分型（纯合突变或杂合突变）,（1）检测的特异性依赖于反应条件的优化，即不允许引物与靶DNA在错配时出现延伸可通过提高复性（退火）时引物与模板杂交的严格度来提高检测的特异性（2）可借助多重PCR同时检测多个点突变，不用放射性标记，不需要昂贵的试剂及复杂的检测系统，是多点突变检测的理想方法（3）缺点：只能检测已知的基因突变（或多态性）,3)方法的特点,2-2寡核苷酸连接实验（OLA),1）原理：设计两个相邻的寡核苷酸探针（约20nt），其相邻的位点正好是已知的突变位点，探针与靶序列杂交后头尾相接（53方向）如果探针和靶序列完全互补，DNA连接酶就会将两探针通过磷酸二酯键共价连接起来如果探针相邻之处有一个碱基不匹配，则连接效率大大降低，即连接阻遏,2-2寡核苷酸连接实验,1）原理:需要3个探针一个通用探针（它可与靶基因完全互补杂交）一个针对正常序列的探针（只与正常序列匹配、结合）一个针对突变序列的探针（只与突变序列匹配、结合）通用探针+与上述2种探针在连接酶的作用下，头尾相接，形成长链（2个探针长度之和）,野生型等位基因的DNA变性为单链DNA，等位基因特异探针和通用探针分别与之杂交,（1）野生型等位基因特异探针和通用探针能够与正常靶序列完全互补，然后连接酶将它们连接成一条长链（2）突变型等位基因探针与正常靶序列无法完全互补，因此连接酶不能将它与通用探针连接，故仅短链（3）如果2个探针的反应体系都出现连接反应产物（长链），说明什么？,通用探针（AGAT）,野生型等位基因特异探针(ATTGA),突变型等位基因特异探针(ATTGG),20bp,40bp,通用探针,野生型者,野生型者,杂合子,2-2寡核苷酸连接实验,1）原理常用连接酶是T4DNA连接酶和TthDNA连接酶如果采用耐热的连接酶，则：（1）变性、复性和连接可以循环进行，连接产物呈线性增长（2）同时，杂交的严格度也因杂交温度提高而提高，检测特异性得以提高,2-2寡核苷酸连接实验,2）应用直接检测靶序列欲提高检测灵敏度时，也可先扩增靶序列目前OLA被广泛用于多种遗传病及常见病的分子检测,应用PCR-OLA进行分子检测的遗传病,优点:（1）PCR-OLA检测的特异性高，影响因素少，不容易产生假阴性和假阳性（2）利用耐热连接酶可循环进行连接反应，以使信号得到放大，进一步增强灵敏度（3）PCR-OLA可一次检测多个变异（位于一或几个等位基因内）,3）方法学评价,2-2寡核苷酸连接实验3）方法学评价,缺点（1）最大缺点就是整个实验过程需要多相参与（2）需要PCR扩增以达到检测限，限制了该方法的规模（3）多重PCR易产生非特异产物，致其重现性不够,2-3温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE),1）基本原理（1）DNA的Tm值有序列依赖性，故在一定温度时其解链的程度由Tm决定（2）DNA的突变会改变其Tm值（3）TGGE时：不同Tm值的分子将在不同温度的凝胶位置发生解链（4）部分解链后呈复杂分枝构象的DNA分子的迁移率明显降低，终致不同分子在凝胶的不同位置形成条带,2）PCR产物突变的检测原理,（1）杂合子的PCR产物中含有四种双链分子两种同源双链DNA分子：wt1/wt2，mt1/mt2两种为异源双链分子：wt1/mt2，mt1/wt2,Wt:wildtype;mt:mutanttype,wt1:ATTGGCCAGTTACCATT(wt1/wt2)wt2:TAACCGGTCAATGGTAAmt1:ATTGGCAAGTTACCATT(mt1/mt2)mt2:TAACCGTTCAATGGTAAwt1:ATTGGCCAGTTACCATT(wt1/mt2)mt2:TAACCGTTCAATGGTAAmt1:ATTGGCAAGTTACCATT(mt1/wt2)wt2:TAACCGGTCAATGGTAA,C,2）PCR产物突变的检测原理,（2）2个同源双链分子由于序列不同，分子的Tm值不同，其解链速度和迁移率不同，从而形成不同的条带，但是，其相对位置不定，取决于变异对Tm值的影响：上还是下调（3）异源双链分子由于含有错配碱基和突出结构，致含有该突变的“解链区域”的Tm值显著降低，电泳时，其位置总是位于同源分子之上,TGGE突变检测原理正常人：3和4，只有野生型等位基因（wt/wt,d）突变纯合子：2，只有变异等位基因的同源双链带（mt/mt,c）杂合子：1、5和6（除d外，还有c及异源双链带（wt/mt,a和mt/wt,b）,2-4变性梯度凝胶电泳(denaturing-gradientgelelectrophoresis,DGGE),1）原理：20世纪80年代初诞生双链DNA在变性因素线性增加的梯度凝胶中电泳的一种实验，其变性方式：加热（常恒定在60）和固定比率的甲酰胺（040）、尿素（07M）这些梯度变性的作用相当于TGGE中的温度梯度的作用，使不同DNA在不同的凝胶部位发生解链，引起迁移率下降，从而将不同的DNA分子分离,2）DGGE法分析PCR产物的特点（1）如突变发生在最先解链的DNA区，检出率可达100*为提高其检出率，可人为地加入一个高熔点区GC夹GCclamp：就是在一侧引物的5端加上一个3040bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使突变区Tm处于相对低水平而先解链，此举可提高检出率至近100%（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100500bp的片段（3）不需同位素掺入（4）操作简便、快速（24小时内）（5）重复性好但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵,DGGE/TGGE的方法学评价,*均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选*目前主要用于检测基因突变所致疾病，尤其是只有一个等位基因突变引起的疾病因为杂合子比纯合子多3条带，很容易相互区分,DGGE/TGGE方法学评价,优点：*检测已知突变的灵敏度都接近100*适合于检测突变频率在50以下的稀有变异缺点：只能检测较低Tm的“解链区域”中的突变。为什么？,基因突变频率：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值,*一个DNA分子中有几个解链区*各个解链区有不同的Tm值*一旦温度到达最低Tm值解链区的Tm，则该分子就形成部分双链的分枝结构，其电泳迁移率急剧降低，致该分子很难“跑”到远处的高温度区。因此，如果变异在高Tm区，就难以检测*同时，较高温度解链的区一旦解链，常常导致DNA分子的完全解链，成单链分子，而小的变异对单链分子之间的电泳迁移率的影响不大,2-5变性高效液相色谱法(DHPLC),是目前最灵敏的检测基因变异的方法&灵敏、自动化、高通量，并可检测各种类型的突变&2-5分钟可以检测出1.5kb的分子中的单核苷酸替代、小片段缺失或插入等基因变异&广泛用于人类疾病的基因突变检测及SNP的筛查,(1)DHPLC的分离系统固定相：柱填料（电中性、疏水性）=惰性物（碳-18烷烃链）+聚苯乙烯-二乙烯基苯（无孔微球体)桥分子：既有疏水性又带正电荷的TEAA，是DNA片段与填料之间的桥分子流动相：不同浓度的有机溶剂乙腈，逐步洗脱不同的DNA片段；洗脱后的DNA通过紫外检测，不需电泳,1）DHPLC的基本原理,TEAA:三乙基铵醋酸盐；离子对试剂；通过疏水基团与填料发生反应；再借其正电荷与DNA反应,（2）DHPLC工作模式,当柱温70时，为完全变性分离（为单链分子）：顺序取决于分子的碱基组成和片段长度当70柱温50时,为部分变性分离：杂合双链的洗脱顺序是AC、GT、AT和GC，纯合双链最后下来,DHPLC对单链DNA分子的分离顺序,对于只有3端一个核苷酸差异的四种可能的同质异构体的保留时间的顺序为：CGAT,杂合突变时，细胞中有2个不同的等位基因，野生型和突变型；将其扩增、变性后缓慢退火，可产生4种双链分子（2个同源、2个异源）；DHPLC在不同的分离条件下可以将这4者进行完美的分离,（3）检测突变的原理：异源双链分子的形成！,异源双链分子热稳定性差（不完全配对），与固定相的亲和力较弱，较同源双链分子先被洗脱下来,异源双链的形成及DHPLC分离,杂合双链分子的出峰时间：由碱基对的热稳定性决定ACGTAT20%的变异：直接测序的检出率为80DHPLC的检出率可达到100*频率20%的突变，测序方法很难检测，而DHPLC可检测到突变率为0.5-5%的变异，且重现性很好（用什么测序技术可以例外？）,基因突变频率：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值,乳腺癌相关基因BRCA1、BRCA2等疾病相关基因的分子检测肿瘤样本中杂合性缺失的检测（Lossofheterpzygosity,LOH）菌株分型（TB等）,（3）广泛应用于疾病的基因突变检测和SNP筛查,DHPLC的特点,2-6蛋白质截短实验(PTT),前述方法可检测已知突变、未知突变；但是，无从知道这些变异的存在是否与疾病的发生相关本法只检测与疾病相关的突变，即导致蛋白不能全长翻译的突变称：体外蛋白质合成检测技术蛋白质截短实验（proteintruncationtest,PTT),以扩增产物为模板，从头合成蛋白质，从而筛寻该基因的终止密码，包括三个主要步骤：(1)提取基因组DNA-PCR或提mRNA,RTPCR得到靶基因(2)以PCR产物为模板转录mRNA，再翻译成蛋白质(3)采用SDS-PAGE分析所合成的蛋白质，通过比较迁移率的差异，区分基因变异而产生的截短产物与正常的全长蛋白产物,1）PTT基本原理,蛋白质截短实验原理示意图,优点只检测出与疾病相关的蛋白截短突变可检测出在RNA形成过程中发生的突变（剪接突变）不受基因多态性的干扰（多态性于非编码区）截短蛋白分子的长度可指明突变的位置,3）PTT方法学评价,3）PTT方法学评价,缺点对于含几千bp和多个外显子的疾病基因，就需要分成N个12kb的片段分别扩增，分别进行PTT检测检测不出编码序列中小的插入或缺失或错义突变（对长度无明显影响）引起mRNA量改变或不稳定的突变可能被漏检,PTT在人类分子疾病检测中的应用,3脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE),3-1PFGE的原理3-2PFGE的分类3-3PFGE的应用,3-1PFGE的原理,在正交的交变脉冲电场中进行琼脂糖凝胶电泳时，其方向、脉冲时间和电压可交替改变每次电场方向改变时，DNA分子就需要一定的时间改变形状和迁移方向:此时，分子越大，分子构型转换所需时间就越长，转变迁移方向的时间也就越长,3-1PFGE的原理,对于不同大小的DNA大分子，其改变泳动方向所需的时间不等，迁移的速度也就不等，因此最终的迁移距离就不同如此，便可按DNA分子量大小使其分离,3-2PFGE的基本步骤,3-3PFGE的分类,1）倒转电场凝胶电泳（Field-InversionGelElectrophoresis,FIGE）*即间隔一定时间后使电场方向呈180反转*驱动DNA分子向前迁移的正向脉冲时间较反向的长一些，这样DNA分子的总迁移为向前，其时间比例为：向前：向后3：1*FIGE非常流行于较小片段的分离600kb750kb，最大为800kb,在TAFE中，凝胶垂直放置，四个电极分别位于凝胶的前后而不是凝胶平面上。样品中的DNA分子由于电场变化的作用以“之”字形穿行于凝胶层中。由于电场相交的角度在电泳过程中不断变化，分子在整个电泳过程中的速度是变化的，可得到规则而锐利的DNA分离条带可分离大至1,600kb的片段，在病原生物的基因分析中有特殊的用途，这是以前不能进行分析的,2）交流电场凝胶电泳（Transverse-AlternatingFieldGelElectrophoresis,TAFE）,3）钳位均匀电场凝胶电泳（Contour-ClampedHomogeneousElectricFields,CHEF）由凝胶的周围沿正方形或正六边形排列的多个电极产生电场，目前多采用24个点电极呈六角形均匀的排列在凝胶周围的方式这些电极都被钳制在预定的电位上，电场与凝胶的各部分以120角相交，DNA分子在电泳中产生聚焦良好的垂直条带，可分离达7,000kb的DNA片段,4）旋转凝胶电泳（RotatingGelElectrophoresis,RGE）采用一个单独的均一电场，只是通过周期性的旋转凝胶而使得电场方向相对改变，从而使DNA分子在周期性改变的电场中泳动，其分离原理与其它的PFGE一样可分离50kb6,000kb的DNA分子,四种常用FIGE的脉冲电场示意图,3-3PFGE的应用,1）菌株基因分型不同菌株的电泳图谱不同（特异性），通过该法得到的染色体组型称电泳核型2）制备染色体物理图谱已由此法构建了180多种细菌的基因组物理图谱3）大质粒的分离和大小测定,传统医学影像（X光、B超、CT）以解剖结构和形态学为基础，可显示一些分子改变的终效应,即器官和组织的形态变化20世纪末，基于临床需要及相关学科技术的飞速发展，出现了一门能够观察到“Before终效应”的组织细胞功能和代谢的变化的医学影像学，即分子影像学,4分子影像（molecularimaging),*是将分子生物学技术和现代医学影像学相结合而产生的一门新兴的边缘学科*是指在活体状态下，通过无创的影像技术，从细胞和分子水平对其生理病理过程进行定性、定量和可视化研究*以MRI、PET、光学成像及小动物成像设备等为主，可用于分子水平成像*也被称为分子成像或分子显像,4分子影像（molecularimaging）,MRI：核磁共振成像PET：正电子发射计算机断层成像技术（positronemissiontomography）,分子成像的4个基本条件,高亲和力的探针探针能够透过生物屏障，如细胞膜，BBB有探针信号放大系统有快速敏感、高分辨率的成像技术,4-1分子影像探针4-2分子影像学技术4-3分子影像的应用,4分子影像（molecularimaging）,4-1分子影像探针,1）定义：是分子影像中最关键的分子，是高特异的、标记有示踪剂（如核素、顺磁性物质或荧光素等）、能参与体内自然的生理生化活动的特殊分子探针将这类特殊分子无创引入体内，当它到达靶组织或器官后便能够与细胞内特定的分子（靶分子）特异性结合，并产生信号,1）分子影像探针,这些特异信号再通过成像系统（如PET、MRI或光学成像技术），可在体外被探测并成像目前已有500多种分子探针，常用的小分子探针有单克隆抗体、受体和酶等,2）分子影像探针的特点,（1）探针分子量小、纯度高、安全，不影响检测对象的原有生理生化反应（2）有良好的生物学功能，参与人体正常的生理生化活动（3）能够克服人体内部的“生理屏障”（如BBB、血管壁、细胞膜等），顺利到达靶分子所在的器官/组织，同时又不积聚于其他组织（4）示踪剂、分子探针和靶分子之间应该呈紧密结合，且有足够长的半衰期以便于体外检测,（1）直接成像（Directimaging）：靶特异探针能够与相应的特异靶标发生特异的相互作用，直接对靶点成像，如用单抗直接对细胞膜表面成分的成像（2）间接成像（Indirectimaging）：除需要一个探针外，还需要一个报告基因（酶等）。相对复杂,3）分子影像的两种基本检测策略,4-2分子影像学技术,1）放射性核素成像2）磁共振成像（MagneticResonanceImaging，MRI）3）光学成像（OpticalImaging）,（1）正电子发射计算机断层成像技术（positronemissiontomography,PET）原理：可直接成像，也可通过报告基因间接成像，能对疾病进行定位、定性、定量及定期分析优缺点：具有“一次检查，全身显像”但PET设备昂贵，且同位素的半衰期较短，不能同时检测多种探针,1）放射性核素成像（RadionuclideImaging）,（2）单光子发射计算机断层扫描技术（singlephotonemissioncomputedtomography，SPECT）原理：通过探测和处理体内的放射性核素自行发射出的光子构成断层图像，可反映器官结构及功能状态，现已用于临床检测优/缺点：可同时区分不同放射能量的核素，能够同时进行多探针成像相对PET来说，SPECT价格便宜，但只能够进行半定量分析,1）放射性核素成像,（1）原理：主要采用间接成像策略，通过标记报告基因、转染靶细胞，并在靶细胞内大量扩增来放大其信号成像。常用的报告基因：酪氨酸激酶、半乳糖苷酶与转铁蛋白受体（2）优缺点：MRI技术的空间分辨率高（达到m级），且能同时获得生理与解剖信息但是，目前的MRI分子成像需要大量的探针，敏感度较低，扫描和后加工时间长，且价格昂贵,2）磁共振成像（MRI）,荧光（fluorescence）：常用报告基因有GFP、RFP和荧光素，后者为目前荧光成像研究热点，因其组织穿透能力较强(可达数cm)，组织的自发荧光最小，影像的信噪比较高生物发光（bioluminescence）：常用报告基因是虫荧光素酶基因和Renilla虫荧光素酶基因，其优点是无自发荧光，所得影像的信噪比高，因此检测的敏感性与特异性均较高，目前被广泛应用于小动物全身成像,3）光学成像技术,GFP：绿色荧光蛋白；RFP：红色荧光蛋白,举例：Bioluminescence-虫荧光素酶基因,通过重组DNA技术，构建含虫荧光素酶基因（fireflyluciferase）的重组分子将之转入骨肉瘤细胞143B，构建稳定表达该酶的人骨肉瘤细胞株-143B-LUC用143B-LUC注入动物皮下成瘤观察前，腹腔注射D-Luciferin，一定时间后通过micro-CT观察,D-Luciferin作为荧光素酶的底物。在ATP和荧光素酶的催化作用下，Luciferin被氧化，产生蓝绿色的光(560nm)，当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关。编码荧光素酶的Luc基因是植物、细菌、哺乳动物细胞的常用报告基因。由于没有背景干扰，因此可以很容易地检测出低至0.02pg水平的荧光素酶。,3）光学成像技术优缺点,&优点：该技术操作简单、无放射性、所得结果直观、灵敏度高，目前已广泛应用于生命科学及医药研究&缺点：光学成像技术的穿透力有限，为数毫米-数厘米，只能用于皮肤浅表成像，因此该技术目前主要用于小动物模型的研究,不同成像方法的相关参数,4-3分子影像的应用,1）分子影像在基础研究的应用（1）基因治疗中靶基因传送和表达成像（2）标记细胞、微生物的成像（3）小动物成像的研究2）分子影像的临床应用临床分子影像刚刚起步，其应用主要集中于肿瘤、心脏和神经系统三大领域,香山科学会议,是由科技部（原国家科委）发起，在科技部和中国科学院的共同支持下于1993年正式创办香山科学会议的宗旨是：创造宽松学术交流环境，弘扬学术民主风气，面向科学前沿，面向未来，促进学科交叉与融合，推进整体综合性研究，启迪创新思维，促进知识创新,香山会议,2002年国内首次以