（生物化学与分子生物学专业论文）酵母菌发酵法生产谷胱甘肽的研究.pdf

j 酵母菌发酵法生产谷胱甘肽的研究 生物化学与分子生物学专业 研究生雷树华指导教师张尔亮 摘要 本文对从自然环境分离到的产谷胱甘肽野生酵母菌采用物理和化学方法进 行了多次连续诱变和筛选，并对其各种发酵条件进行了详细研究。 首先从瓜果表皮、溪流中的水和植物的花朵中采集了若干份样品，分离到 了1 8 株酵母菌，另有两株为本实验室保存的酵母菌，对这2 0 株酵母菌的谷胱 甘肽含量进行了测定。实验结果表明，野生酵母菌的谷胱甘肽产量均较低，只 有细胞干重的0 5 鹚一1 0 左右，达不到大规模生产的要求，须进行人工育种以 提高产量。在2 0 株菌株中l 5 、l i p 、l 1 3 、l 1 4 的胞内谷胱甘肽积累相对较高， 因此，将这4 株酵母菌株作为出发菌株进行诱变。 对分离筛选出的4 株出发菌株首先用紫外线进行多次连续诱变，由实验结 果发现，以l 5 为出发菌株经过3 次诱变后，获得的变异菌株l 5 1 的谷胱甘肽产 量比l 5 提高了3 8 1 0 ，提高幅度较大，其它3 株出发菌株筛选出的变异株的 谷胱甘肽产量提高幅度均不大。l 5 1 再采用亚硝酸多次连续诱变后，得到变异 株l 5 2 ，谷胱甘肽产量达到1 2 4 5 4 m g l ，比l 5 l 提高了5 3 ，最后采用亚硝基 胍对l 5 2 进行诱变，得到了谷胱甘肽产量比l 5 2 提高了3 1 变异菌株l 5 3 。 最后对筛选到的谷胱甘肽产量最高变异菌株l 5 3 进行实验室摇瓶发酵培养 基和发酵环境条件的优化。优化的培养基组分包括碳源、有机氮源、无机氮源、 磷酸二氢钾以及硫酸镁。首先确定出了最佳发酵碳源、有机氮源、无机氮源分 别是葡萄糖、酵母粉和硫酸铵，并对这三个影响谷胱甘肽产量的主要因子做了 三因素三水平的正交实验，得出了这三者的最佳浓度组合，最后分别单独考察 了磷酸二氢钾以及硫酸镁两种无机盐对谷胱甘肽发酵的影响。经过对培养基优 化后，谷胱甘肽的发酵产量达到1 4 4 4 1 m g l ，比采用初始发酵培养基发酵提高 了1 2 。4 7 。其次研究了发酵环境影响因子包括p h 值、装液量、接种量、温度 等对酵母菌谷胱甘肽产量的影响。经过对发酵环境条件优化后，谷胱甘肽的产 量达到1 5 0 3 9 m g l ，比未优化前提高了4 1 4 。另外，还对合成谷胱甘肽的前 体氨基酸( 包括谷氨酸，半胱氨酸，甘氨酸) 以及一些重要氨基酸( 精氨酸、 丝氨酸) 对发酵的影响作用进行了研究。 关键字：酵母菌；谷胱甘肽；诱变；发酵条件优化 s t u d yo np r o d u c i n gg l u l 讼t h i o n e b yf e r m e n 瞍汀i o no fy e a s t a b s t r a c t s o m es t r a i n so fy e a s to b t a i n e df r o mt h en a t u r a le n v i r o n m e n tw e r e m u t a g e n i z e d b yp h y s i c s ta n dc h e m i c a lm e t h o df o ri m p r o v i n gt h eg l u t a t h i o n e ( g s h ) y i e l d ，t h e n t h eo p t i m i z a t i o no ft h em u t a n ts t a i n ss h a k i n g f l a s kc u l t u r ec o n d i t i o nw e r es t u d i e d 。 f i r s to fa l l ，t h e g l u t a t h i o n e ( g s h ) y i e l do f2 0y e a s ts t r a i n so b t a i n e df r o mt h e n a t u r a le n v i r o n m e n tw e r et e s t e d f o u rs t r a i n sw i t hh i g h e rg l u t h i o n ey i e l dw e r e c h o s e df o ra d v a n c e ds t u d y ： t h ef o u rs t r a i n sc h o s e dw e r em u t a g e n i z e db yu l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o n ，am u t a n t s t a i nn a m e dl 51w a so b t a i n e dw i t hg l u t a t h i o n ey i e l dg r o w i n gu pb y3 8 1 0 t h e n l 51w a sc o n t i n u a l l ym u t a g e n i z e db yn i t r o u sa c i da n dm n n g a tt h ee n d am u t a n t s t a i nn a m e dl 5 3 w a so b t a i n e d ，i t sg l u t a t h i o n ey i e l dr e a c h e d1 2 8 4 0 m g lb ys h a k i n g 丑a s kc u l t u r e ，w h i c hw a s4 6 5 h i g h e rt h a ni t s p a r e n ts t a i n s t h ee f f e c t so fm e d i u mc o m p o s i t i o na n dc u l t u r ec o n d i t i o n so nt h eg l u t a t h i o n e y i e l dw e r ei n v e s t i g a t e di ns h a k i n g f l a s kc u l t u r e g l u c o s ea n dy e a s te x t r a c t ，( n n 4 ) 2 s 0 4 w e r ef o u n dt ob et h em o s ts i t a b l ec a r b o ns o u r c ea n do r g a n i c 、i n o r g a n i cn i t r o g e n s o u r c er e s p e c t i v e l yf o rt h ef e r m e n t a t i o n t h e na n o r t h o g o n a lm a t r i xm e t h o dw a s d e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fg l u c o s e ，y e a s te x t r a c ta n d ( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 t h ee f f e c t o fk h 2 p 0 4a n dm g s 0 4w e r ea l s os t u d i e dr e s p e c t i v e l y t h ec u l t u r ec o n d i t i o n ，i n c l u d e w o r k i n gv o l u m e ，i n o c u l u n ms i z e ，p hv a l u e ，t e m p a r i t u r e ，w h i c hc a n e f f e c tt h e g l u t a t h i o n ey i e l dg r e a t l y ，w e r eo p t i m i z e d a tt h ee n d ，t h ee f f e c t so fa d d i t i n gt h et h r e e c o n s t i t u e n ta m i n oa c i d sa n da r g i n i n e ，s e r i n et ot h em e d i u mo ng l u t a t h i o n ey i e l d w e r es t u d i e d k e yw o r d s ：y e a s t ； g l u t a t h i o n e ( g s h ) ；m u t a g e n i z e ；o p t i m i z e 四川师范大学学位论文独创性及使用授权声明 y 9 2 8 3 6 5 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师韭签杰垫握指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 己获学位的研究生必须按学校规定提交印刷 版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索；2 ) 为教学r 和科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文 作为资料在图书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。 论文作者签名 华日 吖寸 l 秘 智户 ： 年 文献综述 谷胱甘肽( l - g l u t a t h i o n e ，简称g s h ) ，是一种具有重要生理功能的活性三 肽，化学名称为：y - l 一谷氨酰一l 一半胱氨酰一甘氨酸，由两分子a t p 提供能量，谷 氨酸，半胱氨酸和甘氨酸在y l 一谷氨酰一l 一半胱氨酸合成酶( g s h i ，e c 6 3 2 2 ) 和谷胱甘肽合成酶( g s hi i ，e c 6 3 2 3 ) 这两个酶的催化下而合成。早在十九世纪 八十年代人们就从酵母菌中分离出来了g s h ，随后又陆续从动物肝脏、肌肉中分 离出了谷胱甘肽。进入二十世纪后，谷胱甘肽化学结构得到了证明，并被人们 用化学方法成功地进行了合成，利用酵母提取谷胱甘肽的方法于1 9 3 8 年获得了 专利。 1 1 谷胱甘肽的理化性质 j 谷胱甘肽的分子量为3 0 7 3 3 ，熔点1 8 9 一1 9 3 ( 分解) ， q 。2 0 为 + 1 7 6 0 。( c = o 0 5 ，h 。0 ) ，晶体呈无色透明细长柱状或板状，等电点为5 9 3 。它溶 于水、醇、二甲基甲酞胺和液氨，不溶于醚和丙酮。固体谷胱甘肽较稳定，其 水溶液暴露在空气中易氧化，谷胱甘肽不宜在高水分活性下保存，要长期稳定 保存谷胱甘肽应将水分活性控制在0 3 以下瞳1 。谷胱甘肽分子中有一个特殊的y 一肽键，即有谷氨酸的y - 羧基和半胱氨酸的q 一氨基缩合而成，其半胱氨酸残基 中连有一个氧化还原电位较低的活泼巯基，这是谷胱甘肽具有重要生理功能的 基础。在谷胱甘肽氧化酶的作用下，两分子谷胱甘肽的疏基缩合为二硫键，形 成没有生理活性的氧化型谷胱甘肽( g s s h ) ，在各种生物体的细胞中，氧化型谷 胱甘肽需经谷胱甘肽还原酶还原后才能发挥其重要的生理功能。谷胱甘肽广泛 存在于各种生物体中，其中以动物的肝脏、酵母菌和小麦的胚含量最为丰富， 含量高1 0 0 1 0 0 0 m g l o o g 口3 。动物的心脏、肾脏、血液和眼睛晶状中也含有较 多的谷胱甘肽，人体的全血中谷胱甘肽的正常浓度约为3 7 1m g l 。一些农作物 如蔬菜、薯类和谷物中也含有g s h ，但含量则较低。 1 2 谷胱甘肽的生理功能 g s h 分子中含有活泼的巯基和特殊的v 一酰氨键，这是它具有多种生理功能 的基础。在各种生物机体细胞中，谷胱甘肽直接或间接参与蛋白质和d n a 的合成、 氨基酸的运输、稳定酶的活性、促进新陈代谢及清除自由基保护细胞等。具体 表现为： ( 1 ) 清除自由基和保护细胞 机体的各种代谢过程都会产生一定量的自由基，自由基的量在一定范围内不 会对机体产生危害，但当机体内积累过多自由基时，会损伤生物膜、侵袭生命 大分子、加快机体衰老、诱发肿瘤或动脉硬化的产生。g s h 可通过两条途径起清 除自由基的作用。首先，g s h 的巯基可以与高活性的自由基直接结合，起到淬灭 自由基的作用；而另一条途径是经过酶的催化，起清除自由基的作用。氧自由 基，尤其是高活泼度的o h ，可致使脂质过氧化和某些酶失活。当自由基对细 胞进行攻击时，可引起自由基链式反应，导致细胞和组织的损伤。在谷胱甘肽 过氧化物酶的催化下，谷胱甘肽和过氧化物之间发生氧化还原反应，阻断了自 由基链式反应，起到了清除自由基，保护细胞的作用h 1 。谷胱甘肽能够减轻紫 外线对细胞的辐射危害，机理比较复杂，其中就包括了对产生的自由基的清除。 d n a 是紫外线辐射损伤的目标之一，d n a 受到紫外线辐射后，会产生d n a 自由基， 如果缺乏相应的防护机制，会引发d n a 链式反应。然而大部分辐射诱导产生的d n a 都可被谷胱甘肽还原而恢复d n a 的结构。但是，如果高浓度的氧存在的话，氧可 以矛d d n a 自由基反应，致使d n a 损伤无法修复蹄3 。 ( 2 ) 还原和解毒功能 谷胱甘肽分为氧化型和还原型两种，我们通常所说的都是指还原型。在细 7 胞内存在谷胱甘肽还原酶起到还原型和氧化型的相互转换作用，但是在正常的 细胞中还原型谷胱甘肽的含量远大于氧化型，大多数细胞中还原型谷胱甘肽和 氧化型谷胱甘肽之比大于5 0 0 。由于谷胱甘肽分子中含有氧化还原电位较低的巯 基，因此可以起到保持细胞内各种含巯基蛋白质和酶的活性和稳定性，不至于 被氧化失活。对于活性中心含有巯基的各种蛋白质和酶，巯基的变化对酶的活 性起决定性作用，这就更显得谷胱甘肽还原作用的重要性了。谷胱甘肽在细胞 内的氧化还原体系中有着关键作用，可以把脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸( 维 生素c ) ，还起保持维生素e ，8 一胡萝卜素还原状态的作用。另外，谷胱甘肽还 参与了d n a 和r n a 及一系列硫醇和二硫化物之间的氧化还原反应，7 。 g s h 能与进入机体的有毒化合物、重金属离子等直接结合，并促其排出体外， 起到中和解毒的作用。许多化学致癌物质在机体内转化形成的终致癌物都是活 性亲电试剂，具有很强的亲核攻击能力。另外，多数外源物质在体内经过细胞 色素p 一4 5 0 氧化酶的氧化后形成的中间代谓| 产物也是高活性的亲电试剂。如果这 些高活性的亲电试剂攻击d n a ，将会导致细胞突变和致癌等严重后果。在体内， 谷胱甘肽在谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 的催化下，与亲电试剂反应，并在一系列 酶的催化下，最后生成硫醇尿酸并排除体外阳1 。 ( 3 ) 氨基酸转运功能 参与氨基酸的跨膜转运是谷胱甘肽的重要功能之一，谷胱甘肽通过y 一谷氨 酰循环完成其氨基酸转运功能，并和其自身的分解与合成联系起来的。在细胞 外，谷胱甘肽和胱氨酸在v 一谷氨酰基转肽酶的催化下形成y 一谷氨酰胱氨酸和 半胱氨酰甘氨酸，y 一谷氨酰胱氨酸可跨膜进入细胞。在胞外高浓度谷胱甘肽的 情况下，这一跨膜转运被抑制。进入细胞后，y 一谷氨酰胱氨酸可被分解为y 一 谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸，而这两者恰好可作为合成谷胱甘肽的原料。在胞 内谷胱甘肽分解后也会形成半胱氨酰甘氨酸，在半胱氨酰甘氨酸双肽酶的作用 下可被分解为半胱氨酸和甘氨酸而重复回收利用。另外，v 一谷氨酰基转肽酶可 _ 一 以催化谷胱甘肽的y 一谷氨酰基转移到多种氨基酸上，姓丽起到转运多种氨基酸 的作用鲫。 ( 4 ) 参与细胞的各种代谢功能 、 除了上面所述功能外，谷胱甘肽在细胞内还参与各种代谢活动。c s n 黝n 强转甲基和转丙基反应，维持肝细胞正常功能。促进a t p 和凝血因子的合成， 并能促进氨基酸及脂肪代谢。参与胆红素代谢。g s h 可以在谷胱甘肽一硫一转 移酶的作用下，将未结合胆红素载入微粒体，使其与葡萄糖醛酸结合成结合型 胆红素排出体外。参与体内三羧酸循环及糖代谢随，1 0 1 。 1 3 谷胱甘肽的测定方法 1 3 1 碘量法1 该法可用于定量快速测定样品中谷胱甘肽的含量，但不够精确，一般只用 于定性，现在较少采用这种方法。其步骤如下：( 1 ) 配u o l o o m g l o o m l 的谷胱 甘肽标准溶液，取5 m l 谷胱甘肽标准溶液，置于2 5 0 m l 锥形瓶中，加入5 m l 2 偏磷 酸，l m l 5 碘酸钾溶液和2 滴淀粉指示剂，用o , p 0 1 m o l l 碘酸钾溶液滴定至无色 变蓝色为止，并作空白对照。以谷胱甘肽浓度( m g l o o m l ) 为横坐标，0 0 0 1 m o l l 碘酸钾溶液滴定值( m l ) 为纵坐标，得标准曲线。( 2 ) 样品中谷胱甘肽的含量测定 取5 m l 待测样品，按照约的测定方法进行谷胱甘肽含量的测定。对照标准曲线， 得到样品中谷胱甘肽准确含量。 1 3 2 紫外分光光度法( a l l o x a n 试剂衍生化法) n 2 1 该方法需使用紫外分光光度计来进行测定，其测定谷胱甘肽的原理为：还原 型谷胱甘肽上的一s h 在实验条件下与a l l o x a n 试剂( 四氧嘧啶) 作用，反应生产的 物质在紫外区3 0 5 n m 处有最高吸收峰，且与谷胱甘肽浓度存在线性关系，因而可 以用紫外分光光度法测定谷胱甘肽的含量。半胱氨酸上的一s h 基也可能a l l o x a n 试剂产生作用，但吸收峰出现在2 7 5 n m ，吸收峰的位置与谷胱甘肽衍生物的位置 。s - i _- 不同，可以被明显区别，并不干扰测定。本法所需试剂为髋x a n 试剂( 0 2 4 m o l l ) 。磷酸缓冲液( o 2 4 m 0 1 l ，p h = 7 6 ) 及甘氨酸溶液( 0 1 m o l l ) 。具体操作 为：用a l l o x a n 试剂( 0 2 4 m o l l ) 在上述磷酸缓冲液及甘氨酸存在下与谷胱甘肽 口， 样品反应2 0 分钟使谷胱甘肽衍生化，此时在3 0 5 n m 波长处有吸收峰，同时进行空 白校正，用此法可对谷胱甘肽进行精确的定量分析。 1 3 3 可见分光光度法( d t n b 法) t h o m a sg n 3 1 在测量人体血小板中的6 s h 时，用5 ，5 一二硫双一( 2 一硝基苯甲 酸) ( d t n b ) 作络合剂，吸收峰在4 1 2 n m ，线性范围为0 3 - 3 0 9 1 ，重现性为9 7 8 。 赵旭东等n 盯根据甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应速度的不同，提出了在 含有其它巯基物质溶液中测定谷胱甘肽含量的方法，通过控制两个相同样品和 甲醛的不同反应时间，测定两者在波长为4 1 2 n m 时的吸光度，根据两者不同的吸 光度值得出谷胱甘肽的含量。该法线性范围为o 1 9 0 9 5 9 ( 回收率为9 7 7 ) ，误 差小于0 5 。 1 3 4 高效液相色谱法 程敬君等n 钉采用k c l 溶液一h c l 溶液一甲醇一e d t a 为流动相，由化学检测器( 工 作电极为铂碳电极：参比电极为a g c l ，工作电压为0 9 v ) 测定鼠脑微透析液中谷 胱甘肽的含量，检测限为l o n m o l l ，回收率为8 7 3 ，r s d 为1 8 。b r e n t 等n 6 3 用甲醇和乙酸钠溶液( p h 7 0 ) 作为流动相，对苯二醛( o p a ) 和谷胱甘肽络合生成 一种高荧光的三元环衍生物，用荧光检测器检测，检测限为0 1 p m o l ，线性范围 0 卜2 0 0 p m o l ，谷胱甘肽的回收率为9 9 2 ，r s d 为1 2 ，此方法线性范围宽，并 且稳定性较高，较适于测定混合组分中谷胱甘肽含量。a s e n s i 等n 7 1 采用甲醇水 为流动相，采用紫外可见检测器检测大豆中谷胱甘肽的含量，检测限为 l n m o l l ，r s d 为1 5 。 1 ，3 5 荧光法 v i c t o rh 等n 8 1 以邻苯二甲醛( o p t ) 为络合剂，在p h 9 o 条件下检测样品中谷 胱甘肽含量，线性范围为0 0 6 5 - 3 2 5 n m o l m l 。h i s s i n 等n 鲫以o p t 为络合剂，采 用偏磷酸一磷酸钠一e d t a 缓冲溶液( p h 8 0 ) ，用以测定哺乳动物心脏和肝脏中谷 胱甘肽的含量，谷胱甘肽的检测限为0 0 5 比m o l ，线性范围为0 0 5 - 0 8 m o l ，r s d 为4 。曹新志等乜们采用o p t 作为络合剂，在磷酸缓冲液( p h 8 0 ) 中，应用荧光分 光光度计来测定黄瓜中谷胱甘肽的含量。检测限为0 1 j z g m l ，线性范围为 0 卜4 0 【g m l ，回收率为9 9 7 3 ，r s d 为1 2 4 。 1 4 酵母细胞中谷胱甘肽的抽提及纯化方法 由于谷胱甘肽是胞内产物，发酵结束后需将菌体经适当处理后的得到含谷 ? 胱甘肽的粗制抽提液，经过进一步的分离提纯可得高纯度的谷胱甘肽制品。从酵 母细胞中提取谷胱甘肽是工业化生产的下游工序的重要步骤，提取过程中最大 障碍是细胞壁，可利用一些无机或有机化学试剂溶解酵母细胞壁和膜上的表面 结构或者改变细胞膜的通达性i 使酵母细胞内物质外流，也可用一些物理方法， 如加热，冷冻或微波辐射等使细胞破碎。 1 4 1 抽提方法 现在相关文献报道的谷胱甘肽抽提方法主要有以下几种，每种方法的具体 操作如下乜u ： ( 1 ) 热水抽提：取l o g 干酵母，与2 4 0 m 蒸馏水充分混合后倒入4 0 0 m l 沸腾的水中， 再用8 0 m l 水洗涤烧杯后一并倒入。将混合液保持在9 5 0 一1 0 0 ，抽提5 m i n ，放 置冰水中速冷，在1 0 0 0 0 r m i n 下离心，取上清液。 ( 2 ) 甲酸抽提：取2 0 9 干酵母与1 8 0 m l 甲酸混合，室温下搅拌抽提3 0 m i n ，离心后取 4 上清液。 ( 3 ) 乙醇抽提：取1 0 9 干酵母，与9 0 m l 浓度为4 0 的乙醇溶液相混合，室温下搅拌 。 抽提2 h ，离心后取上清液。 ( 4 ) 硫酸抽提：取1 0 9 干酵母，与9 0 m l 浓度为2 的硫酸相混合，6 0 。c 下搅拌抽提l h ， 放置冰水中速冷，离心后取上清液。 ( 5 ) 三氯乙酸抽提：取1 0 9 干酵母，与9 0 m l 浓度为1 0 的三氯乙酸溶液相混合，室 温下搅拌抽提1 0 r a i n ，离心后取上清液。 ( 6 ) 有机酸混合抽提：取1 0 9 于酵母，与9 0 m l 甲酸和乙醇( 2 ：1 ，v v ) ，甲酸和丙酮 ( 2 ：l ，v v ) 、甲酸和乙酸( 4 8 ：4 2 7 - v v ) 相混合，室温下抽提1 0 m i n ，离心后取上 清液。 ( 7 ) 低温抽提：取2 0 9 干酵母，与1 0 0 m l 水相混合后置于- 2 0 。c 冷冻待凝固后用研钵 磨成粉末状，收集在锥形瓶中，加入8 0 m l 浓度为3 6 的乙酸，搅拌2 0 m i n ，离心后 ， ： 取上清液。 - ( 8 ) 温差破碎法抽提：取1 0 m l 酵母发酵液，离心，重复洗两次，菌体放入冰箱 2 0 冷冻过夜。冷冻后取出菌体，沸水浴1 0 m i n ，离心取上清液。 1 4 2 分离纯化方法 到目前为止报道的分离提纯谷胱甘肽的方法主要有以下几种： 铜盐法。其工艺为：高产酵母一热水抽提一离心一调p h 、树脂吸附一酸洗脱 一新鲜的c u ：o 沉淀一离心沉淀物一h 。s 置换一离心过滤一浓缩一脱色一喷雾干燥 一成品。此法为传统法，有实用价值，但污染较大乜引。 离子交换法。还原型谷胱甘肽的等电点为5 9 3 ，当其溶液的p h 调整到小于5 9 3 时，可利用还原型谷胱甘肽带正电荷可与7 3 2 f n 离子树脂进行交换作用的原理， 选用合理的提取工艺和条件，将还原型谷胱甘肽分离纯化。此法经济效益较高， 可望完全代替铜盐法瞳引。 另外还可用合成树脂的方法来进行有机汞亲和层折。巯基化合物具有很强的 与汞化学亲和作用，因此，用含汞树脂提取含巯基化合物能取得良好的效果。 以往含汞树脂的合成均以有机烯酸类为前体，或将有机汞化合物接到琼脂糖等 含有羟基的其它载体上，这些含汞树脂对酸碱敏感，稳定性差，在应用上受到限 制，又因在洗脱时采用半胱氨酸或巯基乙醇，使产品的纯度受到影则。以聚苯乙 烯、二乙烯苯为载体，将有机汞接入，得到的含汞树脂能消除以上缺点，取得良 好的效果乜4 。 1 5 谷胱甘肽的生产方法研究概况 1 5 1 萃取法瞳5 ，2 t 2 7 1 萃取法是早期获取谷胱甘肽的主要方法，是以富含谷胱甘肽的动植物组织 或酵母为原料，通过添加适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶处理，再分离精制 而成。小麦胚芽是一种谷胱甘肽含量很高的植物组织，早在上本世纪四十年代， 人们就通过沉淀蛋白质后从麦胚中提取粗制谷胱甘肽，随着技术的进步，萃取 法提取谷胱甘肽的工艺不断得到改进，蛋白酶和淀粉酶、高效膜分离技术等被 应用于提取工艺，使得谷胱甘肽的收率不断得到提高。小麦胚芽制取谷胱甘肽 的一般工艺为：麦胚+ 萃取剂一搅拌萃取一分离一上清液+ 蛋白质沉淀剂一分离 一上清液一离子交换树脂纯化( 或膜分离) 一浓缩一结晶。用萃取法制取谷胱 甘肽所使用的提取液可阻是水、有机溶剂和稀醇等。制得的谷胱甘肽，其含量 可达9 9 ，总收率3 3 一4 0 。但采用此方法制取谷胱甘肽存在收率低，产品受有 机溶剂污染，产生的废水污染环境，成本高，浪费粮食等缺点，难以应用于大 规模工业化生产。 1 5 2 化学合成法1 自还原型谷胱甘肽被发现和阐明化学结构以后，从2 0 世纪7 0 年代，就有学者 致力于化学合成法生产谷胱甘肽的工艺研究，并且有发展了多种方法。一般使 用的原料是谷胱甘肽的三种前体氨基酸：谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸，技术路 线如下图所示： 字h 广h o o o h罕嗲o o r l掣严譬拜c o k 鞫o h 2 e r l 矗h ，+ 占喙占h 暑心( r 。先保护基黼 蟪h 2 n 喙 s h n 心 t r 滞谦矿娶 半胱氨酸 甘氨酸 r 攀h c h 2 c o o r i 一旷峪蝴： 螂册乳+ 一r _ 再蹴 一释制一赋翠一芍一0 。h 誓。0 h 一晶k 邮r 洲 目前谷胱甘肽的化学合成工艺较成熟，但存在诸多缺点，如成本过高，反应步 骤多，反应时间长，操作复杂等：合成的产物是消旋体，光学拆分十分困难，很 难保证产品纯度，生物效价也就难以保持一致：而且产生的废水会污染环境。 1 5 3 酶法( 固定化细胞法) 酶法主要是利用细胞内的天然谷胱甘肽合成酶系来合成谷胱甘肽，此法有 三个必要条件：酶的底物( l 一谷氨酸，l 一半胱氨酸及甘氨酸) ，能量( 三磷 酸腺苷，a t p ) 或者是a t p 再生系统，谷胱甘肽合成酶系( y 一谷氨酰半肤氨酸合 成酶和谷胱甘肽合成酶) 。谷胱甘肽合成酶系大多取自酵母和大肠杆菌等；前体 氨基酸以能现在大规模生产，价格较低，可直接添加；a t p 价格昂贵，直接添加 由于合成谷胱甘肽会使产品成本过高，因而一般考虑采用微生物的a t p 再生系 统，常用的有：大肠杆菌中的乙酸激酶反应系统与g s h 生物合成酶系构建了一 个a t p 再生系统。由乙酰磷酸盐提供高能磷酸基，用乙酸激酶再生g s h 生物合成 酶系产生的a d p 为a t p 。其优点是a t p 的输送方便，但由于乙酰磷酸盐价格昂贵且 不稳定，因此这一系统并不实用。酵母糖酵解途径用作a t p 的合成系统。这一 系统只需添加价格便宜的葡萄糖即可获得所需的a t p ，是理想的a t p 再生系统。 酶法一般不直接制取酶液来合成谷胱甘肽，而是采用固定化细胞( 酶) 生产 谷胱甘肽。若采用固定化酶的方式，由于酶活性中心的重要氨基酸与水不溶性 载体相结合后，酶的结构发生了变化，酶与底物的相互作用受到空间位阻的影 响而使其活力大大降低，同时，固定化酶的制作比较复杂，这些缺点在一定程 度上限制了固定化酶法的应用。通常采用把含有谷胱甘肽合成酶系的微生物细 胞固定，实现细胞的连续反复利用，这种方法具有生产过程简化、便于自动控 制、稳定性和生产效率高以及可解除反馈抑制等优点。 k u m a g a ih e 2 9 利用干面包酵母作a t p 再生体系和从p r o t e u sm i r a b i j i s 中纯化 得到的谷胱甘肽合成酶系耦合，谷胱甘肽产量达n 8 2 9 l ，以半胱氨酸为基准的 转化率为4 5 。此外，k u m a g a ih 和s u z u k ih 等们以s b c g m ( s 一苯甲基一半胱氨酰甘 氨酸甲酯) 作为受体，l 一谷氨酸作为y 一谷氨酰基的供体，在谷胱甘肽合成酶的催 化，生成s 一苯甲基谷胱甘肽，经氢解可除去s 一苯甲基，得到谷胱甘肽。此法不需 a t p ，且s b c m 较容易获得，是种较好的方法。m i w a 阳u 将sc e r e v i s i a e 的谷胱甘 肽合成酶系固定后，j j h a , ) , s t r e p t o c o c c u sf e a c a l i sr 中提取的氨甲酰磷酸激酶固 定化颗粒，再加入k o c n 和k h 。p o , ，谷胱甘肽是不含氨甲酰磷酸激酶k o c n 和k h ：p 0 4 时 的2 3 倍。b a u e rw 跚1 曾经比较了& c e r e t i s i a e 的传统发酵培养方式和在气一固 流化床反应器中的固定化培养方式。 在国内，李华钟等口踟用有机溶剂处理重组大肠杆菌和面包酵母细胞，提高其 通透性，不进行固定化操作而直接将两种菌体混合，利用混合悬浮培养的方法， 构建了一个a t p 再生系统。赵旭东等3 4 将酵母细胞固定化，利用酵母细胞自身的 g s h 合成酶和糖酵解途径产生的a t p 合成g s h ，结果谷胱甘肽合成能力可达 9 1 9 l ，为使用含g s h 合成酶基因的重组酵母细胞生产g s h 提供了借鉴作用。 1 5 4 微生物发酵法 目前用于大规模发酵生产谷胱甘肽的方法一般都是微生物发酵法。大规模发 酵用的微生物菌种主要是酵母菌，改良基因工程大肠杆菌的谷胱甘肽产量一般 都比采用酵母菌的高，但其技术难度较大，相对还不够成熟，采用得不多，但 其发展前景广阔。采用微生物法发酵生产谷胱甘肽，要提高产物产量有两条重 要的途径：一是采用高产菌种，可以是诱变后筛选的高产酵母菌，或者是改良 的基因工程菌；二是优化发酵工艺，给菌种提供最好的生长条件，促进产物的 积累，提高菌体的密度。 1 5 4 1 微生物细胞内谷胱甘肽的代谢途径 谷胱甘肽虽然由氨基酸组成，是一种小肽，但其在细胞内的合成却有别于 一般的小肽的核糖体合成途径。它是由谷氨酰半胱氨酸合成酶( g s h - i ) 和谷 胱甘肽合成酶分两步顺序催化三种前体氨基酸合成的，每一步需要消耗一个 a t p ，如图1 2 所示，其中谷氨酰半胱氨酸合成酶是限速酶，受至o c s h 的反馈抑制。 g s h 形成后有三个去向：一是变成氧化型谷胱甘肽，二是与代谢中间产物或自由 基直接结合，三是分解为氨基酸。 l - 谷氯鼗十l 一毕肮氮艘a t p 百蘸- - - ；_ r a d p 和y 一各氯醺半貔氨教 “ 卜谷蛰酰肇腕氮鳆+ 甘氯酸一a 忑t 9 葛- , - _ 孓j i a r d p 咎戮芦赫 图1 2 谷胱甘肽的生物合成途径 1 5 4 2 用于谷胱甘肽发酵菌种的改良 提高谷胱甘肽产量的一种方法是g s h 高产酵母菌株的筛选。现在进行大规 模发酵生产谷胱甘肽采用的菌种一般都是经过诱变后筛选的高产酵母菌。由于 在正常的微生物细胞中的g s h 含量都比较低，采用常规的微生物诱变育种方法 就成为提高g s h 产量的首选策略之一。一般采用的物理诱变方法有紫外线、x 射线和y 射线，采用的化学诱变试剂有亚硝基胍、甲基磺酸乙酯等，诱变后的 酵母菌再经过药物抗性的筛选而得到变异的高产菌株，通常采用的抗性筛选药 物有亚硫酸盐、乙硫氨酸、氯化锌等。从理论上来说只要筛选到涉及到g s h 合 成或分解途径中关键酶产生正变异的菌株，就有可能得到比出发菌株产量更高 的菌株。前面已经提到y 一谷氨酰半胱氨酸合成酶是g s h 合成途径中的限速酶， 受到g s h 的反馈抑制，只要能获得y 一谷氨酰半胱氨酸合成酶不受g s h 反馈抑制 菌株就可大大提高细胞内g s h 的积累。另外能筛选到g s h 分解酶酶活受到抑制 的菌株也可提高g s h 的产量。 施碧红等5 1 筛选到一株g s h 积累达到1 4 的啤酒酵母突变株m - 0 5 ，经优化 摇瓶发酵条件后，g s h 提高到细胞干重的3 2 9 。童义群等口6 1 将一株啤酒酵母先 后经紫外线、亚硝基胍诱变，以乙硫氨酸和l ，2 ，4 一三氮唑为抗性筛选物，获 得突变株sc e r e s i v i a ej n 一5 8 ，摇瓶发酵g s h 产量为2 0 9 6 m g l 发酵液，经 优化发酵条件后，提高到3 3 9 1 m g l 。贾建萍7 3 以酿酒酵母为出发菌株，通过 紫外线和射线诱变处理，选育到一株抗乙硫氨酸和氯化锌的突变株 0 5 e t h 4 0 0 - 5 ，摇瓶发酵g s h 产量为1 6 5 m g l ；g s h 占细胞干重的1 9 8 ，比出 发菌株提高3 倍以上。刘娟等分离酵母的单倍体孢子，经诱变获得营养缺陷 型，再经过原生质体融合技术选育到一株g s h 产量明显提高的融合菌株z j f 一7 1 ， 产量比两个出发亲株分别提高1 5 9 和1 4 2 倍，经优化摇瓶发酵条件后，g s h 产量达到1 8 5 3 m g l 。 在国外方面，由于日本对谷胱甘肽生产技术的研究起步较早，相关的报道 以日本方面的居多。i k e n oy 等明以产朊假丝酵母为出发菌株，经亚硝基胍诱 变得到乙硫氨酸敏感株u t i l i sn 7 4 8 ，胞内g s h 质量分数由0 6 5 5 提高到 3 0 。k o n og 等呻1 将出发菌株先后用紫外线、x 射线和亚硝基胍诱变，以亚硝 酸盐和乙硫氨酸为筛选子，选育到g s h 占细胞干重的质量分数由0 5 2 提高到 4 0 的eu t i l i se r 3 0 4 。h a m a d as 等h 以亚硝基胍为诱变剂，筛选到了耐l ， 2 ，4 一三氮唑和氰化钠的啤酒酵母sc e r o s i v i a e 突变株，胞内g s h 质量分数为 2 5 ，而n o m u r ak 等h 2 1 经过紫外线诱变，获得高产的啤酒酵母半乳糖缺陷株 & c e r e s iv i a ek - 2 ，g s h 产量为2 7 0 0 m g l 。 另一种用于提高谷胱甘肽产量的方法是利用基因重组技术来构建高产的基 因工程菌株。构建基因工程菌的技术路线主要是增n 6 s h i 和g s h i i 的拷贝数 以提高工程菌的酶活，或者引入与a t p 再生有关的基因，从而促进g s h 的合成代 谢。上个世纪八十年代以来，应用基因重组技术构建g s h 高产大肠杆菌的研究取 得了较大进展。编码大肠杆菌b 中g s h i 的g s h i 基因最早由m u r a t a 和k i 叫r a h 朝 克隆，并且确定了它的核苷酸序列。m u r a t a h 们从大肠杆菌b 中筛选到一株g s h i 脱敏的突变株，然后从g s h - i 脱敏突变株中克隆了g s h i 基因，并使其在大肠杆 菌b r c 9 1 2 中得到表达，使该菌株g s h 合成活性大为提高，g s h 产量达4 8 1 , u m o l g 湿 细胞。g u s h i m ah i ：酵母粉1 0 ，蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，琼脂1 5 2 0 ，p h 值调 至5 5 。 3 1 1 4 培养条件 斜面培养：将斜面放入恒温培养箱中3 0 c 培养3 d ，再放入4 。c 冰箱中保存。 平板培养：平皿放入恒温培养箱中3 0 。c 培养2 6 d 。 3 1 1 5 菌株的分离 将取回的样品用灭过菌的蒸馏水冲洗，然后按1 0 0 、1 0 一、1 0 、1 0 、1 0 一、 1 0 咱梯度稀释，再将稀释液涂布在平板筛选培养基上，放入恒温培养箱中3 0 培 养2 5 d 。挑取长得较快、较大的菌落镜检，如在1 0 4 0 倍下可看见较大的菌体， 可判断该菌落为酵母菌。将分离到的菌株转接入试管斜面，在培养箱中3 0 。c 恒 温培养3 d ，放入冰箱保存。 3 1 1 6 菌株谷胱甘肽的测定 j 从斜面挑取一环菌种接入种子培养基中，摇床培养2 2 h ，按1 0 的接种量将 种子液接入摇瓶培养基中，3 0 恒温振荡培养2 4 h 。取1 0 m l 发酵液测定其谷胱甘 肽含量，另取1 0 m l i 9 1 , , i j 定菌体干重。 3 1 2 结果与讨论 苹果表皮上分离到8 株酵母菌，分别编号为l l 、l 2 、l 3 、l 4 、l 5 、l 6 、l 7 、 l s ；西瓜表皮上分离n 4 株，依次编号为l 9 、l 1 0 、1 l 1 1 、l 1 2 ；溪流水样中分离 n 4 株，编号为l 1 3 、l 1 4 、l 1 5 、l 1 6 ；植物的花上分离到2 株，编号为l 1 7 、l 1 8 ； 本实验室中保存的两株酵母菌编号为l 1 9 、l 2 0 。分离到的菌种中多为白色，形 状有圆形，椭圆形，短杆状。野生的酵母菌中的谷胱甘肽含量一般都较低，一 般为细胞干重的o 5 一1 0 。筛选到的各株酵母菌的谷胱甘肽含量如表3 1 所示， 在2 0 株酵母菌中，l 5 、l 1 3 、l 1 4 、l 1 5 的谷胱甘肽产量最高，其显微形态( 1 0 4 0 ) 如图3 1 - 3 4 所示。 表3 1 野生酵母菌分离筛选结果 图3 1l 5 菌株 图3 3l 1 4 菌株 图3 2l i3 菌株 图3 4l 1 5 菌株 3 2 酵母菌种的诱变 3 2 1 材料与方法 3 2 1 1 菌种 筛选出的2 0 株菌种中，l 5 、l 1 3 、l 1 4 、l 1 5 的谷胱甘肽产量最高，因此选取 这4 株菌种进行诱变。 3 2 1 2 培养基 平板分离筛选培养基( g l ) ：酵母粉1 0 ，蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，乙硫氨酸 ( 选用) ，琼脂1 8 ，p h 值调至5 5 。 种子培养基( g l ) ：酵母粉1 0 ，蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，p h 值调至5 。5 。 摇瓶培养基( g l ) ：酵母粉5 ，( n h 4 ) 。s o 。5 ，k h 。p 0 46 ，m g s 0 41 5 ， f e s o 。0 0 0 8 ，m n s o 。0 0 0 8 ，p h 值调至5 5 。 3 2 1 3 亚硝酸诱变剂的配制 ( 一) l m o l lp h 4 5 的醋酸缓冲溶液 称取6 1 2 9 醋酸，用蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 。称取8 2 9 醋酸钠，蒸馏水定容至 l o o m l 。将醋酸钠溶液缓缓加入醋酸溶液中，摇匀，调p h 值至4 5 ，两者之比大 约为1 ：1 。 ( 二) 0 1 m o l l 亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠0 6 9 9 ，用蒸馏水定容至l o o m l 。 ( 三) 0 0 7 m o l lp h 8 6 的磷酸氢二钠溶液 称取二水磷酸氢二钠1 2 4 6 9 ，蒸馏水定容至l o o m l 。 以上试剂使用前都要灭菌。 3 2 1 4 培养条件 种子培养：恒温振荡培养箱中3 0 、2 0 0 r m i n 培养2 2 h 。 摇瓶培养：将种子培养液按1 0 的接种量接入装有发酵培养基的2 5 0 m 1 三角瓶， 装液量为3 0 m l ，恒温振荡培养箱中3 0 、2 0 0 r m i n 培养2 4 h 。 3 2 1 5 紫外线连续诱变及变异菌株筛选 取培养卜2 d 的新鲜斜面，用无菌生理盐水洗下菌体制成菌悬液，经玻璃珠 振荡打散和脱脂棉过滤后得单细胞悬浮液，调整菌悬液菌数1 0 8 个m l 左右，吸 取3 m l 菌悬液至无菌的小平皿中，在1 5 w 紫外灯( 距离3 0 c m ) 照射下，磁力搅拌4 0 s ， 菌悬液在无菌室红灯下适当稀释涂平板，平板倒置于2 8 恒温培养箱中培养5 7 d 。每一次诱变后，均在筛选平板上挑取长得较快，菌落且较大的变异菌株进 行分析，只有发生正突变的才考虑进行下一轮的诱变。第一次诱变后，在筛选 培养基中加入乙硫氨酸，以筛选出谷氨酰半胱氨酸合成酶发生正突变的变异菌 株，下一次可不加，进行自然分离，只要选出正突变株即可。 3 2 1 6 亚硝酸连续诱变及变异菌株筛选 用无菌生理盐水洗下培养卜2 d 的新鲜斜面上的酵母菌体制成菌悬液，取菌 悬液l m l ，加入配好的p h 值为4 5 的醋酸缓冲液2 m l 及0 。l m o l l 亚硝酸钠溶液l m l ， ( 两者之比为2 ：l ，亚硝酸最终处理浓度为0 0 2 5 m o l l ) ，于2 5 - 2 6 保温1 0