chip试剂盒17-371说明书翻译.doc

CHIP步骤实验前准备：处理细胞，将细胞保持在装有20ml培养基的150mm培养皿中。冰预冷PBS（第3步）、培养皿（第六步）。每个150mm培养皿准备42ml1*PBS(10*PBS 4.2ml+水37.8ml),冰上预冷。预热SDS到室温，确保在细胞裂解之前彻底溶解。将protease inhibitor cocktail II放置室温待用。A体内交联和溶解1、加550 l 37%的甲醛（或1.15ml新鲜的18.5%甲醛）到20 ml细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。甲醛的终浓度为1%。尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录B）。2、 室温下孵育10 min。不要振荡细胞。3、取2 ml冰冷的1*PBS于分离管中至于冰上（每个培养皿对应一个），每1ml PBS中加5 ul Protease Inhibitor Cocktail II。4、加2 ml 10Glycine到培养皿中将未反应的甲醛消除。5、晃动混匀并在室温下孵育5 min。6、将培养皿放在冰上。7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。8、加20 ml冰冷的1*PBS来洗涤细胞。9、除去PBS，再用PBS洗涤一次。10、加2 ml含1Protease Inhibitor Cocktail II的冷PBS到培养皿中(从第3步得)。11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。12、4，700 g（9001000 rpm）离心25 min沉淀细胞。13、准备好1 ml(1*107个细胞推荐1ml) SDS Lysis Buffer（含5ul Protease Inhibitor Cocktail II）。14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80中保存）。15、用准备好的1 ml SDS Lysis Buffer(含1* Protease Inhibitor Cocktail II）重悬细胞。16.能整除300400ul的微型管。（溶解产物可放在-80储存）17如果超声条件理想直接进行B部分，否则查看附录A。B 超声断裂DNA实验前准备：选择最佳的超声条件来打断交联的DNA，使其长度为2001000 bp（查看附录A）。1、需要的话，从步骤A-16中取5 l细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。2、在冰上超声处理细胞裂解液。（条件摸索）3、4 1000015000 g（12000 rpm）离心10 min除去不溶解的沉淀。4、 有需要的话，可以取出5ul打断的DNA电泳检测超声效果。5、将上清液吸到一个新的离心管中，100ul一份。 每100l包含106个细胞的裂解产物，可以用来做一次免疫沉淀反应。 打断的交联染色质可以在-80中保存2个月。C、Immunoprecipitation (IP) of Crosslinked Protein/DNA实验前准备：取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温融化（步骤3用）。1、准备足够的Dilution Buffer（含protease inhibitors），放在冰上。 每个IP实验需要900ul Dilution Buffer和405 ul Protease Inhibitor Cocktail II。 测试样品包括：阳性对照Anti-RNA Polymerase II，阴性对照Normal Mouse IgG，和自己实验用的抗体。建议增加一个与自己所用抗体同源的阴性对照IgG。 2、准备一个微型离心管包含100ul打断的交联好的染色质(B-5)放在冰上。 若用同一样品进行多个免疫沉淀反应，可将1.1 ml样品放在一管中进行实验。 每100ul包含1*106细胞来做免疫沉淀。3、 加900ulDilution Buffer（含Protease Inhibitor Cocktail II）到100ul染色质样品中。4、 每一个IP加60ul Protiein G Agarose。 Protiein G Agarose 是一个50%混悬液，吸取前轻轻的颠倒混匀。5、4旋转孵育1 h。6、 瞬离颗粒琼脂糖30005000g 1min。 不要高速离心7、取出10ul（1%）上清液作为“Input”并放在4直到步骤D-1。8、收集剩余的上清液，分装到1ml的微型管中，倒掉颗粒。9、加入免疫沉淀抗体 阳性对照anti-RNA Polymerase，加1.0 g抗体每管。 阴性对照Normal mouse IgG，1.0 g抗体每管。 用户使用的抗体和对照，每管加110 g抗体每管（根据抗体效价进行调整）。 10、4旋转孵育过夜。11、 每个IP加60ul protein G Agarose4度颠转一小时。12、 将Protein A magnetic beads瞬离（30005000g,1min）沉淀下来并除去上清。13、用1 ml下列冷的缓冲液洗脱Protein A bead-antibody/chromatin complex，每次在旋转台上孵育35 min，瞬离（30005000g,1min）并小心的除去上清。a、Low Salt Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-154), one wash b、High Salt Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-155), one wash c、LiCl Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-156), one washd、TE Buffer (Cat.# 20-157), two washD、洗脱Protein/DNA复合物实验前准备：1M NaHCO3放至室温，打开水浴锅温度调至65。（E部分用）1、为所有的IP管和Input管准备最终的的洗脱液。 每管用的洗脱液200ul(10ul 20% SDS,20 ul 1M NaHCO3, 170ul 无菌水，蒸馏水）。2、 准备一个大的收集管，比如，是个收集管混合一起是105ul 20%SDS,210ul 1MNaHCO3,1.785ml 无菌水，蒸馏水。3、 Input收集管（C-7）中加入200ul elution buffer 放至室温直到E部分。4、 往所有的收集管中加入100ul lution buffer，包括antibody/agarose 复合物。轻轻混匀。5、 室温孵育15min.6、 瞬离（30005000g,1 min）收集琼脂糖,将上清液吸至一个新的收集管中。7、 重复4-6步，将洗脱液收集起（总共约200ul）。E、反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。1、所有收集管包活IP和input加入8ul 5M NaCl,65度孵育45小时或过夜。解交联DNA与蛋白复合物，这一步的样品可放于负20度第二天再用。2、所有的收集管加入1ul RNase 37度孵育30min.3、每个收集管中加入4ul 0.5M EDTA,8ul 1M Tris-Hcl, 1ul Protocol K，42度孵育1-2小时。F、DNA Purification Using Spin Columns1、取出Spin Filter到Collection Tube中。从E一个样本对应一个分离管。2、加1 ml Bind Reagent “A”到每个200 l的DNA样品管中（包括ip和input）并混匀。 5倍体积的Bind Reagent “A”用于1倍体积的样品，可能有沉淀，但不影响。3、将600 ul sample/Bind Reagent “A”混合液转移到Spin Filter收集管中。4、1000015000 g（12000 rpm）离心30 s。5、 从离心管中移除Spin Filter保留将Collection Tube，并将离心液除去。 如果第2部形成的沉淀物能够在底部看到，但不影响实验。6、 将Spin Filter放回Collection Tube。7、 将剩余的600 ul sample/Bind Reagent “A”(从第二步来) 吸到Spin Filter中并重复4-6。8、 加500 ul Wash Reagent “B”,到收集管的Spin Filter。9、1000015000 g（12000 rpm）离心30 s。10、从离心管中移除Spin Filter保留将Collection Tube，并将离心液除去。11、把空的Spin Filter放回 same Collection Tube中。12、1000015000 g（12000 rpm）离心30 s。