（化学工艺专业论文）大豆胚芽中异黄酮提取研究.pdf

摘要 y 。5 8 1 5 3 2 本文研究了从大豆胚芽中提取和纯化总异黄酮的方法与工艺，包括总异黄 酮的初步提取和异黄酮提取物的固体酸水解两个主要过程。 在火豆胚芽总异黄酮初步提取条件优化实验中，以单因素实验方法优化了 四个影响因素：提取温度、提取时间、溶剂用量、溶剂浓度。以胚芽中总异黄 酮提取率和提取的选择性为指标，确定6 0 乙醇为提取溶剂、提取温度5 0 。c 、 提取次数三次、每次提取的液固比为6 ：1 、三次的提取时间分别为6 0 m i r l 、 1 0 m i n 、l o m i n ，三次总提取率为9 2 。 在异黄酮固体酸水解实验中，选择南开大学化工厂的d 7 2 强酸性阳离子交 换树脂作为固体酸催化剂。经过两次固定床水解反应，染料木素、大豆黄素和 黄豆黄素等三种异黄酮转化率可达9 0 。实验研究了温度、甲醇水配比、进料 配比以及接触时间对游离型异黄酮转化率的影响。结果表明，在实验温度范同 内( 6 0 7 0 。c ) ，温度变化对g e n s t e i n 和g l y c i t ej n 影响较明显，温度升高转 化率增大；温度变化对d a i d z e i n 的转化率影响不大；接触时间越长，反应的转 化率越高，并逐渐趋向平衡值；甲醇水配比为1 ：2 有利于水解反应；溶剂比例 增大，三种异黄酮转化率都增大，溶剂比例增大到一定程度转化率变化不明显。 异黄酮精制过程中，探索了柱层析、溶剂萃取、溶剂沉淀等方法，最终异 黄酮含量可达4 0 ，对胚芽异黄酮收率5 0 左右。 建立了总异黄酮的分析方法和游离态异黄酮的h p l c 分析方法。 关键词：大豆异黄酮大豆胚芽提取水解反应固体酸 采缀作者、导师同意 勿全文公布 a b s t r a c t ap r o c e s sf o re x t r a c t i n ga n dp u r il y i n gis o f h v o n e sf r o ms o y b e a n g e r m w a ss t u d ie di nt h i s p a p e r t h ep r o c e s si n c l u d e se x t r a c t i o no ft o t a l is o i l a t o n e sa n d h y d r o y z a t i o n o f s o y b e a n is o i l a v o n e b y s o l i da c i d e a t a l y e t i nt h ee x p e r i m e n t so fe x t r a c t i o no ft o t a lis o f l a v o n e s ，f i v ef a c t o r s w e r es t u d ie d ：t e m p e r a t u r e ， e x t r a c t i n gt i m e c o n e e n t r a t i o no fs o l v e n t a n da m o u n to fs 0 1 v e n t w i t ht h ee x t r a c t i o n e f f i c i e n c y 0 ft o t a l is o f l a v o n e sa n dt h es e l e c t iv i t yo fe x t r a c t i o na s s t u d yt a r g e t s t h e o p t i u me x t r a c t i o n c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w e d ：s o l v e n t6 0 e t h a n 0 1 t e m p e r a t u r e5 0 ，s o l v e n tv o l u m et os o b e a ng e r mw e i g h t6 ：1 ，e x t r a c t in g f o r3 t i m e s 6 0 m i n 、l o m i n 、1o m i nr e s p e c t j t e l y e x t r a c t i o ne l f ic ie n c yo f t o t a lis o f t a v o n e sw a sa b o u t9 2 i nt h ee x p e r i m e n t s0 ff i x e db e dp r o c e s s ，s o y b e a ni s o i l a t o n e9 1 u c o s i d e c a nb eh y d r o l y z e di n t oi s o f l a v o n ea g l u c o n ew i t hm e t h a n o li naf i x e db e d f i1l e dw it hs oli da c i dc a t a l y s t ( n a n k a ic h e m i c a lf a c t o r y ，d 7 2 ) c o n v e r s i o no fi s o l l a t o n e si sa b o u t9 0 。t h ee f f e c t o ft e m p e r a t u t e ， c o n t a c tt i m e ，c o n c e n t r a t i o no fm e t h a n o la n dp r o p o r t i o no fs o l v e n tt o m a t e r i a lo nc e n t e r s i o nw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w t h a te n h a n c i n g t e m p e r a t u r ea n dp r o l o n g i n gt h ec o n t a c tt i m ea r ef a v o ro ft h er e a c t i o n ， a n dt h er a t i 0o fm e t h a n o lt ow a t e ris a p p r o p r i a t e l y 1 ：2 d u r i n gt h ep r o c e s so fr e f i n i n go f is o f l a v o n e sf r o mt h ee x t r a c t i o n ， m e t h o d ss u c ha sc h r o m a t o g r a m ，e x t r a c t i o n ，d e p o s i t i o nw e r er e s e a r c h e d c o n t e n to fi s o f l a v o n e w a sa s h i g h a s4 0 ，a n d r e c o v e r yp e r c e n t o f i s o f i a v o n eb a s e do ns o y b e a ng e r mw a sa b o u t5 0 a n a l y t i c a l m e t h o df o r t o t a li s o f l a v o n e sa n di s o f l a v o n ea g h c o n ew a s e s t a b l i s h e d k e yw o r d s ：s o y b e a ni s o f l a v o n e s ，s o y b e a ng e r m ，e x t r a c t i o n ，h y d r o l y z a t i o n ， s o l i da c i dc a t a l y s t 2 目j j舌 大豆是我国的一种传统食品，含有大量生理活性物质，包括低聚糖类、磷 脂、维生素类、异黄酮、大豆皂甙类等。随着对大豆功能性成分的研充不断深 入，大豆的综合开发利用也越来越受到世界各国的关注。1 9 9 4 年，我国“国家 食物与营养咨询委员会”向国务院及有关部委提出了关于我国城乡实施“大豆 行动计划”的建议，得到国务院及有关部委的大力支持。另外，流行病学调查 发现长期食用大豆的东南亚人群中，癌症、心血管等疾病的发生率明显低于西 方。大豆和豆制品具有广泛的生物特性，如防治癌症、降低血脂、抗动脉粥样 硬化症、改善妇女更年期综合症症状、防止鼻出血综合症等，研究表明这些功 效均与其含有的活性物质异黄酮( i s o f l a v o n e ) 密切相关。自t 9 3 1 年对大豆异 黄酮的报道，特别是上世纪八十年代发现异黄酮的许多生理活性以来，许多国 家的科学家对异黄酮进行了广泛和深入的研究。”“。 近两年，制取富含大豆异黄酮制品或异黄酮纯品的专利技术不断问世。总 结丌发之中的大豆异黄酮素材，以大豆胚芽( 胚轴) ，特别是富含异黄酮配基形 式的大豆蛋白制取的专利技术为多，高纯度大豆异黄酮素材开发的专利技术相 对较少，高纯度大豆异黄酮素材以实验室制取为主，国外一般是将大豆片或脱 脂大豆片经水、醇等溶剂浸出溶出液，加热、分离溶出液得粗异黄酮制品，再 经色柱法或其他方法精制而成；或者将溶出液经超滤膜等分离，透过液冷却、 结晶化，再经离心分离或过滤得异黄酮结晶物；或者用树脂吸附，再用水洗净 树脂，经水、醇溶剂溶出一定浓度异黄酮，真空干燥得制品。工业化生产高纯 度大豆异黄酮的报道很少，且大多数处于研究状态。据近期外国专利介绍，主 要有溶剂萃取法、柱层析法、碱提取酸沉淀法、活性碳吸附法、离子交换树脂 法等方法来提取大豆异黄酮。采用溶剂萃取法与吸附树脂相结合，不仅可获得 高纯度大豆异黄酮，还可以获得大豆皂甙，蛋白质及水溶性多糖，还适用于采用 高于蛋白质等电点的弱碱性水溶液提取工艺”1 。 目前我国对大豆的研究开发主要集中在较小范围的豆制品方面，如加工成 豆粉、豆奶粉、豆腐及一些发酵豆制品。在生产的过程中，异黄酮的损失量相 当大，有的损失甚至高达5 0 以上，并且这些产品中异黄酮总量太少，难以满 足人体需要。尽管我国学者已丌始注意到大豆异黄酮产品研究开发的重要性， 但总的说来，开发层次低，异黄酮含量低，提取精制技术落后。现在我国大约 有十余家进行大豆异黄酮生产厂家，但极少有特色产品推向市场，主要向日本、 美国及欧洲出口低含量的大豆异黄酮粗品。而国外，尤其是r 本已开发出一系 列浓度的大豆异黄酮产品，尤以最近研制出的“富士黄酮”大豆异黄酮系列制 品为代表，该产品具有独特的优点：水溶性高，热稳定性高，无苦涩味，已广 泛应用于药品、保健品、食品及饮料行业。美国的a d b l 公司于2 0 0 0 年在美国率 先推出了含量4 0 的大豆异黄酮制品。在2 0 0 1 年美国植物制剂销售市场上， 大豆异黄酮类产品的销售排名第九。据专家预测，在以后几年，其销售额排名 将更靠前，对个新产品来说，上市刚一年，就进入销售额村十名，这在美国 植物制剂销售市场是想当少见的。经调查，市场对大豆异黄酮的年需要求量在 1 5 0 0 t ，而目前的年生产量为5 0 0 t ，高纯度大豆异黄酮市场售价想当昂贵，据 报道，纯度为9 8 的大豆异黄酮在美国售价曾一度高达1 3 9 美元毫克。因此， 大豆异黄酮的研究和开发具有很大的市场潜力。我国是大豆的故乡，有数千年 的食用史，并具有丰富、低廉的大豆原料，随着对大豆异黄酮功能性和营养性 的深入研究，随着提取及精制工艺的不断完善，大豆异黄酮将在医药、保健品、 食品、饮料及其它行业将得到越来越广泛得应用。 近年研究发现大豆具有很多特殊的生理活性，而这些功效均与其含有的活 性物质异黄酮密切相关。自然界中异黄酮资源十分有限，大豆是唯一含有异黄 酮且含量在营养学上有意义的食物资源。我国大豆资源非常丰富，但目前主要 作为生产豆制品的原料，如榨油等，直接作为食品或者经简单粗略的加工后作 为传统的食品供人们食用。以大豆异黄酮为食品添加剂的食品制品和本身含有 大豆异黄酮的保健食品在国际市场上越来越普遍。大豆异黄酮在保健食品、功 能性食品添加剂及生物制药等领域有着非常广阔的应用前景。大豆异黄酮所具 有的药理作用显示了它具有很大的开发价值，如能充分利用大豆中的活性成分， 提高其附加值，一定能取得良好的经济效益和社会效益。 本文打算以大豆胚芽为原料对大豆胚芽中总异黄酮的提取和纯化工艺条件 进行研究，拟确定总异黄酮的初步提取条件，并对异黄酮提取物的水解工艺条 件进行研究。同时对异黄酮精制过程中，如柱层析、溶剂萃取、溶剂沉淀等方 法进行研究以期获得较高含量的异黄酮产品。 一堂兰查兰竺! ：丝墨! ! ! 竺： 1 1 异黄酮简介 第一章文献综述 大豆，异名黄豆，是豆科植物大豆的种子，是许多国家和地区的主要食品之 一。近年来的研究表明，大豆和豆制品具有许多生理活性，如防癌，降血脂等， 这些功效与其中含有的活性成分异黄酮( i s o f l a v o n e ) 有关。自1 9 3 1 年对大豆异黄 酮的报道，特别是上世纪八十年代发现异黄酮的许多生理活性以来，许多围家的 科学家对异黄酮进行了广泛和深入的研究。 1 1 1 分子结构及其分布 大豆异黄酮是大豆生成中形成的一类次生代谢产物，是多酚类混合物。大豆 总异黄酮平均含量为0 2 o 4 ，其中胚芽中含量为1 4 1 7 6 ，予叶中为 0 1 5 一0 3 2 ，种皮中为0 0 1 0 0 2 ，异黄酮主要富集在胚芽中。迄今为止， 人们已从大豆中分离出9 神大豆异黄酮葡萄糖苷( g l u c o s i d e ) 和3 种相应的糖苷 配基( a g l u c o n e ) ，糖苷配基即游离态异黄酮，它们的结构式和名称如图1 1 和表 1 1 所碉l 。 大豆异黄酮( 配基或苷元) 结构式 大豆异黄酮葡萄糖苷( 配糖体) 结构式 图卜l 大豆异黄酮化合物的结构式 浙江大学f i ! j j 十论史( 2 0 0 4 ) 1 2 种异黄酮的结构式及名称如下表 表1 一l1 2 种异黄酮的分子式及名称 九种异黄酮糖苷化学名称分别为： ( 1 ) 7 ，4 一二羟基异黄酮一7 一葡萄糖苷( d a i d z i n ) ： ( 2 ) 7 ，4 二羟基一6 一甲氧基异黄酮7 一葡萄糖苷( g l y c i t i n ) ； ( 3 ) 5 ，7 ，4 一三羟基异黄酮一7 一葡萄糖苷( g e n i s t i n ) ； ( 4 ) 6 ”一o 一丙二酰基一7 ，4 一二羟基异黄酮一7 一葡萄糖苷 ( 6 ”- - o - m a l o n y l d a i d z i n ) ： ( 5 ) 6 ”一o 一丙二酰基一7 ，4 二羟基一6 一甲氧基异黄酮一7 一葡萄糖苷 ( 6 ”一o m a l o n y l g l y c i t i n ) ： ( 6 ) 6 ”- - 0 - - 丙二酰基一5 ，7 ，4 一三羟基异黄酮一7 一葡萄糖苷 ( 6 ”一o - - m a l o n y l g e n i s t i n ) ； ( 7 ) 6 ”一o 一乙酰基一7 ，4 一二羟基异黄酮一7 一葡萄糖苷 ( 6 ”一0 一a c e t y l d a i d z i n ) ； 浙江大学顷f 论文( 2 0 0 4 ) ( 8 ) 6 ”一0 一乙酰基一，4 一二羟基一6 甲氧基异黄酮一7 一葡萄糖苷 ( 9 ) 6 ”一o 一乙酰基一5 ，7 ，4 一三羟基异黄酮一7 一葡萄糖苷 3 种游离态形式异黄酮即苷元化学名称分别为： 大豆黄素( d a i d z e i n ，7 ，4 一二羟基异黄酮) ； 0 1 ) 黄豆黄素( 9 1 y c i t e i n ，7 ，4 一二羟基一6 一甲氧基异黄酮) 0 d 染料木黄酮( g e n is t e i n ，5 ，7 ，4 一三羟基异黄酮) 。 十二种化合物相互关系如下 ，( 葡萄a g 糖u 苷。配n e 基) lc 1 。g l u c 葡o s 萄i d 糖e 苷， i s o r l a v o n e i c 总异黄酮，l c o n j u g a t e dg l u c o s i d e ( 染料木苷) ( 黄豆苷) ( 大豆黄酮) 6 ”- - 0 - - m a l o n y i g e n i s 1 6 ”- - o - - m a l o n y l d a i d z l 6 ”- - 0 - - a l o n y l g l y c i ( 丙二酰基葡萄糖苷) 16 ”- - 0 - - a c e t y l g e n i s t i 6 ”一o a c e t y l d a i d z i l6 ”- - 0 - - a c e t y l g l y c i ( 乙酰基葡萄糖苷) 其中，游离型的糖苷配基( a g l u c o n e ) 占总量的2 3 ，结合型的糖苷 ( c o n j u g a t e dg l u c o s i d e ) 约占总量的9 7 9 8 ，其中丙二酰型葡萄糖苷约占5 5 6 5 。 i 素素索木黄黄 料一显一显 染大黄1 l n l e 1 en 髓_ u m 埘”黔曲d r l ；l n n 1 n 1t s z ，l l d c n 1 y e a l g d g r。il h n n n n 1 1 2 物理性质 纯大豆异黄酮是无色有苦涩味的晶体? 状物质。大豆异黄酮易溶于丙酮、乙醇、 甲醇、乙酸乙酯等极性溶剂中。在水溶性上，与大豆异黄酮的结构有关，游离形 式的葡萄糖苷配基( a g l u c o n e ) 水溶性最差，基本不溶于水，葡萄糖苷( g l u c o s i d e ) 和丙二酰基配糖体或乙酰基配糖体( c o n j u g a t e dg l u c o s i d e ) 一般则易溶于水，但 g l u c o s i d e 中的g e n i s t i n 在水中的溶解度与温度有关“，水中的溶解度在4 j o 之间没有明显变化，在7 0 。c 9 0 。c 其溶解度随温度的升高而显著增加。因此， 用水溶液提取大豆异黄酮，温度应超过7 0 。 1 1 3 化学性质 大豆异黄酮中的c o n u g a t e dg l u c o s i d e 在加热和碱性条件下可水解去掉丙二 酰基和乙酰基而转化成g l u c o s i d e 。碱水解条件p h 值为8 1 3 ，水解程度随p h 值升高而加大。大豆异黄酮中的g l u c o s i d e 在强酸高温或酶存在的条件下可水解 去掉葡萄糖而转变成a g l u c o n e 形式，从而提高其生理活性。 水解反应过程；n t 图： 茂糖体 c 也o c o c h ， 图1 2 异黄酮碱水解 4 浙江夫学顺上论文( 2 0 0 4 ) 水解转化关系如下 1 1 3 生理活性 碱水解o 乏盛基 酸水虮去葡萄糖基 v a g l u c o n e 近年来，通过体外和流行病学的研究结果显示，东南亚国家食用大豆和豆 制品中的异黄酮含量比欧美国家要高很多，因此他们乳腺癌和结肠癌发病率较 低。越来越多的研究表明异黄酮具有许多重要的生理活性。如抗氧化性，抑制癌 细胞，降低血脂，抗前列腺癌和前列腺肿瘤。防治更年期妇女头痛、骨质疏松、 更年期紊乱等症状。异黄酮具有雌性荷尔蒙的作用，被称作为一种植物雌激素。 随着生活水平的提高，人们越来越重视身体的保健。大豆异黄酮对人体生 理代谢有益调节和对某些疾病的防治作用以及丰富的大豆资源，为其开发利用展 示了广阔的前景。 大豆异黄酮作为一种重要的生理活性物质，是人体生理生化过程中不可缺少 的成分，它对调节人体新陈代谢、预防中老年病症等有一定的作用。研究表明， 大豆异黄酮的主要作用表现在以下几个方面：( 1 ) 调节雌激素的作用；( 2 ) 抑制 与癌相关酶活性的作用，特别是阻止酪氨酸激酶活性的作用；( 3 ) 消除活性氧， 从而具有抗氧化作用；( 4 ) 调节细胞周期的作用；( 5 ) 在癌细胞增殖的促进阶段， 具有阻止血管增生作用；( 6 ) 抗乳腺癌和前列腺癌的作用等。 大豆异黄酮的这些作用在医学及临床上表现为：( 1 ) 可以防治骨质疏松症； 研究发现，大豆异黄酮在一些动物和人体试验中具有对骨组织密度的阳性效应 扩大骨质形成，减少骨质丢失，从而可改善骨质。( 2 ) 可以改善女性更年期综 合症；临床调查显示，日本女性更年期综合症与欧美国家女性相比较，其症状较 轻，这是因为日本女性血液中异黄酮类物质含量高于欧美国家的女性，而大豆异 浙江人学坝l 一论艾( 2 0 0 4 ) 黄酮能够缓解因雌激素分泌不平衡所形成的临床症状。( 3 ) 可以防护冠心病和 心血管疾病；研究表明，大豆异黄酮可以降低血液中的l d l 胆固醇而不降低h d i 胆固醇，而l d l 胆固醇的氧化是动脉硬化过程的关键因子，并且它能够改变粥样 动脉硬化的血流变动力学和作为多种慢性新生血管疾病的治疗剂。( 4 ) 可以降 低癌症的发生率；在癌症研究领域，大豆异黄酮、染料木黄酮和黄豆苷元得到了 科研人员的广泛关注，许多研究表明大豆异黄酮与各种癌症之间存在着一定的 联系，其对乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和白血病有明显的治疗作用。 大豆中的异黄酮存在形式主要是配糖体，而它的配基( a g l y c o n e ) 形式所 表现出来的活性要比其配糖体( g l u c o s i d e ) 高得多，活性比较如表l - 2 。 表卜2 异黄酮生理活性比较 生理活性效果 类雌激素活性 抗氧化活性 抗癌活性 g e m s t e i n d a i d z e i n g e n i s t i n ，d a i d z i n 抗骨疏松症g e n i s t e i n g e n i s t i n 大豆异黄酮的糖苷配基型( a g l y c o n e ) 生物活性最高。1 2 种大豆异黄酮中，主 要活性成分为两种含量较高的苷元成分：染料木素和黄豆黄素。此外，异黄酮的 不同形式其在生物体内的吸收也不同，其配糖体几乎不被吸收，而只有转化为配 基形式才能被吸收。可见，如何转换大豆中的异黄酮形式是发挥它生理活性的关 键。 1 2 提取工艺 原料应是事先经过脱脂的，如大豆粉、大豆粕、脱脂大豆等，原料粒径最好 在0 5 0 8 m m ，最大不超过l m m 。粒径过大，给提取造成困难；过小，则粉末 度过高，给后续分离操作带来困难a m 三 伦 比 幽 阿姚蛐咖 ：堇 驴 驴 。 蚰 m m 试 m m 萨曲 妇 舻 r r r r e e e e 吼 吐 吼 啦 m m m m 黔 鲫 萨 舻 浙江大学顺卜论文( 2 0 0 4 ) 文献报道的仞步提取方法主要有碱提取酸沉淀法、有机溶剂提取法和c 0 2 超 临界萃取，而较常用的为溶剂提取法。溶剂提取法所采用的溶剂有乙醇、甲醇、 丙酮和弱碱性水溶液。提取物中除异黄酮外还有油脂、蛋白质、纤维素、单糖、 多糖等杂质。 1 2 1 甲醇提取 在5 0 - - 6 0 。c 条件下用甲醇提取两次，每次提取时间为3 0 m i n ，料液比( 质量： 体积) 为1 ：1 ，可得含量为1 5 的g e n i s t i n 和含量为1 3 d a i d z i n 粗提物。 也有文献报道甲醇提取之后用醋酸铅沉淀杂质，再用硫化氢除铅。甲醇提取步 骤繁琐，甲醇、硫化氢以及重金属盐醋酸铅均为有毒物质，不符合环保安全要求， 不适合大规模工业生产。 1 2 2 丙酮提取”7 丙酮对异黄酮溶解具有良好的选择性，可使乙醇提取物中大部分杂质不被溶 解而除去，异黄酮则部分或全部溶解于丙酮中，而且可以在室温下进行。文献报 道丙酮加酸的提取方法能使异黄酮含量提高到2 5 6 ，可以用于精制过程。虽 然丙酮对异黄酮溶解具有极强的选择性，但是初步提取大剂量使用丙酮显然是不 经济的，因此考虑精制阶段使用丙酮。 1 2 3 乙醇提取6 1 巾2 1 考虑后续操作的难易程度、操作成本以及溶剂毒性等因素，最常用的是乙醇 水溶液，其次为弱碱性水溶液。从经济性和工艺优化角度考虑，主要确定乙醇提 取的浓度、用量( 料液比) 、提取温度及时间等因素。总结得，乙醇浓度为4 0 8 0 ，溶剂与原料比为( 8 1 6 ) ：l ( 体积m i 重量g ) ，提取温度4 0 。c 9 0 c ， 提取次数1 3 次，提取时间l h l o h 。也有文献报道，大豆异黄酮最佳提取条 件为：8 0 乙醇，料液比大于1 ：1 8 ，时间l h ，温度不超过5 0 。c 提取一次， 洗涤一次；乙醇7 0 ，料液比l ：5 ，提取时间1 h ，温度5 0 。c ，浸提2 次，其 一塑坚叁兰里：! 笙苎! ! ! 坚! 提取回收率可达9 5 咀上。 1 2 4 碱提取酸沉淀法“o 该法比较简单t 将大豆粉末浸泡在弱碱性水溶液中，提取一段时间后加酸调 节p i 值到蛋白质等电点，使之沉淀成凝乳状物，分离后得到液相提取物。所用 弱碱性水溶液与大豆粉末的比为8 ：1 - 1 6 ：i ( v ：w ) ，溶液p h 值在6 7 9 7 比较好， 等电点处p h 值为4 4 - 4 6 。提取时间为2 - 4 小时，温度3 2 5 5 。c 。蛋白质沉淀可 通过过滤或离心分离去除。采用弱碱性水溶液提取的杂质比较多，一般用于综合 利用回收蛋白质等工艺。 1 2 5 c 0 。超临界萃取阳 c 0 2 超i 临界萃取是采用c o ：做溶剂，超临界状态下的c 0 ：流体的密度和介电常 数较大，对物质溶解度很大，并随压力和温度的变化而急剧变化，因此，不仅对 某些物质的溶解度有选择性，且溶剂和萃取物非常容易分离。利用大豆中异黄酮 与其它组分溶解性的差异，采用超临界c o z 萃取是一个可行的办法。提取条件如 下：压力2 0 0 3 0 0 b a r ，温度4 0 。c 7 0 。c ，c 0 2 用量5 5 2 9 ，流速1 o m l m i n ，改性 剂体积0 ，2 4 或4 8 ( 摩尔百分数分别为0 ，5 或1 0 ；n = 2 ) 。先静态提取1 0 m i n 再动态提取2 0 m i n ，总共提取3 0 m i n ，提取三次。结果发现温度对g e n i s t i n 和 g e n i s t e i n 的影响显著，压力对d a i d z e i n 的影响显著。对总异黄酮而言，最佳提取 条件为：温度5 0 4 c ，压力3 6 0 b a r ，但是所得总异黄酮浓度低于其它提取方法如 超声提取。 1 3 异黄酮精制 大豆胚芽粗提取物中除含有大豆异黄酮j l - ，还含有较多的杂质如蛋白质、单 糖、多糖等，为获得较高纯度的大豆异黄酮苷产品，需进一步精制去杂。总结文 献、n ，精制方法有超滤膜法、吸附法、柱层析法、高效液相色谱法、重结晶 和溶剂萃取法等。现简单介绍： 1 3 1 吸附法 工艺：浸提液- 吸附树脂吸附 解吸干燥 此工艺是采用吸附树脂吸附浸提液中的大部分大豆异黄酮，洗脱去除浸提液 中的蛋白质、单糖、多糖及其他物质，从而达到提纯大豆异黄酮的目的。解吸液 解吸后进行干燥，可得4 0 9 0 的大豆异黄酮。 有人。用合成树脂d i a i o n h p 2 0 和o d s 结合使用，分离得到 m a l o n y l d a i d z i n 和m a l o n y l g e n i s t i n 。3 k g 大豆粉术用碱提取酸沉淀法提取得萃日提 物溶液，以1 l h 速度过柱( d i a i o n h p 2 0 ，5 2 1 5 c m ) ，吸附丙二酰基异黄酮 葡萄糖苷( m a l o n y l i s o f l a v o n eg l y c o s i d e ) ，然后用2 l 蒸馏水洗涤。洗脱液为：5 乙醇溶液2 l ，1 0 、2 0 、3 0 、4 0 乙醇溶液各3 l ，5 0 乙醇溶液2 l 。洗脱液 以1 l 为单位分瓶收集。通过高效液相色谱检测洗脱液的异黄酮分别得到 m a l o n y l d a i d z i n 和m a l o n y l g e n i s t i n 的洗脱液，含量分别为1 6 1 9 3 k g 大豆和 1 7 6 9 3 k g 大豆。两种洗脱液p h 均调至8 ，以3 0 m l m i n 流速过柱( o d s ，4 1 6 c m ) ，o 5 l 蒸馏水洗涤。分别用5 和1 0 的乙醇溶液2 l 洗脱，收集洗脱液， 浓缩冷冻得到m a l o n y l d a i d z i n 和m a l o n y l g e n i s t i n 的钠盐均为1 1 5 9 。 装有聚甲基丙烯酸酯( p o l y m e t h a c r y l a t e ) 的反相柱分离效果比较好”3 。1 8 l 甲 醇粗提物溶于水，甲醇浓度约为2 0 。以适当条件过柱( 4 7 0 c m ) ，洗脱液为 5 0 、6 0 、7 0 的甲醇溶液各5 倍于柱体积。2 8 4 1 倍柱体积的洗脱液( 5 0 甲醇) 可洗脱得到d a i d z i n ，6 3 8 0 倍柱体积洗脱液( 6 0 甲醇) 可洗脱得到 g e n i s t i n ，1 1 9 1 3 3 倍柱体积洗脱液( 7 0 甲醇) 可洗脱得到g l y c i t e i n 。d a i d z i n 回收率可达8 2 ，g e n i s t i n 的回收率达8 1 。 1 3 2 超滤膜与吸附树脂相结合 工艺：浸提液+ 超滤膜吸附解吸干燥 该法用超滤膜去除部分杂质，但是单独使用超滤膜来精制，则得到的大豆异 黄酮纯度在1 2 ，因此要与吸附树脂相结合，同时也可减轻树脂的负担。超 滤膜切割分子量在1 0 0 0 0 左右。g e n i s t i n 在水中的溶解度与温度有关，因此通 过超滤膜的溶液温度最好在8 0 。c 以上，以减少异黄酮的损失。 1 3 3 吸附与溶剂萃取相结合 工艺萃取遗留物_ + 干燥。皂甙 f 浸提液。吸附树腊+ 吸附物+ 溶剂解吸+ 丙酮摹取_ + 摹取物 l 未吸附物- + 酸化1 葛心分离+ 沉淀得蛋白质干燥 l 清液回收多糖人豆异黄酮 这一工艺是对原料综合利用，不仅得到大豆异黄酮，还可得到大豆皂甙、蛋 白质以及水溶液多糖。利用丙酮对异黄酮良好得选择性溶解使浸提液中大部分杂 质出去，从而得到高纯度得大豆异黄酮。 1 3 4 柱层析法 按常规方法将聚酰胺装柱后“，用水淋洗至无杂质并除去气泡。缓缓倒入 含异黄酮糖苷的溶液，以每分钟5 l o m l 的速度通过吸附剂，等液体全部流出后 力水淋洗柱子直至流出液无颜色为止，最后用约两倍柱体积的7 0 乙醇洗脱柱 子上吸附的异黄酮糖苷。所得洗脱液浓缩即得异黄酮粗品，一般含量在1 8 3 0 ，回收率为9 5 以上；在使用乙酸乙酯和8 5 0 乙酸乙酯一甲醇剃度洗 脱聚酰胺柱下，皂甙峰和异黄酮苷峰不能完全分离。 葡聚糖凝胶柱s e p h a d e x - - 2 5 过柱“，5 0 乙醇洗脱可分离得到一个总皂甙 峰和一个总异黄酮峰，分离情况较好。用硅胶柱，9 5 甲醇洗脱，皂甙峰和异黄 酮苷峰相互重叠，分离效果不理想。 1 3 5 离子交换法妇6 用带有磺酸基的极性阳离子交换柱来层析分离得到7 一糖基一异黄酮( 7 - - g l y c o s y l - - i s o f l a v o n e ) ，而蛋白质和其它形式的异黄酮糖苷( g l y c o s i d e ) 被去除 掉。离子交换树脂有如下通式：_ - m s o ，1 - - n a 。 lj 树脂用量5 9 ，膨胀后装柱，柱体积约2 5 m l 。树脂预处理：4 n a 0 h ( 1 m 0 1 ) 溶 液浸泡4 小时，重复操作直到没有杂质、颜色，用相当于柱体积的水洗。再用 3 mh c l 溶液，用量相当于3 4 倍柱体积洗涤，再用相当于柱体积4 5 倍的热水 ( 4 0 ) 洗。重复上述操作。处理完毕就上柱每个柱体积的溶液上柱时间约为1 小时，温度l i 左右。洗脱液为8 6 的乙醇溶液加1 o m 乙酸，每个柱体积用时 1 0 2 0 m i n ，温度3 5 。c 。该作者认为通过该法回收率可达9 5 。 1 4 异黄酮的水解及纯化 欲制得高纯度游离态异黄酮，需要将过柱或水解得到的产品( 纯度3 0 6 0 ) 进一步纯化，主要通过结晶来实现。可以结合丙酮萃取来进行纯化。 将含有游离态异黄酮的粗品溶于丙酮，5 0 6 0 。c 水浴搅拌回流1 小时，趁热 过滤，去渣，滤液在4 。c 下结晶2 0 小时以上。也可通过分步结晶得到d a i c l z e i n 和g e n i s t e i n 。一次结晶回收率在7 5 以上，纯度超过9 5 。一般需要反复多次结 晶才能得到高纯度的游离态异黄酮。 从大豆异黄酮的生物活性来看，如何提高游离型大豆异黄酮( 即营元形式) 的含量是关键。现工业上一般采用水解法制各大豆异黄酮苷元“。1 。大豆中异黄 酮糖苷有三类：大豆异黄酮b 一葡萄糖昔、6 ”一o 一丙二酰基葡萄糖苷和6 ” 一o 一乙酰基葡萄糖苷。其中6 ”一o 一丙二酰基葡萄糖苷含量最多，占总量得 5 5 6 5 。大豆异黄酮配糖体( 糖苷) 的水解可分为3 步：第一步，6 ”一0 一 丙二酰基葡萄糖苷水解为乙酰基葡萄糖昔；第二步是乙酰基葡萄糖菅再水解为8 一葡萄糖苷；第三步，1 3 一葡萄糖苷水解为大豆异黄酮菅元。前两步水解容易进 行，高温、弱碱性和弱酸性条件下都可水解，比较而言，弱碱性和高温条件下水 解较快。第三步1 3 一葡萄糖苷水解为大豆异黄酮苷元就需要较高条件，通常采用 高温低p h 值和酶水解。酸水解主要用盐酸获得苷元，多采用较浓的盐酸( 如1 3 m o l l - t ) ，较高温度( 9 8 c 1 0 0 c ) ，但强酸条件下不易进行工业化。酶水解 主要水解酶为1 3 一葡萄糖苷酶。 浙江大学顽l 论文( 2 0 0 4 1 4 1 丙二酰基葡萄糖苷的水解“3 p h 值越高则需水解温度越低，水解时间也就越短。在p h = 1 1 ，t = 3 5o c 条- 件下，水解时间只要4 5 m i n 左右，n - 酰基葡萄糖苷几乎全部水解成b 葡萄糖 苷。在p h = 9 条件下，需水解温度t = 7 3 。c , ，水解时问则需要4 6 h 。在高温条 件下水解的过程，粗提物的水溶液在8 0 e 水浴中水解1 j 小时，丙二酰基葡萄糖 苷由水解前的8 0 下降到0 4 。 1 4 2 b 一葡萄糖苷的水解“” 专利报道了d 一葡萄糖苷的酶水解。认为酶水解的原理是：能够使1 4 一 g l u c o s i d e 键断开，即异黄酮部分( i s o f l a v o n em o i e t y ) 与葡萄糖苷中葡萄糖分子之 间的配糖键( g l u c o s i d i el i n k a g e ) 断裂。文献选用四种不同酶( g z y m e9 9 0 ， b i o p e c d n a s ej 0 0 l ，l a c t a s e5 0 0 0 0 ，a l p h a g a l6 0 0 l ) 作比较，酶的用量为原料干 重的1 0 ，温度保持在5 0 。c ，6 小时，p h 调至4 5 。发现a l p h a g a l6 0 0 l 型酶 几乎可将三种类型的葡萄糖昔完全水解。 酶水解的报道很多，但是所介绍的酶水解效率不是很高”。如选用 b i o p e c t i n a s ei o o l ，用量0 2 9 酶1 0 0 9 粗提液，p h = 7 ，4 5 。c ，水解时间2 2 小时， 三种异黄酮得率都接近1 0 0 。也有介绍两种酶混用。“( p g l u c a n a s e b x y l a n a s e ) ，常温水解，回收率在9 5 以上，可水解时间仍需1 8 小时。 也有用强酸水解得到游离态异黄酮的专利报道”。该专利作者将4 7 0 m lh c i 加到9 8 7 3 m gd a i d z i n 中，1 0 0 c 反应5 小时，回收率可达9 2 。同样的物料比 和水解条件对g e n i s t i n 进行水解，回收率可以达到9 6 。用硫酸水解，水解液 硫酸浓度不超过5 ，乙醇浓度大于5 0 ，8 09 c 水治中水解2 0 小时，葡萄糖苷 异黄酮几乎全部水解完全。 1 5 大豆异黄酮提取分离工艺的综合评价 ( 1 ) 碱提取酸沉淀法操作简单，但碱液不适合全酯大豆粉的提取，沉淀蛋白质的 时候会带走部分异黄酮，回收率偏低。酸沉淀时与碱反应有盐生成，可能会 给后面的分离提纯带来不便。提取的杂质较多，且污染严重，一般用于综合 浙江大学砸士论文( 2 0 0 4 ) 利用回收蛋白质等工艺。 ( 2 ) 甲醇提取之后用醋酸铅沉淀杂质，再用硫化氯除铅的方法溶剂用量少，但步 骤繁琐，甲醇、硫化氢以及重金属盐醋酸铅均为有毒物质，不符合环保安全 要求，不适合大规模工业生产。 ( 3 ) 丙酮对异黄酮溶解具有极强的选择性，但是初步提取大剂量使用丙酮显然不 是很经济，可以在后面的纯化阶段使用丙酮。 ( 4 ) 乙醇是即经济又安全的提取溶剂，设备简单，易于生产，但仍需考虑其浓度、 用量以及提取时间、温度、次数等因素，以获得最优提取参数。 ( 5 ) 超临界c 0 2 提取法存在设备要求高、提取率低、选择性较差等缺点，尚不具 备工业应用价值。 ( 6 ) 高温条件下丙二酰基葡萄糖苷的水解操作简单，但需要时间较长温度较高； 碱性条件水解可在接近常温下进行，且所需时间很少，需要中和过量碱，有 盐生成，可能会给后期分离纯化带来不便。 ( 7 ) 强酸水解0 一葡萄糖苷需要时间少。回收率高但所需温度较高，酸消耗量 也大；酶水解所需时间少，回收率高，所需温度较低，但所需酶的用量太多， 成本太高。二者共同的缺点在于降低酸酶的用量则水解完全所需时间大大增 加。 ( 8 ) 超滤膜法能够去除一定的杂质，但超滤膜本身并不过关，单独使用不理想， 可以与吸附结台使用：聚酰胺层析柱对皂甙和异黄酮分离效果较差；葡聚糖 凝胶柱分离效果好，但价格太贵，不适台大规模生产。离子交换柱的预处理 和洗脱过于繁琐。 ( g ) 聚甲基丙烯酸酯( p o l y m e t h a c r y l a t e ) 的反相柱分离效果比较好，能够分离得 到g e n i s t i n 、d a i d z i n 和g l y c i t e i n ，但是要用甲醇洗脱。 1 6 分析方法 大豆提取物中大豆异黄酮的含量是产品质量的关键指标之，也是大豆异黄 酮产品研究开发中首先必须解决的问题。对于大豆异黄酮总量的测定，可选用紫 外分光光度计法。而大豆异黄酮中各种成分含量的测定方法目前主要有比色法、 纸层析法、薄层色谱法、气相色谱法、h p l c 法等。 浙扭大学埘七论史( 2 0 0 4 ) 比色法干扰多，专一性差，测定结果偏差较大，并需要进行较为复杂的样品 前处理；纸色谱法及薄层色谱法存在分离效果差，定量不准确等缺点；气相包谱 法采用的是样品衍生后进行测定，存在操作繁琐，条件不易控制、杂质干扰严重 等问题。 1 9 7 8 年w e s t 首次报道了h p l c 法分离异黄酮，随后h p l c 法已经测定了葛 根、大豆和其他植物的异黄酮，已成为测定异黄酮含量的主要方法。 1 6 1 薄板层析法 薄层扫描法具有取样量少，操作简便，分离效果好等优点，但其薄层显色剂 用量难以准确控制，人为误差较大。赵胜利l 等，采用硅胶g 薄层板，以氯仿 一甲醇一乙酸乙酯一水( 2 ；2 ：4 ：1 ) 为展开剂展开，以盐酸羟胺一硝酸铈铵为显 色剂，选用4 4 0 n m 滤光片扫描测定了大豆黄素的含量。赵世萍“却等采用硅胶g 薄层板以甲苯一甲醇- - 1 0 甲酸( 7 ：3 ：0 0 2 ) 和醋酸乙酯甲醇一5 0 甲酸 ( 8 ：2 ：0 2 ) 为展开剂分离了大豆苷元、大豆苷等4 种成份，采用双波长反射锯 齿扫描法测定了4 种成份的含量。 运用这种检测方法，样品的处理及检测过程简单，可适用于大豆异黄酮生产 过程的中间物料和无精度要求的产品检测，能较好地进行定性分析，但定量检测 精度不高。 1 6 2 紫外分光光度计法 根据异黄酮类化合物在2 5 0 2 7 0 n m 紫外区有特征吸收，测定最大吸收波长 在2 5 0 n m 。所用仪器为紫外可见分光光度计，1 0 m l 容量瓶，试剂为9 5 乙醇。 操作方法如下2 ： 以葛根素为标准样品用9 5 乙醇稀释配制成每m l # 异- n n ( 葛根素) 为0 ， 2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 m g 的标准液于l o m l 容量瓶中。用0 5 c m 的石英比色皿在分光光 度计上2 5 0 衄处测定吸光值。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线。 以9 5 乙醇作空白，测得2 5 0 n m 处样品吸光度值，根据标准曲线可查得样品中 浙江大学顾上论文( 2 0 0 4 ) 异黄酮含量。 此方法可以定量计算出样品中总异黄酮的含量，但无法判断样品中各组分的 构成情况，如果样品中含有葛根黄酮或其他黄酮类化合物，紫外分光光度法将无 法检出。 1 6 3h p l c 双标样分子系数法“o 在参照文献报道关于利用h p l c 检测大豆异黄酮的基础上，以染料木素和大 豆黄酮为标