（分析化学专业论文）离子液体在分子印迹中的应用研究.pdf

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b u t y l 3 m e t h y l i m i d a z o l i u m h e x a f l u o r o p h o s p h a t e ( b m i m b f 4 ) a n dp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) c o m p a r e d 谢mt h ep o l y m e rs y n t h e s i z e di nt h ep b s ，i th a db e t t e rs e l e c t i v er e c o g n i t i o no ft h e t e m p l a t ep r o t e i na n d w a se x p e c t e di nt h ea p p l i c a t i o no ft h er e a lb i o l o g i c a ls a m p l e s a n a l y s i si nt h ef u t u r e i nc h a p t e rt h r e e ，b yu s i n gt h ep e n t a c h l o r o p h e n o la st h et e m p l a t em o l e c u l e ，t h e 3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( a p t e s ) a st h ef u n c t i o n a lm o n o m e r , t h et e t r a e t h o x y - s i l i c o n e ( t e o s ) a st h ec r o s s l i n k e r , t h es o l g e lm i p sw e r ep r e p a r e dr e s p e c t i v e l yi nt h e e t h a n o l 、a c e t o n i t r i l e 、e t h a n o l b m i m b f 4 ( v v = l ：1 ) a n da c e t o n i t r i l e b m i m b f 4 ( v v = l ：1 ) mr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep r o d u c e ds o l g e lp o l y m e rw a s n o tc a p a b l eo f s e l e c t i v er e c o g n i t i o no ft h ep e n t a c h l o r o p h e n 0 1 i nc h a p t e rf o u r ，t r i c l o s a n m i p sw e r es y n t h e s i z e db yu s i n gt r i c l o s a na st e m p l a t e m o l e c u l e ，4 - v i n y lp y r i d i n ea st h ef u n c t i o n a lm o n o m e r , 1 - e t h y l - 3 - m e t h y l i m i d a z o l i u m t e t r a f l u o r o b o r a t e ( b m i m b f 4 ) a s t h e c a t a l y s t t h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t t r i c l o s a n - m i p sh a ds u p e r i o rs e l e c t i v ea d s o r p t i o np r o p e r t yo ft h et r i c l o s a na n dc o u l d e n r i c ht r i c l o s a ni nt h es o l u t i o n n 怆t r i c l o s a n - m i p ss h o w e dp o t e n t i a la p p l i c a t i o no f t h ep r e t r e a t m e n tf o rt h e t r i c l o s a nd e t e r m i n a t i o ni nt h er e a ls a m p l e s 1 1 a b s t r a c t k e yw o r d s ：m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，i o n i cl i q u i d ，b u l kp o l y m e r i z a t i o n ， p r o t e i n s ，c h l o r o p h e n o l s i l i 目录 目录 中文摘要i a b s t r a c t l i 目录i v i 第一章绪论1 1 1 分子印迹技术l 1 1 1 分子印迹技术的概述1 1 1 2 分子印迹技术的原理2 1 1 3 分子印迹技术的分类3 l - 1 3 1 共价键分子印迹法。3 1 1 3 2 非共价键分子印迹法3 1 1 3 3 半共价键分子印迹法4 1 1 4 分子印迹过程中几个要素的选择4 1 1 4 1 模板分子的选择4 1 1 4 2 功能单体的选择。4 1 1 4 3 交联剂的选择5 1 1 4 4 洗脱液的选择6 1 1 4 5 溶剂的选择6 1 1 5 分子印迹聚合物的制备方法。7 1 1 5 1 本体聚合法。7 1 1 5 2 悬浮聚合法8 1 1 5 - 3 溶胀聚合法8 1 1 - 5 4 乳液聚合法。8 1 1 5 5 沉淀聚合法9 i v 目录 1 1 5 6 表面印迹法。9 1 1 5 7 分子印迹膜制备方法1 0 1 1 6 分子印迹技术的应用1 0 1 1 6 1 在色谱分析中的应用l o 1 1 6 2 在固相萃取中的应用l l 1 1 6 3 在传感器方面的应用l l 1 1 6 4 在催化反应中的应用1 l 1 2 离子液体1 2 1 2 1 离子液体及其种类1 2 1 2 2 离子液体的合成方法1 2 1 2 2 1 间接合成法1 2 1 2 2 2 直接合成法13 1 2 2 3 微波合成法1 3 1 2 2 4 其他辅助法1 3 1 2 3 离子液体的应用1 4 1 2 3 1 离子液体在萃取分离中的应用1 4 1 2 3 2 离子液体在电化学方面的应用1 4 1 2 3 3 离子液体在聚合反应中的应用l5 1 2 3 4 离子液体在有机合成反应中的应用1 5 1 3 本论文工作内容及意义。1 6 参考文献l7 第二章离子液体为反应介质、牛血红蛋白为模板的蛋白质分子印迹 聚合物的合成与表征2 3 2 1 引言2 3 2 2 实验部分2 5 2 2 1 仪器与试剂2 5 2 2 2 牛血红蛋白( b h b ) 印迹及非印迹聚合物的制备2 5 v 目录 2 2 2 1 以p b s 为溶剂，b h b 为模板的印迹及分印迹聚合物的制备。2 5 2 2 2 2 以p b s 和离子液体 b m i m b f 4 为混合溶剂，b h b 为模板的印迹及非印 迹聚合物的制备2 6 2 2 3 聚合物的电镜表征2 6 2 2 4 等温吸附实验2 6 2 2 5 动力学吸附实验2 7 2 2 6 竞争吸附实验2 7 2 2 7 吸附解吸实验。2 7 2 3 结果与讨论2 8 2 3 1 离子液体种类的选择2 8 2 3 2 离子液体 b m i m b f 4 与p b s 比例的优化2 8 2 3 3 交联度的优化2 9 2 3 4 干燥条件的选择2 9 2 3 5 聚合物的电镜表征结果3 0 2 3 6 吸附实验性质3 2 2 3 6 1b h b 在p b s m i p s n i p s 上的等温吸附曲线3 2 2 3 6 2b h b 在p b s m i p s 上的l a n g m u i r 等温吸附方程处理3 3 2 3 6 3b h b 在 b m i m b f 4 一m i p s n i p s 上的等温吸附曲线3 4 2 3 6 4b h b 在 b m i m b f 4 一m i p s 上的l a n g m u i r 等温吸附方程处理3 5 2 3 6 5b h b 在p b s - m i p s n i p s 和 b m i m b f 4 - m i p s n i p s 上的吸附性质的比较 ：i ! ； 2 3 6 6p b s - m i p s n i p s 和 b m i m b f 4 - m i p s n i p s 对b h b 识别选择性的比较3 6 2 3 6 7b h b 在 s m i m s 1 ：4 - m i p s 上的动力学吸附曲线3 8 2 3 6 8 【b m i m b f 4 - m i p s 的吸附一解吸实验3 9 2 3 6 9 【b m i m b f 4 - m i p s n i p s 上b h b 与b s a 的竞争吸附曲线4 0 2 4 结论4l 参考文献4 2 第三章五氯酚为模板，溶胶凝胶法分子印迹聚合物的合成与表征4 3 v i 目录 3 1 引言4 3 3 2 实验部分。4 5 3 2 1 仪器与试剂4 5 3 2 2 以五氯苯酚为模板的印迹及非印迹聚合物的制备4 5 3 2 3 吸附实验4 5 3 3 结果与讨论。4 6 3 3 1 吸附实验结果4 6 3 4 结论4 7 参考文献4 8 第四章以三氯生为模板、离子液体为催化剂，本体聚合法分子印迹 聚合物的合成与表征4 9 4 1 弓i 言4 9 4 2 实验部分5 0 4 2 1 仪器与试剂5 0 4 2 2 以三氯生为模板的分子印迹聚合物及非印迹聚合物的合成5 0 4 2 3 等温吸附实验5l 4 2 4 吸附动力学实验5 l 4 2 5 相似物吸附实验5 2 4 2 6 吸附解吸实验5 2 4 3 结果与讨论。5 2 4 3 1 离子液体 b m i m b f 4 对聚合反应时间的影响5 2 4 3 2 功能单体的选择5 3 4 3 3 溶剂的选择5 3 4 3 4 功能单体与模板比例的选择5 4 4 3 5 吸附实验性质5 5 4 3 5 1 等温吸附曲线5 5 4 3 5 2 三氯生在m i p s 上的l a n g m u i r 等温吸附方程处理5 6 v n 目录 4 3 5 3 吸附动力学曲线5 7 4 3 5 4 相似物吸附实验5 8 4 3 5 5 吸附解吸实验5 9 4 4 结论6 1 参考文献6 2 作者简介及硕士期间科研成果6 3 致谢。6 4 v i i i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 分子印迹技术 1 1 1 分子印迹技术的概述 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t e dt e c h n o l o g y ，m i t ) 是制备对特定目标分子 ( 模板分子) 具有特异性选择能力的高分子聚合物( 分子印迹聚合物) 的技术【1 1 ， 它是当前高选择性材料发展的重要方法之一。分子印迹技术源于免疫学，但如 今已发展成为一门涉及高分子化学、材料化学、生物化学和分析化学等交叉学 科技术【2 羽。 分子印迹技术的的起源最早可追溯到1 9 世纪末f i s c h e r 的“锁匙 ( l o c k a n d k e y ) 假设理论【7 l 。后来，免疫学的兴起与发展为早期分子印迹概念的 提出奠定了坚实的基础。2 0 世纪3 0 年代早期，b r e i n l 等人在研究中提出了一种当 抗原侵入生物体时会产生抗体的理论【8 】，其基本观点是：抗原分子作为模板位于 免疫活性细胞内，抗体则是按照此模板合成的在空间构型上与抗原分子具有互 补性的新蛋白质分子，故在此模板上塑造的抗体分子，具有抗原相适应的结合 部位，能与抗原呈特异性结合。其后，著名诺贝尔奖获得者p a u l i n g 在上述理论 的基础上，进一步总结并阐述了可以用抗原为模板来合成抗体的理论 9 1 。在此基 础上，1 9 4 9 年d i c k e y 在制备硅胶吸附剂时提出了“专一性吸附”的概念【l o 】。至 此，分子印迹技术的萌芽已经产生。但是当时，这一观点在很长一段时间内没 有受到人们的足够重视。直至1 9 7 2 年，德国w u l 讲】的研究小组首次报道合成了 对糖类化合物具有高选择性能的共价型分子印迹聚合物，这使得分子印迹逐渐 被人们认识。但是由于的研究重点都主要集中在共价型分子印迹聚合物上，应 用范围较窄，仅限于催化领域，因此分子印迹技术在分子识别等领域的应用并 没有完全展开。到了2 0 世纪9 0 年代，瑞典m o s b a c h 1 2 】的研究小组在n a t u r e ) ) 上 发表了关于茶碱分子的分子印迹聚合物的研究报道后，分子印迹技术以其通用 性及专一识别性等独特的优点，备受科研工作者的青睐，逐渐成为当前国内外 研究的热点。 第一章绪论 分子印迹技术之所以受到广大科研工作的重视，是因为其有着其他技术无 法比拟的三大优势：构效预订性( s t r u c t u r ep r e d e t e t e r m i n a t i o n ) 、特异识别性( s p e c i f i c r e c o g n i t i o n ) 和广泛实用性( e x t e n s i v ep r a c t i c a b i l i t y ) 。其中，构效预订性可以让有着 不同需求的人们根据其要求，进行不同的选择；特异识别性是因为每种分子印 迹聚合物的制备都是以不同结构的分子作为模板来定做的，它具有特定的分子 空间构型与官能团，能够有效地选择性吸附目标分子；广泛实用性是指其与天 然的生物分子识别体系相比，具有成本低廉、制备简单等优势。而且，相比于 抗体与抗原、酶与底物、受体与激素等体系，分子印迹聚合物的制备与使用不 需要十分苛刻的环境，并且有着很好的稳定性和较长的使用寿命。正因为分子 印迹技术具有以上这些优点，所以它在许多领域，如催化、传感器、色谱分离、 固相萃取、膜分离掣1 3 。17 j 诸多领域有着非常好的发展及应用前景。 1 1 2 分子印迹技术的原理 分子印迹技术是以欲识别的目标分子为模板，将其与功能单体混合相互作 用后形成复合物，然后在交联剂的包裹与引发剂的作用下聚合生成分子印迹聚 合物，然后通过特定的洗脱液洗去通过一定作用力吸附在聚合物中的模板分子， 最后得到带有与模板三维分子空间构型与官能团相匹配的识别位点的分子印迹 聚合物。 扎功能单体；b 交联剂；c 模板分子 1 功能单体与模板分子形成复合物；2 功能单体与交联剂发生共聚； 3 在聚合反应进行中，一个不溶性的，高度交联的高分子网络围绕着模板分子形成； 4 除去模板分子的同时得到一个对模板分子特异性识别能力的结合位点 图1 1 分子印迹原理示意图 利用其制备过程中形成的特异性识别位点，可以选择性的吸附混合物中的 2 第一章绪论 模板分子，从而达到分离与富集的目的。 1 1 3 分子印迹技术的分类 根据模板分子与功能单体形成复合物的作用力不同，主要存在以下三种形 式的分子印迹方法：共价键印迹法、非共价键印迹法和半共价键印迹法【l 引。 1 1 3 1 共价键分子印迹法 共价键分子印迹法也称预组装法( p r e o r g a n i z e da p p r o a c h ) ，它是指交联聚合 前模板分子与功能单体之间先通过反应形成西夫碱、缩醛、亚胺、硼酸酯【1 9 , 2 0 1 等共价作用的衍生物，然后在交联剂和引发剂的作用下聚合生成聚合物。最后 在一定条件下打开共价键，使得模板分子从聚合物中去除。这样得到的分子印 迹聚合物，对于模板分子具有高度的亲和性与选择性。由于共价型分子印迹聚 合物在识别目标分子的过程中，都是依赖识别位点与模板分子的共价键作用。 而共价键的键能一般较高，这样导致模板分子与聚合物结合后难以被洗下，并 且模板分子与聚合物的结合、离解速率都较慢，不利于混合物中目标分子的快 速识别。 1 1 3 2 非共价键分子印迹法 非共价键分子印迹法又称自组装法( s e l f - a s s e m b l ya p p r o a c h ) ，它是指交联聚 合前模板分子与功能单体之间预先自组织排列，通过非共价键( 主要是静电作 用、氢键作用、疏水作用、兀兀共轭、金属配位作用、电子转移等超分子作用【2 u 等) 作用形成模板分子功能单体复合物，然后在交联剂和引发剂作用下生成分 子印迹聚合物。最后通过特定洗脱剂除去通过这种非共价作用力结合在聚合物 上的模板分子，得到非共价型分子印迹聚合物。这种类型的分子印迹聚合物在 预聚合和识别目标分子的过程中都是通过模板分子与分子印迹聚合物内各种官 能团间的氢键、离子键、疏水作用等非共价作用力，这样的作用方式类似于天 然生物分子。由于这种类型的作用力强度大小适中，模板分子与聚合物结合、 离解速率快，适用范围广，所以被广泛应用于各类分子的快速识别中。但是， 由于有些非共价作用力较弱，在制备分子印迹聚合物的过程中容易受到诸如溶 液极性、温度、溶液p h 值等外界条件的影响【2 2 】，用这种方法合成的分子印迹聚 合物有时在识别目标分子的过程中效果不甚理想，这也局限了非共价印迹法的 3 第一章绪论 应用。 1 1 3 3 半共价键分子印迹法 半共价分子印迹法是指结合上述两种分子印迹法，具体来说是预聚合时， 模板分子与功能单体通过共价键和作用形成空间精确排列的复合物，聚合后仍 采用水解等方式破坏原有的共价键从而得到非共价型的识别位点，在识别过程 中仅仅依靠非共价键作用来结合目标分子【2 3 1 。该种方法合成的分子印迹聚合物 兼具了共价型与非共价型分子印迹法的优势，特异性识别能力强并且识别速率 快，已成为当前分子印迹技术发展的热点。 1 1 4 分子印迹过程中几个要素的选择 在分子印迹聚合物的制备前，需要根据不同的情况，选取不同的模板分子、 功能单体、交联剂、洗脱液和溶剂。下面对印迹过程中所选取印迹材料的原则 进行了总结。 1 1 4 1 模板分子的选择： 根据合成分子印迹聚合物应用的不同需求，需要选择相应的物质作为模板 分子。对于大多数物质而言，一般直接选用该目标分子作为模板分子。但是， 有时会由于获取标准品困难或者成本高昂等原因，也可选取与该分子结构相似 的分子替代其进行印迹，这种方法叫做替代模板、法【2 4 1 。 1 1 4 2 功能单体的选择 功能单体是根据模板分子的结构和性质选取的。功能单体与模板分子间必 须有适中的作用力使其结合形成复合物。作用力不宜过强，否则模板分子难以 洗脱：作用力也不宜太弱，否则印迹效率不高【2 5 1 。下图是分子印迹中常见的几 种功能单体。 4 第一章绪论 h h h 叱h h 3 c i o 丙烯酸 甲基丙烯酸 0 0 h h o o ( j hf 3 c o：c ，h o h 3 c - o 村+ c 亚甲基丁= 酸 丙烯酰胺 2 - 丙烯酰胺基- 2 - 甲基1 - 丙磺酸 h产l h ：厂n 乙烯基苯甲酸6 一甲基- 2 乙烯基毗啶4 乙烯基吡啶乙烯基昧唑 图1 2 常见功能单体的结构图 1 1 4 3 交联剂的选择 在合成过程中，功能单体与交联剂比例( 即交联度) 会影响所制得聚合物 的状态及识别性能。交联剂比例过小，不利于固定识别位点；交联剂比例过大， 会在传质过程中产生较大的阻力，不利与快速吸附测定，还可能造成模板分子 永久性包埋【2 6 1 。常见的交联剂类型如下图所示。 5 第一章绪论 u ，邺 乙二醇二甲基丙烯酸酮e d g m a n 。盯亚甲基二丙烯酰胺 - - 7 烯苯 n 时 h 0 c h 2 c o o h n , n 。- 1 ，4 - 苯基二丙烯酰胺 3 , 5 二丙烯酰胺苯甲酸 季戊四醇三丙烯酸醋 三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸醋 季戊四醇四丙烯酸醴 图1 3 常见交联剂的结构图 1 1 4 4 洗脱液的选择 洗脱液的作用在于解除模板分子与功能单体之间的作用力。选择时要根据 模板分子与功能单体之间的作用力类型来确定。对于共价键和类作用力，可选 用草酸以及强酸强碱作为洗脱液破坏共价键 r q ；对于非共价作用力( 如氢键、 静电作用) ，可尝试使用较强作用力来取代模板分子与功能单体分子间作用力进 行洗脱 2 s 】。 1 1 4 5 溶剂的选择 溶剂的选择对于印迹效果有着非常重要的影响。首选，溶剂必须对各种反 6 c i 丫o n n 第一章绪论 应原料( 如单体、模板、交联剂、引发剂等) 都有很好的溶解性，否则聚合反 应无法进行。其次，溶剂不宜与模板分子存在较强的作用力，这会影响模板分 子与功能单体之间的复合。对于大多数小分子印迹反应，都是在有机相中进行 “2 9 1 ，而对- t - 女n 蛋白质类的生物大分子，则通常在水相中进行【3 们。 1 1 5 分子印迹聚合物的制备方法 分子印迹聚合物的制备主要分为三步：第一步，在溶剂中模板分子与带有 特殊官能团的功能单体通过共价或者非共价作用力结合，形成在空间结构上互 补的模板分子功能单体复合物；第二步，在上述复合物溶液中加入带有多个双 键交联剂，然后在引发剂作用下，通过光或热的作用来引发聚合反应，使得交 联剂包裹在模板分子功能单体复合物外形成网状高分子聚合物；第三步，使用 一定的方法( 常常是洗脱剂淋洗) ，使模板分子脱离开聚合物，这样就在聚合物 上形成了与模板分子三维空间结构相匹配的孔穴，这些孔穴内的识别位点可以 用来特异性选择识别模板分子【3 1 1 。 目前，分子印迹法己广泛应用于化学、生物、医学等学科的各个方面，由 于应用范围与使用要求的不同，所以人们常常采取不同的制备方法来满足不同 的需求。分子印迹聚合物的制备有如下几种常用的方法： 1 1 5 1 本体聚合法 本体聚合法是目前应用最为广泛、制备分子印迹聚合物最为成熟与通用的 方法。它是将模板分子与功能单体按照一定比例溶解于惰性溶剂中，充分预聚 后，加入交联剂与引发剂，超声脱气并通氮气除氧，然后密封反应容器，经过 光引发或热引发一段时间后聚合成为块状固体。将得到的块状聚合物经粉碎、 研磨、过筛等预处理等预处理过程后得到粒径大小均一的聚合物粉末，加入特 定洗脱液出去其中的模板分子，经干燥后便得到分子印迹聚合物。此法制备过 程简单，对实验仪器、反应条件等要求不高，反应易于控制。但是，由于在聚 合完毕后要进行研磨、过筛等大量后处理工作，操作繁琐，而且不可避免地会 造成印迹材料的大量损失，利用率不高。并且在研磨过程中，一部分印迹孔穴 遭到破坏，影响印迹效率【3 2 1 。 7 第一章绪论 1 1 5 2 悬浮聚合法 悬浮聚合是制备球状聚合物最简便和常用的方法之一。其过程为将含有模 板分子、功能单体和交联剂的混合有机溶液加入到水相中，在两相间使用机械 搅拌高速转动，使得有机相成为悬浮于水相中的小液滴。聚合反应发生在每一 个分散于水相中的有机小液滴中，最后生成球状的聚合物颗粒【3 3 l 。但是由于常 用的功能单体都是疏水性的，而且水相的高极性会严重影响模板分子与功能单 体之间的作用力( 如氢键作用) ，) 夺j l l t m a y c s 等人【3 4 】首次提出使用全氟烃为分散 介质，并加入特效的聚合物表面活性剂使反应混合液形成乳状溶液，在此状态 下引发聚合后可得到颗粒、形态分布均匀的聚合物微球，可作为h p l c 的填料， 在使用中具有低柱压和快速扩散等优点。虽然全氟烃作为分散剂可消除非共价 印迹过程中存在的不稳定预组装体，但是由于全氟烃价格昂贵，并且对于环境 有比较大的危害，所以应用受限。 1 1 5 3 溶胀聚合法 溶胀聚合法是采用以无皂乳液聚合法合成的小粒径微球作为种子，然后用 特定的乳液多次溶胀种子，最后通过热或者光引发聚合生成符合要求的印迹聚 合微球3 5 1 。h o s o y a 等a 3 6 ，3 7 】以无皂乳液聚合法制备的聚苯乙烯微球为种子，经 甲苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、邻苯二甲酸二丁酯等物质多步溶胀，最后采用 悬浮聚合法，制得萘普生的分子印迹聚合微球，对目标分子萘普生有着良好的 选择识别性能。虽然通过多步溶胀悬浮聚合法合成的印迹微球有着单分散性好、 选择识别能力高等优点，但是此方法的合成过程繁琐，周期较长。所以，成国 祥等人【3 8 】在此基础上进行了改进。他们在粒径l i x m 的的聚苯乙烯微球种子上，以 甲基丙烯酸和丙烯酰胺为功能单体，三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯为交联剂， 制备了l 2 苯丙氨酸和l 2 酪氨酸的印迹聚合物微球。实验结果说明，用此方法法 制备的微球粒径更加均一，吸附性能也较理想。 1 1 5 4 乳液聚合法 乳液聚合是在搅拌条件下，使功能单体借助乳化剂的作用在水中分散呈乳 状液而进行的聚合反应，一般是由水、单体、引发剂和乳化剂四部分构成。其 具体制备过程如下：将功能单体、交联剂溶于有机相，再加入模板分子，然后 加水和乳化剂，并迅速搅拌，最后加入引发剂引发聚合，可以制备出粒径均一 8 第一章绪论 的球状分子印迹聚合物。用此方法合成的印迹微球，颗粒均一，适合工业中大 量生产，并且适用于印迹水溶性目标分子【3 9 1 。f e l i c i a n o 等人【4 0 】利用微滴乳液聚合 反应，印迹了( s ) 心得安分子，并用该方法制得的印迹纳米材料填充毛细管电 色谱，对模板分子及其对映异构体得到很好的分离效果。 1 1 5 5 沉淀聚合法 沉淀聚合法是溶液聚合的基础之上，采用适当