（生理学专业论文）促减数分裂甾醇对小鼠卵母细胞减数分裂的作用研究.pdf

摘要 哺乳动物卵母细胞从开始形成到生比成熟和减数分裂过程是密不可分的。在体内，卵原 细胞会停止有丝分裂、启动并进入减数分裂而转变为卵母细胞，进而被周围的体细胞包围形成卵 泡。卵母细胞减数分裂随之停滞于第一次减数分裂的前期，在卵泡中通过漫k ：的生k | 发育过程后 在一定的刺激条件f 才恢复减数分裂而成熟。口j 此减数分裂恢复的调控研究对于了解卵母细胞的 形成、生长发育乖j 成熟都楚至关重要湘。姓减数分裂甾醇( m e i o s i s - a c t i v a t i n gs t e r oj ，m a s ) 能诱 导体外培养的卵母细胞恢复减数分裂成熟，冈此自从m a s 被发现以米就引起了研究者的注意 但是对于其具体的作用和机制还在争议之中，鉴丁i 此本文探讨了m a s 对小鼠卵母细胞减数分 裂启动和恢复的调节作用。 m a s 有两种即f f m a s ( f o i l i c mf l u i d m e i o s i sa c t i v a t i n gs t c r 0 1 ) 和t - m a s ( t e s t i s m e i o s i s a c t i v a t i n gs t e r 0 1 ) 。都是胆嗣醇生物合成途径中的中间产物f f - m a s 由羊毛甾醇1 4 a 脱甲基酶 ( c y p 5 1 ) 合成，然后由a 1 4 还原酶进一步转化为t - m a s ，在卵巢中主要积累f f m a s 。抑制 c y p 5 1 酶的抑制剂。如a z a l a n s t a t ( r s 2 1 6 0 7 ) 和r s 2 1 7 4 5 等，均能抑制m a s 的合成，降低m a s 的积累；而抑制1 4 还原酶的抑制剂，如a y 9 9 4 4 a ，7 等，能抑制f f m a s 向t - m a s 的转化而造 成f f m a s 的积累：还有一些物质，如制霉菌素，能阻止m a s 向下游的代谢而造成其积累，本 文主要通过应用这些物质降低、或增加组织细胞中内源性m a s 的积累来研究m a s 的作用。 首先利用小鼠胚胎卵巢的体外无血清培养模酗，培养妊娠1 4 天( 1 4d a yp o s t - c o i t u s ，1 4d p c ) 小鼠胚胎卵巢，分z u 添加能促进m a s 积累的a y 9 9 4 4 制霉菌素，和能抑制m a s 产生的r s - 2 1 7 4 5 进行处理，结果表明：o 0 2 5 、o 0 6 2 5 和0 1 2 5p m 的a y 9 9 4 4 - a - 7 与2 5 、5 0 和7 5i u m l 的制霉菌 素能显著提高卵巢中形成卵泡的总数蟥，但是对生长卵泡数和卵泡直径的作用不同；而m a s 合 成抑制剂r s 一2 1 7 4 5 能够显著降低形成卵泡的总数量。由于卵泡的形成发生在卵母细胞减数分裂 的启动之后。以上由于m a s 积累提高卵泡形成的总数但对卵泡生长并无显著作用的结果提示， m a s 可能对与卵泡形成有关的过程进行调转，即可能促进了卵原细胞启动减数分裂转变成卵母 细胞，进而促进了卵泡的形成。 其次，建立了两个小鼠卵泡的短期无血清培养模型。模型l ，从未经促性腺激素处理的未性 成熟小鼠卵巢中取出的卵泡，在体外培养2 4h ；模型i i ，从经过促性腺激素e c g 处理后的未性成 熟小鼠卵巢中取出的卵泡在体外培养6h 。根据卵泡的直径人小将卵泡分缀，分别为1 0 0 - 1 7 0p m 、 1 8 0 2 0 0u i n 、2 1 0 2 5 0u m 、2 6 0 3 5 0i x m 乖“3 6 0 4 0 0 “m 等5 纽。分别添加促性腺激素如f s h 和h c g ， 并添加a z a l a n s t a t 和r s 2 1 7 4 5 ，以及a y 9 9 4 4 一a 7 处理培养的卵泡，研究它们对卵泡包裹的卵母 细胞( f o l l i c l e e n c l o s e do o c y t e s ，f e o s ) 哟碱数分裂成熟以及退化死亡率的影响。在模型i 中，f s h ( o 0 1 0 2i u m 1 ) 和a y 9 9 4 4 一a 一7 ( 5 、2 5 年5 0p m ) 单独处理都能诱导卵泡直径为1 8 0 - 4 0 0p m 的 f e o s 恢复减数分裂成熟。对卵泡直径为2 6 0 4 0 0u m 的f e o s ，h c g ( 1 0 ，1 0i u m 1 ) 显示了和f s h 相似但相对较弱的作用。舀：模型i i 中，f s h ( o 0 5 0 i u h n l ) 或h o g ( 1 0 i u l m l ) 单独使用都能提 高卵泡赢径为2 6 0 - 4 0 0p m 的f e o sf 1 勺g v b d 发生率。但h c g 处理组和对照组著异不显著。f s h ( o ，0 5 0i u m 1 ) 和h c g ( 1 0i u l m l ) 结合使h j 结果显示它们对提高f e o s 的g v b d 发生率具有协调 效应。添加r s - 2 1 7 4 5 ( 5 0 、1 0 0i x m ) 利a z a l a n s t a t ( 5 0p m ) 能显著抑制f s h 诱导的、或者f s h 和h c g 共同使用所诱导的f e o s 的减数分裂恢复。 l l 随后。使用免疫组化分析方法对c y p 5 l 蛋白在小鼠卵巢、体外培养的卵泡中的分布和表达 进行了检测。结果表明。在未经e c g 处理的未性成熟的小鼠卵巢中。c y p 5 1 蛋白在间质细胞和 膜细胞中表达较高其它细胞中仅有背景水平表达：经过e c g 处理后，c y p 5 1 蛋白在卵匠细胞、 颗粒细胞中表达升高，而在经过随后h c g 的处理后c y p 5 l 蛋白的表达继续增加。在黄体细胞 中c y p 5 l 蛋白表达也较强。在各个处理和各级的卵母细胞中，卵母细胞中仅有背景水平的c y p 5 1 蛋白表达。从来经e c g 处理的术性成熟小鼠中取出的卵泡经过2 4h 培养后，f s h ( o 0 5i u m 1 ) 处理组的卵泡中卵丘细胞利墅层颗粒细胞c y p 5 1 蛋白表达水平要明显高于h c g ( 1 0 i u m 1 ) 处理 组的和对照组的。从经e c g 捌激的小鼠卵巢中取出的卵泡培养6h 后f s h 和h c g 也能促进c y p 5 1 的表达。以上抑制剂能抑制促性腺激素诱导的f e o s 减数分裂成熟，和c y p 5 1 蛋白在卵匠细胞和 颗粒细胞中的表达受促性腺激素的诱导的结果，提示m a s 介导了由促性腺激素诱导的小鼠卵母 细胞的成熟。 利用卵母纲胞力发减数分裂成熟模型，还探讨了m a s 在小鼠卵丘包裹的卵母细胞( c e o s ) 白发成熟过程中的可能作_ 【 i 。结= 累显示在不引起c e o s 显著退化或死亡的浓度范围内，a z a l a n s t a t ( 1 4 0 州) 和r s - 2 1 7 4 5 ( 1 - 5 0l a m ) 均呈剂量依赖性地降低小鼠c e o s 的g v b d 发生率，在高 浓度。4 0p ma z a l a n s t a t 和5 0g mr s 2 1 7 4 5 几乎阻断了c e o s 的减数分裂恢复。而a y 9 9 4 4 - a 7 ( 5 1 0 0p m ) 不能显著影响c e o s 的g v b d ，甚至在引起c e o s 的显著退化和死亡的高浓度时 ( 5 0 - 1 0 0g m ) 也如此。免疫荧光染色表明，该模型中培养的卵丘卵母细胞复合体，c y p 5 1 主要 表达在颗粒细胞中。而卵母细胞中仅有背景水平的表达。w e s t e r nb l o t 分析显示，在自发成熟模型 中培养的开始2h ，在卵丘卵母细胞复合体中的卵丘细胞c y p 5 1 的表达呈时间依赖性增高，2h 后下降，有意思的是，c y p 5 1 表达的这种变化和该模型中的c e o s 自发成熟动力学曲线斜率变化 基本一致。这些结果提示m a s 也参与了小鼠c e o s 体外自发减数分裂成熟，由卵丘细胞产生的 m a s 可能作为一种诱导减数分裂的信号。 最后，使州气谱质谱联j l l j 的分析方法，检测了f s h 诱导体外h x 阻滞的小鼠c e o s 发生减 数分裂过程中f f - m a s 的产量变化结果发现在f s h 处理1 0b 时，c e o s 的g v b d 发生率和h x 阻滞的对照组的g v b d 率都低于2 0 ，此时，f s h 处理体系中f f m a s 浓度约为8 1p m ，而对 照组的仅为3 2h m ；当f s h 处理1 2h 时。g v b d 率达到约5 0 时f f m a s 浓度上升到1 2i x m 。 这一结果表明f f m a s 确实在f s h 诱导小鼠c e o s 减数分裂成熟过程中升高了。 以上的这些结果综合分析，支持m a s 是胚胎卵巢分泌的促减数分裂的物质的假说，m a s 可能通过促进卵原细胞启动减数分裂转变成卵母细胞进而促进卵泡的形成：在卵母细胞恢复减 数分裂成熟的过程中卵丘细胞在促性腺激素刺激下，或在自发成熟的培养条件下，分泌m a s 作为阳性信号分子诱导卵母细胞恢复减数分裂而成熟。 关键词：促减数分裂甾酵，卵母细胞，减数分裂 i l l a b s t r a c t t h ep r o c e s so fm a m m a l i a no o c y t ef o r m a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n dm a t u r a t i o nw a sap r o c e s so f m e i o s i sc o n t r 0 1 i nf e t a lg o n a d ，o o g o n i ab e c o m et op r i m a r yo o c y t e sb yb e g i n n i n go ft h ef i r s tm e i o s i s , a n do o c ”e sw i l lb ee n c l o s e db yo v a r i a ns o m a t i cc e l l sa n df u r t h e rf o r mt h ep r i m o r d i a lf o l l i c l e s h o w e v e r , t h eo o c y t e sw i l la r r e s tt h ef i r s tm e i o s i sa tp r o p h a s ei nt h e i rf o l l i c l e s a f i e ra l o n gd e v e l o p m e n ta n d a c q u i r i n gt h em e i o t i cr e s u m p t i o nc o m p e t e n c e ，o o c y t e si np r e o v u l a t o r yf o l l i c l e sw i l lr e s u m em e i o s i st o m a t u r eu n d e rt h es t i m u l a t i o no fp r e o v u l a t o r yg o n a d o t r o p i n ss u r g e t h u s ，i ti sh i g h l yi m p o r t a n to ft h e r e g u l a t i o no fm e i o s i st ot h ef o r m a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n dm a t u r a t i o no fo o c y t e s m e i o s i s - a c t i v a t i n g s t o r o l ( m a s ) w a sf o u n dt oi n d u c et h em e i o t i cr e s u m p t i o no fm o u s eo o e y t e s ，t h u s ，t h ef u n c t i o no fm a s a t t r a c t e da t t e n t i o no fm a n ys c i e n t i s t s h o w e v e r , i ti sa p r o b l e ma tp r e s e n t i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t so f m a so nt h em e i o s i so f m o u s eo o c y t e s m a sw e r ef i r s tp u r i f i e da n di d e n t i f i e db yb y s k o va n dh e rc o l l e a g u e s ，m a sf r o mh u m a nf o l l i c l e f l u i dw a st e r m e db yf f - m a sa n dm a sf r o mb u l lt e s t i st i s s u ef l u i dw a st e r m e db yt - m a s f f m a s a n dt - m a sb o t hw e r ei n t e r m e d i a t e si nt h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fc h o l e s t e r o li nm a m m a l s f f - m a s w a s s y n t h e s i z e db yl a n o s t e r o l1 4 a - d e m e t h ) 7 l a s e ( c y p 5 1 ) a n df u r t h e re o n v e a e dt ot - m a sb y a 1 4 - r e d u c t a s e i n h i b i t o r so fc y p 5 l ，s u c ha sa z a l a n s t a t 限s - 2 1 6 0 7 ) a n dr s 一2 1 7 4 5 ，c o u l di n h i b i tt h e s y n t h e s i so ff f - m a st od e c r e a s et h ea c c u m u l a t i o no ff f m a s i n h i b i t o ro fa 1 4 - r e d u c t a s e ，s u c ha s a y 9 9 4 4 - a - 7 ，c o u l di n h i b i tt h em e t a b o l i s mo ff f m a st oi n c r e a s et h ea c c u m u l a t i o no ff f - m a s ；a n d s o m eo t h e rr e a g e n t s ，s u c ha s n y s t a t i n ，c o u l dc o m b i n ew i t ht h ed o w n s t r e a mi n t e r m e d i a t e i nt h e c h o l e s t e r o lb i o s y n t h e s i sp a t h w a yt oa c c u m u l a t em a s i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h er o l eo f m a sb y u s i n g t h e s er e a g e n t s t oc h a n g e t h e l e v e lo f e n d o g e n o u sf f m a s u s i n gt h em o u s ef e t a lo v a r ys e r u m f r e ec u l t u r em o d e l ，f e t a lo v a r i e sf r o m1 4d a yp o s tc o i t u s ( 1 4 d p e ) m o u s ew e r ac u l t u r e d ，a n dt r e a t e db ya y 9 9 4 4 - a - 7 ，n y s t a t i na n dr s 一2 1 7 4 5 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t o 0 2 5 0 0 6 2 5a n d0 1 2 5 t ma y 9 9 4 4 - a 7o r2 5 5 0a n d7 5i u m ln y s t a t i ni n c r e a s e dt h et o t a ln u m b e ro f f o l l i c l e sp e ro v a r ys i g n i f i c a n t l y ；h o w e v e r , a y 9 9 4 4 一a - 7a n dn y s t a t i na tt h es a m ed o s e sc o u l d n tc a u s e t h es a m ee f f e c to nt h en u m b e ro fg r o w i n gf o l l i c l e sa n dt h ea v e r a g ed i a m e t e ro ff i v el a r g e s tf o l l i c l e sp e r o v a r y 5 0 州r s - 2 17 4 5d e c r e a s e dt h et o t a ln u m b e ro ff o l l i c l e s ，t h en u m b e ro fg r o w i n gf o l l i c l e sa n d d i a m e t e ro ff o l l i c l e sp e ro v a r ys i g n i f i c a n t l ya f t e r4 8h 2 51 t mr s - 2 1 7 4 5c o u l dd e c r e a s et h et o t a l h u m b e ro ff o i l i c l e sa sw e l l b u tc o u l d n tm a k eas i g n i f i c a n td i f f e r e n c e t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t m a sc o u l dp r o m o t et h ef o r m a t i o no ff o l l i c l ei nf e t a lm o u s eo v a r i e s ，b u tm a se o u l d n tp r o m o t et h e i n i t i a t i o no ff o l l i c l eg r o v a hi ts t l 鹳e s t e dt h a tm a sp r o m o t eo o g o n i at oi n i t i a t em e i o s i sa n dt ob l x o m e o o c y t e sa n dt h e nt of o r m a tf o l l i c l e s ， i nt h ep r e s e n ts t u d y , t w om o d e l sf o rs h o r t - t e r mc u l t u r eo fi n t a c tm o u s ef o i l i c l e su n d e rs e r u m - f r e e c o n d i t i o n sw e r ee s t a b l i s h e d f o l l i c l e sw e r eo b t a i n e df r o mi m m a t u r em i c et h a te i t h e rh a dn o tr e c e i v e d o v a r i a ns t i m u l a t i o n ( m o d e li ) ( i e w i t h o u tp r e v i o u se c gp r i m i n g ) o rh a du n d e r g o n eo v a r i a ns t i m u l a t i o n ( m o d e li i ) ( i e p r i m e dw i t he c g4 5h o u r sb e f o r eu s e ) ，i nm o d e li ，f o l l i c l e sw e r ec u l t u r e df o r2 4h o u r s a n dt r e a t e db yf s h ( 0 0 1 ，o 0 5a n d0 2i u m 1 ) a n d o rh c g ( o 1a n d1 0i u m 1 ) a n da y 9 9 4 4 - a 7 ( 5 ，2 5 a n d5 0 p m ) f o l l i c l e s w e d ee v a l u a t e da c c o r d i n g t o t h e i rs i z e ，i e 。f o l l i c u l a r d i a m e t e r 0 0 0 1 7 0 t a m ，1 8 0 2 0 0p m ，2 1 0 2 5 0 “m ，2 6 0 3 5 0p ma n d3 6 0 4 0 0p r o ) i nm o d e li i ，f o l l i c l e so f 3 6 0 4 0 0t a mi n d i a m e t e rw c r ec u l t u r e df o r6h o u r sa n dt r e a t e db y0 0 5i u m if s h ，1 0i u m lh c gr s - 2 1 7 4 5 ( 1 ，5 0a n d 10 0p m ) a n da z a l a n s t a t ( r s 2 16 0 7 5 0p m ) i nm o d e l 1 ，f s ha n da y 9 9 4 4 a - 7e a c hi n d u e e d r e s u m p t i o no f m e i o s i si no o c y t e sd e d v e df r o ma l lf o l l i c l es i z e se x c e p tt h o s es m a l l e rt h a n1 8 0p m h c g e x h i b i t e das i m i l a rb u tw e a k e re f f e c to no o c y t em a t u r a t i o n b u to n l yi nf o i l i c l e sw i t had i a m e t e ro f 2 6 0 4 0 0p m i nm o d e li io n l yf s h ( 0 0 5i u m 1 ) b u tn o th c g ( 1 0i u m 1 ) i n c r e a s e dg v b do f f o l l i c l ee n c l o s e d o o e y t e s ( f e o s ) f s h ( o 0 5i u ，m 1 ) c o m b i n e dw i t hh c g0 0i u m 1 ) s h o w e da na d d i t i v ee f f e c tr a i s i n gt h e r a t eo fg v b da f t e r6h o u r so fc u l t u r e a d d i t i o no f5 0o r10 0p mr s 2 7 4 5a t t e n u a t e dg o n a d o t r o p i n s i n d u c e dr e s u m p t i o no fm e i o s i st ob e l o wb a c k g r o u n dl e v e l s 5 0 t ma z a l a n s t a t ( r s - 2 1 6 0 7 ) s h o w e dt h e s a m ee f f e c t o n g o n a d o t r o p h i n s i n d u c e d m e i o t i c r e s u l l i p t i o n o f f e o sa s r s - 2 1 7 4 5 i nt h ef o l l o w i n g w ed e t e c t e dt h ee x p r e s s i o no fc y p 5 1p r o t e i nb yu s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d i ni m m a t u r em o u s eo v a r yw i t h o u te c gt r e a t m e n t ，c y p 5l p r o t e i nw a so b s e r v e do n l yi n i n t e r s t i t i a ia n dt h e t ac e l l s a f t e rs t i m u l a t i o no fe c gc y p 5 1p r o t e i nw a se x p r e s s a di nc u m u l u sc e l l s ， g r a n uo s ac e l l sa n dt h e e ac e l l s ；a f t e rt h es u b s e q u e n ts t i m u l a t i o no fh c gc y p 5 1p r o t e i ne x p r e s s i o ni s e l e v a t o r y , e s p e c i a l l yi nc u m u l u s a n dc y p 5lp r o t e i ni sa l s oe x p r e s s e di nc o r p u sl u t e aw i t hh i 【g hs t a i n i n g c u m u l u sc e l l sa n dg r a n u l o s ac e l l so ff o i l i c l e sf r o mi m m a t u r e m i c ec u l t u r e dw i t h0 0 5j u m lf s hf o r2 4 h e x p r e s s e dv e r yh i 曲l e v e lo f c y p 5 1p r o t e i nc o m p a r e dt o1 0i u m lh c gt r e a t m e n ta n dc o n t r o lg r o u p s i nm o d e li t h er e s u l t so f i n h i b i t o r so f c y p 5 1a n dt h ee x p r e s s i o no f c y p 5 1s u g g e s t e dt h a tm a s ，t h e p r o d u c t i o no f c y p 5 1p r o t e i n ，p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so f g o n a d o t r o p i n s - i n d u c e dm e i o t i c r e s u m p t i o no f m o u s eo o c y t e s t h ep r e s e n t s t u d yi n v e s t i g a t e d t h e p a r t i c i p a t i o n o ff f - m a si nt h es p o n t a n e o u sm e i o t i c m a t u r a t i o no fm o u s ec u m u l u sc e l l - e n c l o s e do o c y t e s ( c e o s ) a sw e l l f u l l yg r o w nm o u s ec e o st h a t w e r ec u l t u r e di nb y p o x a n t h i n e - f r e e ( h x f r e e ) m e d i aw e r et r e a t e db ya z a l a n s t a t ( r s - 2 1 6 0 7 ) r s - 2 1 7 4 5 a n da y 9 9 4 4 一a 一7 i nt h er a n ko fc o n c e n t r a t i o no fw h i c hd i d n tl e a dt h eo o c y t e sd e g e n e r a t i o n ，b o t h a z a l a n s t a t ( 1 4 0r t m ) a n dr s 一2 1 7 4 5 ( 1 - 5 0p m ) d e c r e a s e dt h ep e r c e n t a g eo f g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w nf g v b d lo fc e o si nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r a y 9 9 4 4 - a 7d i d n ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h e g v b dr a t eo fc e o sc u l t u r e di nh x t r e em e d i af o r2ho r4h b u ti ta l s od i d n td e c r e a s eg v b de v e na t h i g hd o s e c a u s e do o c y t e sd e g e n e r a t i o n i m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n gs h o w e dt h a tc y p 5 1p r o t e i n e x p r e s s e di nc u m u l u sc e l l s ，b u tn o ti no o c y t e sc u l t u r e di nv i t r o w e s t e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a t c y p 5 1e x p r e s s i o ni nc u m u l u sc e l l so fc e o si n c r e a s e di at h ef i r s t2hc u l t u r ea n dd e e r e a s e di nt h e f o l l o w i n gp e r i o d ，d r a m a t i c a l l ya c c o r d e dw i t ht h ek i n e t i c so fm o u s ec e o ss p o n t a n e o u sm a t u r a t i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tf f m a sp r o d u c e db yc u m u l u sc e l l sw a sa l s oi n v o l v e di nt h es p o n t a n e o u s m e i o t i cr e s u m p t i o no f m o u s ec e o si nv i t r o ， t h ep r o d u c t i o n so fm a si nt h ep r o c e s so ff s h i n d u c e dm e i o t i cr e s u m p t i o no f h y p o x a n t h i n e a r r e s t e dm o u s ec e o sw e r ed e t e c t e db yg a sc h r o m a t o g r a p h y - u l a s ss p e c t r u m ( o c - m s ) a n a l y s i s t h ec o n c e n t r a t i o n so ff f - m a sw e r e8 1p ma n d3 2 州i nt h ec u l t u r e m e d i u mw h i c hw a ss u p p l e m e n t e dw i t ho rw i t h o u t0 0 5i u m lf s hr e s p e c t i v e l y , w h e nt h eg v b d v p e r c e n t a g e so f c e o s w e r eb o t h l o w e r t h a n 2 0 f o r l 0hc u l t u r e w h e n t h e g v b d p e r c e n t a g e o f c e o s a r r i v e da t5 0 f o r1 2ht r e a t m e n tb yf s h , t h ec o n c e n t r a t i o no ff f - m a sw a s1 2 山m t h e 穗s b s h o w e dt h a tt h ep r o d u c t i o no fm a sw a si n c r e a s e di nt h ep r o c e s so ff s h - i n d u c e dm e i o t i cr e s u m 蛳西 m o u s eo o c y t e s i nc o n c l u s i o n m a sw a si n v o l v e di nt h ec o n t r o lo fm e i o t i ci n i t i a t i o na n dr e s m 1 ) t i o f m o u s eo o c y t c k e y w o r d s ：m e i o s i s - a c t i v a t i n gs t e r o l ，o o c y t e ，m e i o s i s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特另t l d n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：讳媚笔 时间： 伊年年6 月，尸同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业人! 学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：译名i 差 时间： 缈4 年g 月，尸曰 跏虢预、砺 帆俨簟年6 肋日 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s 中陶椒业人学博士学位论文：文献缘述 第一篇文献综述 随着生物技术的迅速发展胚胎下稗技术如动物克隆、转基因动物等现在成了国际上的 研究热点，虽然在这些研究上已经取得了巨人的成功，如多种动物的体细胞克隆成功以及转 基| l i l 动物和基因敲除动物的生产用以研究基闲的功能方面都取得了很多重要的成果；但是。尽 管有损多成功的例子，现阶段无论楚动物的克隆还是转基因，其成功率都非常低。由于无论是 动物克隆、转基冈动物。还是胚胎i 。程有芙的研究与生产，都离不开雌性动物的卵母细胞因 此，造成成功率低f 的原因和目前所采川的卵母细胞晶质不高不无关系。这些卵母细胞只有极 少数来自活体动物，大多数来自于被宰杀的动物性腺，经过体外成熟过程再用于相关研究。 要提高体外成熟卵母细胞的品质。就必须解狄其成熟过程中还存在的问题，例如，促性腺激素 被公认为能诱导卵母细胞的减数分裂成熟但迄今为止其作用机理还不清楚，只有阐明卵母细 胞成熟过程的调控机理，然后有针对性地改进培养体系才能达到提高卵母细胞成熟质量的目的， 而找到一种或多种能够刺激卵母细胞体外成熟及其提高成熟品质的物质一直是国际上的研究重 点。自从促减数分裂甾醇( m e i o s i s a c t i v a t i n gs t e r o l ，m a s ) 被分离鉴定，并被证明能诱导在体 外士立养的小鼠卵母细胞恢复减数分裂成熟以来，引起了许多生殖生物学研究者以及一些生物制 药公司的关注，并进行了一系列相关的研究，本文综述了近年来国内外相关研究及其进展。 第一章促减数分裂甾醇研究进展 第一节促减数分裂甾醇的发现及其背景 在自然界中，生物的生长、发育和繁殖以及各种生命活动，都受到了严格的时空调节和 控制。作为生命延续的纽带，各种动物的配子，其产生过程也同样受到了精确的调控。雌性动 物中，雌性配子，即卵子的产生受到儿次停腱的调控( s t o p g o c o n t r 0 1 ) ( t s a f r i f i 等，1 9 9 4 ) 。 胚胎发育过程中，原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 起源于后肠卵黄囊背侧 的内胚层。例如小鼠的p g c s 在妊娠后第7d 首次出现，人的p g c s 则在妊娠后第3 周首次出现。 随后，这些p g c s 通过阿米巴( a m e b i o d ) 运动，在一些因子的趋向作用下( d ef e l i c i 等综述， 1 9 9 2 ) + 经过背肠系膜和背侧体擘边增殖、一边向原始生殖嵴迁移，小鼠p g c s 约在妊娠后 1 1 5 1 3 5d 、人p g c s 约在妊娠后5 - 6 周到达原始生殖嵴。进入原始生殖嵴的p g c s ，伪足消失， 并进行活跃的有丝分裂增殖。随着性脓的性别分化，在雌性动物中，卵巢内的p g c s 分化成为 卵原细胞( o o g o n i a ) ，卵原细胞在增殖的同时向卵巢皮质迁移。到达卵巢皮质后，卵原细胞停 止有丝分裂增殖，开始启动并进入第一次减数分裂成为卵母细胞( o o c y t e ) ，井被起源于中肾管 的卵巢体细胞所包裹形成原始卵泡。但与此同时，雄性动物性腺中的生殖细胞的减数分裂却 延缓了，通常不到青春期是不会开始的。 利用小鼠胚胎性腺共培养的方法。研究发现胚胎期的卵巢能刺激共培养的胚胎睾丸发生 减数分裂，提示卵巢产生一种减数分裂刺激物，并被称为减数分裂诱导物质( m e i o s i si n d u c i n g s u b s t a n c e ，m i s ) 后来重新命名为促减数分裂物质( m e i o s i s a c t i v a t i n gs u b s t a n c e m a s ) ：而胚 胎翠丸产生一种减数分裂阻滞物质( m e i o s i sp r e v e n t i n gs u b s t a n c e ，m p s ) ( b y s k o v 等。1 9 7 4 ： 中国农业大学博士学位论文：文献缘述 b y s k o v 和s a x e n ，t 9 7 6 ：b y s k o v 等，1 9 7 8 ) 。后来应用胚胎睾丸分析的研究显示人卵泡液具有 m a s 的活性( w e s t e r g a a r d 等，1 9 8 4 、1 9 8 5 ) 。 胚胎卵巢中的卵母细胞在启动了第一次减数分裂形成原始卵泡后，在出生前后即阻滞于 第一次减数分裂前期( p r o p h a s e ) g 2 晚期的双线期( d i p l o t e n es t a g e ) 或核网期( d i c t y a t es t a g e ) 。 此后，在