（分析化学专业论文）含硒有机荧光分子探针的设计、合成及生物应用.pdf

山东师范大学 摘要 汞是环境学和生理学所研究的重要有毒重金属元素。即使是在很低浓度的条 件下，也能产生一定的生理毒性。由于汞具有强生物透膜性，容易穿透人体的皮 肤、呼吸道、肠胃组织，所以长时间暴露在含汞环境下会导致生物体的中枢神经 系统和内分泌系统产生永久性损伤。因此，研究汞离子的生物积累和生物毒性具 有重要的生物医学意义。 在生物体的新陈代谢过程中会不断产生各种自由基，如超氧阴离子自由基 ( 0 2 。) 、羟基自由基( h o ) 、脂自由基( r 0 0 ) 、一氧化氮( n o ) 、过氧亚硝基 阴离子( o n 0 0 ) 等都是生命活动过程中具有代表性的自由基，它们与生物体的衰 老及许多疾病的发生都有重要的关系。生物体中适当水平的活性自由基是机体维 持良好免疫应答的基础，但是一旦体内的氧化还原平衡遭到破坏，活性氧自由基 大量存在时就会发生氧化应激并且损伤生物体内的各种蛋白、脂类、核酸等，从 目前研究结果揭示的证据表明，活性自由基几乎和人类常见疾病如心脏病、癌症、 恶性肿瘤等都有关。因此，可逆地监测生物内氧化还原循环具有重要的生理学和 病理学意义。 由于核酸、蛋白质、肽等生物活性分子在生命科学研究中的重要地位，近年 来对检测细胞中生物活性分子的研究越来越多。其中，荧光法具有简单易行，便 于操作，高灵敏度和选择性的显著特点，更加吸引人的是探针分子可以在不破坏 生物活性的情况下进入细胞，与活细胞内的目标活性分子结合生成强荧光物质， 并借助于激光共聚焦成像技术，实现细胞内待测活性分子的“可视化”，进而实现 生命体内的“实时在线”检测。近年来，生物成像在活细胞的生物分子检测上取得 了巨大进展，荧光探针由于其高灵敏度，实时监测等优点而成为生物成像最主要 的工具。 本论文基于荧光探针与活性氧自由基或其它生物活性分子特异性作用后，荧 光光谱性质发生改变从而实现对特定物质的检测，并将所设计探针成功应用于生 物活体细胞的共聚焦显微成像。本文主要开展了以下两方面研究工作： ( 一) 根据硒对重金属离子的重要的抗毒性作用，我们设计合成了一种有机 硒荧光探针( f s e 1 ) 用于生物体系的汞离子检测。由于汞离子的强亲硒性质， 1 山东师范大学硕士论文 探针f s e 1 与汞离子发生不可逆的脱硒反应。探针f s e 1 利用硒汞间的强亲合力将 硒作为靶位点，对汞离子检测表现超高的选择性和灵敏度，其检测限达到1 0n m 。 探针f s e 1 的超高选择性表现为多种生物分析物和相关金属离子均不会对汞离子 检测产生干扰。此外，运用激光共聚焦扫描显微镜，成功实现了该探针对小鼠巨 噬细胞r a w2 6 4 7 内的汞离子荧光成像。 ( 二) 氧是好氧生物新陈代谢的关键性物质，它参与为生命活动提供必需能 量的过程。然而在能量产生的同时，也会使生物体内活性氧( r o s ) 水平发生变 化，继而产生一定的生理学和病理学影响，因此检测细胞内氧化还原循环具有重 要意义。基于有机硒化合物的药用价值，近年来人们合成了大量的有机硒药物。 研究发现含硒抗高血压药物h o m e p a s e 具有良好的抗氧化作用，由此我们设计合成 两种近红外有机硒荧光探针用于可逆地检测细胞内氧化还原循环，并运用激光共 聚焦扫描显微镜，实现活细胞内的氧化还原循环的动态荧光成像。 关键词：含硒有机荧光探针汞离子氧化还原循环可逆检测共聚焦显 微成像 2 山东师范大学 a b s t r a c t m e r c u r yi s a l l e n v i r o n m e n t a l l ya n dp h y s i o l o g i c a l l yt o x i ch e a v ym e t a le l e m e n t w h o s et o x i c i t y , e v e na tv e r yl o wc o n c e n t r a t i o n s ，h a sb e e nr e c o g n i z e d l o n g t e r m e x p o s u r et ot h i sm e t a ll e a d st op e r m a n e n td e t e r i o r a t i o no ft h ec e n t r a ln e r v o u sa n d e n d o c r i n es y s t e mi nt h eh u m a nb o d y , s i n c em e r c u r ye a s i l yp a s s e st h r o u g hb i o l o g i c a l m e m b r a n e s ，s u c ha ss k i n ，r e s p i r a t o r y , a n dg a s t r o i n t e s t i n a lt i s s u e s t h e r e f o r e ，m e r c u r y i sw i d e l ys t u d i e di nt e r m so fi t sb i o a v a i l a b i l i t y , b i o a c c u m u l a t i o n ，a n dc e l l u l a rt o x i c i t y n u m e r o u sf r e er a d i c a l sa r e g e n e r a t e di n t h ec o u r s eo fb i o l o g ym e t a b o l i s m s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l s ( 0 2 ) ，h y d r o x y lr a d i c a l s ( h o 。) ，r 0 0 a n dn o a r es o m e t y p i c a lo n e s t h e yh a v ei m p o r t a n tr e l a t i o nw i t ha g i n ga n dm a n yd i s e a s e s i ti s r e p o r t e dt h a ta p p r o p r i a t el e v e lo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) c o u l dh e l pt ob u i l d b i o l o g i c a li m m u n es y s t e m o n c et h ei n t e r n a lr e d o xs t a t u sw a sd e s t r u c t e db ys o m e f a c t o r s ，u n r e g u l a t e dp r o d u c t i o no fr o sr e s u l t si no x i d a t i v es t r e s s ，a n ds u b s e q u e n t b u i l d u po ff r e er a d i c a ld a m a g et op r o t e i n ，l i p i d s ，a n dn u c l e i ca c i d s r e c e n ts t u d i e s d e m o n s t r a t e dt h a tr o sc a nc a u s em a n yd i s e a s e ss u c ha sh e a r td i s e a s e ，c a n c e r ， m a l i g n a n c ya n ds oo n t h u ，s t u d i n go nc h e m s e n s o r sf o rd e t e c t i n gi n t e r n a lr e d o x c y c l eh a sa ni m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e b e s i d e s ，v a r i o u sb i o a c t i v em o l e c u l e sa r ei n d i s p e n s a b l ec o m p o n e n to fo r g a n i s m t h e ya l s ot a k ep a r ti nv a r i o u sl i f ea c t i v i t i e s t h u s ，s t u d i e so nb i o a c t i v em o l e c u l e s i n c l u d i n gn u c l e i ca c i d ，p r o t e i n ，p e p t i d e ，a n do t h e rb i o - a c t i v ei n g r e d i e n t sp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nl i f es c i e n c e r e c e n ty e a r s ，m o r ea n dm o r es t u d i e sf o c u so nd e t e c t i n g b i o a c t i v em o l e c u l e s a m o n gt h e s em e t h o d s ，u s i n gf l u o r e s c e n tp r o b e sh a sm a n y a d v a n t a g e ss u c ha sh i g hs e n s i t i v i t y , h i g hs e l e c t i v i t ya n de a s yt oo p e r a t e b e s i d e s ，w h a t i sm o r ea t t r a c t i v ei st h a tf l u o r e s c e n tp r o b e sc a np e n e t r a t ei n t oc e l l sw i t h o u ta n y d a m a g e ， a n dc o m b i n ew i t hb i o - a c t i v em o l e c u l e st of o r ms t r o n g l yf l u o r e s c e n t s u b s t a n c e w i t ht h eh e l po fc o n f o c a lm i c r o s c o p i ci m a g i n g ，v i s u a l i z i n ga n dr e a l t i m e d e t e c t i n go fb i o - a c t i v em o l e c u l e sc a l lb ea c h i e v e d r e c e n ty e a r s ，i m a g i n go fl i v i n g c e l l sh a sm a d eg r e a tp r o g r e s s ，a n df l u o r e s c e n tp r o b eh a sb e c o m et h em o s ti m p o r t a n t 3 t o o lb e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e s 山东师范大学硕士论文 b a s e do nt h ec h a n g e si ns p e c t r u mc h a r a c t e r so ft h ef l u o r e s c e n tp r o b e sr e a c t i n gw i t h r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e so rb i o - a c t i v em o l e c u l e s ，w eh a v ea c h i e v e dt h ed e t e c t i o no f t h e s ei n g r e d i e n t s t h ed e s i g n e df l u o r e s c e n tp r o b e sw e r ea l s oa p p l i e dt oc o n f o c a l 面】a g i n go fs e v e r a lk i n d so fc e l l s w ec a r r i e do u tt w oa s p e c t so fi n v e s t i g a t i o n ： f i r s t ，i n s p i r e db yt h ea n t i t o x i cf u n c t i o no fs e l e n i u mf o rh e a v ym e t a li o n s ，w e d e s i g n e d 锄o r g a n o s e l e n i u mf l u o r e s c e n tp r o b e ( f s e 1 ) f o rm e r c u r y t h er e a c t i o no f f s e 1a n dn g + i sa ni r r e v e r s i b l ed e s e l e n a t i o nm e c h a n i s mb a s e do nt h es e l e n o p h i l i c c h a r a c t e ro fm e r c u r y j u s tf o rt h es e l e n i u ma t o ma c t i v es i t e sa n dt h es t r o n ga f f i n i t y b e t w e e ns ea n dh g ，f s e 1e x h i b i t sa nu l t r a h i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t yf o rn g + d e t e c t i n g t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sp r o v e dt h a tt h es e l e c t i v i t yo f f s e 1f o rh 9 2 + i o n s o v e ro t h e rr e l e v a n tm e t a li o n sa n db i o a n a l y t e s ，硒 w e l la sa ne n h a n c e m e n ti n s e n s i t i v i t yu pt o1 0n m ，w h i c hi sl o w e rt h a nt h ec u r r e n te p a s t a n d a r df o rd r i n k i n g w a t e r f u r t h e r m o r e ，t h en e wp r o b ei ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ei m a g i n go fm e r c u r y i o n si nr a w2 6 4 7c e l l sw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y s e c o n d ，o x y g e nw h i c hi st h ek e ys u b s t a n c ef o ra e r o b i cm e t a b o l i s mp r o v i d e st h e n e c e s s a r ye n e r g yo fl i f ea c t i v i t i e s a st h ee n e r g y r e l e a s i n gr e d u c t i o no fo x y g e nt o w a t e rg e n e r a t e sp a r t i a l l yr e d u c e dr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) i n t e r m e d i a t e st h a t c a ne x e r tw i d e l yd i v e r g e n tp h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a le f f e c t s t h u s ，s t u d i n go n i n t e r n a lr e d o xc y c l eh a sa ni m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e r e c e n t l y ，b a s e do nt h em e d i c i n a lv a l u eo fs e l e n i u m - c o n t a i n i n gc o m p o u n d s ，a m o u n to f o r g a n o s e l e n i u md r u g sw e r es y n t h e s i z e d b a s e do n t h ew e l la n t i o x i d a t ee f f e c to f s e l e n i u m c o u n t a i n i n ga n t i h y p e r t e n s i v e a g e n th o m e p a s e ，w ed e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e dt w on o v e ln e a r - i ro r g a n o s e l e n i u mf l u o r e s c e n tp r o b e s f o rr e v e r s i b l e d e t e c t i n gi n t e r n a lr e d o xc y c l e s f u r t h e r m o r e ，w ew i l li m a g er e d o xc y c l e si nl i v i n g c e l l su s i n gc o n f o c a ll a s e r - s c a n n i n gm i c r o s c o p e k e y w o r d s ：o r g a n o s e l e n i u mf l u o r e s c e n tp r o b m e r c u r y r e d o xc y c l e s r e v e r s i b l e d e t e c t i o n c o n f o c a lm i c r o s c o p i ci m a g i n g 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：丁囱喻新替伽谚 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 丁囱瑜 导师签字：弋勘办 签字日期：2 0 07 年易月f 日 签专日期：2 0 07 年石月日 山东师范大学 第一章绪论 生物体是由各种不同的化学物质组成的，这些物质及其复杂的化学组成、结 构及化学变化构成了千姿百态的生命现象。随着生物化学与分子生物学的发展与 各种物理、化学、生物学的研究手段的应用使生物体内的化学反应过程逐渐得到 阐明。在生物体中，各种生物活性物质是细胞、组织和器官不可缺少的组成部分， 并且参与细胞增殖与分化、生命遗传、细胞新陈代谢等活动。因此，生命活动是 许多具有生物活性的物质参与的各种化学反应的总结果。在生命科学的研究中， 多种生物活性物质包括金属离子、自由基、酶、小分子代谢物等参与信号及能量 传导，对细胞的生理特性有重要影响，在许多重要的生物过程中起着举足轻重的 作用。 第一节自由基的生理、病理作用及其检测技术的研究概况 1 1 自由基的生理、病理作用 自由基又称游离基，是指外层轨道含有不成对电子的原子、原子团或特殊状 态的分子。机体内进行氧化还原反应会产生一系列自由基，这些自由基会自动地 形成链式反应。正常机体存在着完善的自由基清除体系，使自由基的产生与清除 处于动态平衡。由于某些生理或病理原因导致自由基增多时，自由基的产生与清 除的动态平衡被破坏，自由基所造成的损伤成为多种疾病的起点。许多研究表明， 活性氧自由基在生物体衰老与疾病，以及正常的免疫代谢与细胞信号转导等过程 中都起着重要的生理作用n 叫3 。因此，关于细胞体内活性自由基分子作用机制的 研究备受关注。在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基，其中 超氧阴离子自由基( 0 2 ) 、羟基自由基( h o - ) 、双氧水( h 2 0 2 ) 、一氧化氮( n o ) 、 脂自由基( r 0 0 ) 、过氧亚硝基阴离子( o n o o 。) 是具有代表性的重要自由基， 体内自由基量的变化直接与生物的生理和病理相关【5 】。 在正常生理情况下，生物体中适当水平的活性自由基可以维持机体良好的免 疫应答，而且它们参与了机体生理活动的某些有益环节，因此在正常的生命过程 中，自由基具有重要的生理作用。1 ) 活性氧能提高吞噬细胞和中性粒细胞的杀 菌功能。当吞噬细胞进行吞噬作用时常与氧代谢突然增长联系在一起，这一现象 5 山东师范大学硕士论文 称为呼吸爆发( r e s p i r a t o r yb u r s t ) 。氧代谢首先产生大量的h 2 0 2 ，其次产生大量 的超氧阴离子自由基，另外还产生一定量的羟自由基和单线态氧。机体内的葡萄 糖提供了产生超氧阴离子自由基所需的能量，而氧呼吸突发中产生的各类活性氧 中以h 2 0 2 的杀菌作用最强，并且其杀菌能力在有卤素离子及过氧化物酶存在时能 增强数倍【6 】；2 ) 与人体中的一些激素、酶及蛋白的合成有关，如参与前列腺素、 凝血酶原和胶原蛋白的合成；3 ) 具有解毒作用，机体对外来物质的解毒作用主 要在肝脏中进行，有0 2 参力i t 6 ；4 ) 与生殖和胚胎发育有判7 】；5 ) 在调节细胞增 殖与分化过程起重要作用，大量研究证明，低浓度的活性氧如0 2 和h 2 0 2 可以促 进一系列正常或癌变细胞的生长，是细胞维持生存和生长不可缺少的因子，缺少 了它们，细胞将无法增殖，甚至会死亡【8 1 1 】；6 ) 参与机体免疫和环核苷酸的生 物合成。研究显示n o 与机体的特异性免疫反应关系密切，在机体的免疫过程中 发挥了重要作用【1 2 , 12 1 】。而且n o 还是重要的细胞内信使分子【i 】。 生物体内的适量的活性氧和活性氮对生物体正常的生理过程是必需的。然而 当生物体内自由基过量产生或者抗氧剂的量严重耗尽时，自由基则会诱导一系列 有害变化，导致机体产生各种疾病及老化【1 纠9 】：1 ) 诱发脂质过氧化，导致细胞 膜受损。线粒体膜受损后，破坏了三羧酸循环和电子传递装置，使细胞能量供应 障碍。溶酶体膜受损破裂，释放出溶酶体酶，使许多底物受到有害的水解。小动 脉管壁成分的过氧化能导致小动脉的纤维病变，引起动脉硬化和心血管疾病。自、 由基引发的过氧化脂质能与蛋白质的氨基酸残基以及其他细胞成分缩合形成脂 褐素。2 ) 导致d n a 、r n a 交联或氧化。d n a 在受到短波照射时，其分子的各 部分会生成自由基，生成的自由基引起核酸的化学变化，诸如脱氨基、脱羟基、 碱基一糖键断裂、糖的氧化及磷酸酯的释放等，导致细胞癌变或遗传病。3 ) 蛋 白质的氧化和交联：自由基能使蛋白质分子交联而形成变性高聚物，多烯酸过氧 化物的分解产物丙二醛可作为蛋白交联剂而使蛋白质变性。自由基能使含硫氨基 酸中的硫氧化，造成神经损害。自由基使酶蛋白丧失活性，甚至催化错误代谢反 应或引起过敏反应。4 ) 氨基多糖氧化降解：自由基的过氧化物能将关节中的粘 多糖解聚，因而可能是关节炎的一个发病原因。 1 2 自由基检测技术发展概况 鉴于自由基的重要生理、病理作用，使得有关自由基的研究已经涉及到癌症 6 山东师范大学 治疗、心血管病防治、预防衰老和器官移植等临床医学的重大疑难问题。活性氧 自由基对生物体的损伤作用虽然已经逐步获得公认，并在2 0 世纪受到了极大关注 【2 0 】。然而，由于生物体内活性氧自由基的半衰期非常短，导致通常情况下稳态浓 度极低，所以真正适用于检测生物活体内r o s 的方法还是较少的，特别是在生物 活体内( i nv i v o ) 与直接原位( i ns i t u ) 的检测。另外，生物体内还存在着预防自由 基损伤的内在抗氧化防护体系 2 0 1 。至今为止，对直接动态观测某些器官中活性自 由基的产生，对它们的生成机制、生理作用及其动态损伤生物机体的过程都缺乏 足够的认识和充分的实验证据，以至于在临床上直接影响和限制对许多疾病的治 疗效果，对发展抗逆境植物的培植也是重大障碍。因此，针对动植物生物活体内 自由基开创新的分析与检测技术是分析化学学科发展中具有挑战性的前沿课题 之一。 目前已经用于测定自由基的方法主要有电子自旋共振法( e s r ) ，或电子顺 磁共振法( e p r ) 2z 】、高效液相色谱法( h p l c ) 【2 2 】、化学发光法( c l ) 2 3 】、荧 光法【2 4 ，2 5 1 、电化学方法【2 6 - 2 8 等。其中，荧光法具有简单易行，便于操作，具有 高灵敏度、高选择性的显著优点。同时，荧光法还可以结合共聚焦显微成像技术 和微区光谱检测技术，在不破坏生物活性的情况下进入细胞，与活细胞内的目标 物结合生成强荧光物质，进而实现活细胞和组织内待测活性物质的“实时、可视、 定量”的“可视化检测。为了实现上述目标 就迫切需要科研工作者开发对 r o s 能够快速响应的荧光探针用以动态观测研究某些器官中活性氧自由基的产 生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程。近年来，利用荧光探针实时 检测活细胞内氧自由基的研究已经取得了巨大进展，但是荧光探针可逆性检测细 胞内活性氧的报道还为数不多2 9 。3 1 。据我们所知的可逆性荧光探针大多都是基于 蛋白质【2 9 , 3 0 和肽链3 1 , 3 2 设计的，小分子可逆荧光探针的报道仅有一篇【3 3 】。 2 0 0 6 年，c h r i s t o p h e rj c h a n g 3 3 】课题组设计以荧光素为母体，包含二硫键的 氧化还原荧光探针r f l ，利用二硫键氧化还原调节库( r e d o xr e s e r v o i r s ) 的性质 实现反应前后荧光变化，达到可逆检测的目的。实验表明，该探针成功实现t h e k 细胞中氧化还原循环的荧光成像( 图1 - 1 ) 。 7 山东师范大学硕士论文 甯。： r e d u c t i o n o x i d a t i o n 匿 图卜1r f l 探针氧化还原可逆检测的机理及其在人正常肝细胞的共聚焦显微成像 第二节汞离子等重金属元素的生物毒性及荧光检测汞的研究简介 2 1 汞离子等重金属元素的生理毒性 在生命科学的研究中，金属离子占有重要的地位，金属离子( 如f e 、c u 、c o 、 m n 、z n 、c a 、m 2 、k 、n a 等) 是维持生命活动所必不可少的物质。大量事实表 明它们在细胞生物学和细胞营养学中起着非常重要的作用。微量金属元素在人体 中占酶组分的5 0 一7 0 ，一些金届蛋白构成体内重要载体及电子传递系统：参 与某些激素和维生素的合成：与核酸、蛋白质等生物大分子发生作用等p 4 。例如， 锌离子是组成三百多种生物酶活性中心的重要金属离子之一，其中有碳酸酐酶， 羧肽酶、碱性磷酸酶、胶原酶等。另外，蛋白质结构和功能、d n a 和r n a 台成、 基因表达和大脑新陈代谢或疾病的产生都与锌密切相关。 由于重金属离子会对人类的健康和环境造成极大的危害，像砷、镉、铅、汞 等均是有毒金属元素。如砷的化合物均有剧毒，三价砷化合物比五价砷化合物毒 性更强，有机砷对人体和生物都有剧毒，砷通过呼吸道、消化道和皮肤接触人体。 摄入过量的砷，就会在人体的肝、肾、肺、子宫、胎盘、骨骼、肌肉等部位，特 别是在毛发、指甲中蓄积，从而引起慢性砷中毒，潜伏期可长达几年甚至几十年。 慢性砷中毒有消化系统症状、神经系统症状和皮肤病变等。砷还有致癌作用，能 引起皮肤癌。此外，镉的毒性也很大，它可通过食物链进入动物和人体，可以在 人体内蓄积主要蓄积在肾脏引起泌尿系统的功能变化，镉在人体内形成镉硫 蛋白，它与岔羟基、氨基、巯基的蛋白质分子结合，影响酶的功能，导致蛋白尿 和糖尿等；镉还能影响维生索d ，的活性，使骨质疏松、萎缩、变形等。铅是可 以在人体和动物组织中蓄积的有毒金属，铅的主要毒性效应是导致贫血症、神经 8 山东师范大学 机能失调和肾损伤。铅对植物的危害，主要是影响植物的光合租用和蒸腾作用， p b 对土壤中尿酶和转换酶有较强的抑制作用，长期大量施用含p b 的污泥或污灌， 有可能使土壤中氮的转化受到较为严重的影响。 最后，汞及其化合物都属于剧毒物质，在生物体内具有积累作用，可在体内 蓄积。研究表明，生活在高汞浓度环境中的一些生物，可以在其组织中蓄积很高 浓度的汞【3 5 3 7 1 ，再通过食物链进入生物循环，进入其它生物体中。生物体对汞的 积累能力是有限的，当体内摄入过量的汞，蓄积能力饱和，就会发生“溢出现 象，多余的汞就会与其他生物大分子包括酶和核酸相结合，使生物体发生病变。 例如，摄入人体内的甲基汞主要是侵入大脑等神经系统，引起手脚麻木、哆嗦、 乏力、耳鸣、视野变窄、听力困难、口齿不清、动作迟缓等各种症状。汞作用 于肾细胞膜基、磷酞基，加剧膜脂的氧化水平，细胞膜透性增加，损害肾脏的过 滤功能，出现蛋白尿等肾功能障碍。另外还有一些因母亲食用了被污染的鱼，鱼 中的甲基汞也就间接地侵入了胎儿体内，造成了许多先天型残疾的水俣病胎儿型 患者。 由于这些重金属元素大都具有生物积累作用，并且通过食物链进入生物循 环，最重要的是其对生物体内组织的损害严重是不可恢复的。因此，对于重金属 离子的检测就其生物毒性，生物积累作用和病理研究都具有非常重要的意义。 2 2 汞离子检测的研究简介 汞是环境学和生理学的重要有毒重金属元素。由于其对人类生存环境和人体 健康的严重危害，因而日益引起人们对其的普遍关注。经典的汞离子检测分析技 术有原子吸收原子发射【3 8 1 、诱导耦合等离子质谱3 9 1 ，与荧光光谱测定方法相比， 这些方法或操作步骤冗长，需要多种化学试剂或需要较贵重的仪器设备，使这些 方法的应用和推广受到很大的限制。而荧光光谱法具有快速简便、灵敏度高、选 择性好和同时测定多组分的优点而被广泛的应用。 迄今为止，用于检测汞离子的荧光探针主要分为五大类，有寡核苷酸【4 0 】，蛋 白质【4 1 1 ，d n a 4 z 平- i d n a 酶【4 3 】以及多种的有机小分子【“4 6 】。前四种检测汞离子的 荧光探针多是利用胸腺嘧啶一胸腺嘧啶( t h y m i n e t h y m i n e ( t - t ) ) 与汞的强结合 力和高效专一性，再引入不同的荧光团运用不同的反应机理，设计荧光探针检测 汞。在此仅列举几种具有代表性的荧光探针加以介绍说明。 9 山东师范大学硕士论文 c h a i l f 删等人结合聚乙烯寡核苷酸t 3 3 和双链螯合染料t o t o 一3 用于检测水 溶液的汞离子。未有汞离子存在时，t 3 3 与t o t o 3 在水溶液中的相互作用力较 弱，故而联合体t o t o 一3 t 3 3 荧光也较弱；当汞离子存在时，t h g - t 捆绑效应使 t 3 3 改变其随意结构，形成折叠构型，且t o t o 3 因为与双链d n a 的强结合力而形 成t o t o 3 d n a 复合物，最终形成了强荧光的刚性结构( 图1 2 ) 。 0 单嫂 k。 h i g hf l u o r e s c e n c e 图1 - 2t o t o 3 t 3 3 探针与汞的反应机理 o n o 和l t o g a s h i c 他 结合t - h g t 和荧光共振能量转移( f r e t ) 设计高选择性汞 离子寡核苷酸荧光传感器d o d n f ，o d n 是一段具有多个胸腺嘧啶的寡核苷酸 序列，d f 是在序列的两端分别引入猝灭基团和荧光团。无汞存在时，不发生荧 光共振能量转移，d o d n f 有强荧光；一旦汞离子存在，o d n 发生折叠，荧光 共振能量转移产生，传感器荧光猝灭( 图1 3 ) 。遗憾的是，该探针展现为荧光猝 灭，而且未运用与生物检测。 1 0 i 币蚶湘 陬盯( 暑 一兰划 r a j7 0 6 0 1 柏5 0 3 0 2 0 1 0 o 埘 f i ，盖 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 05 8 06 0 0 a ，咖 图1 3 荧光传感器d o d n f 与汞离子的反应机理及其荧光猝灭现象 山东师范大学 此外，将有机小分子作为汞离子响应基团的荧光探针，由于其大多数都存在 荧光猝灭，水溶性差以及选择性和灵敏度的限制等弊端，故而无法成功用于生物 模型中的汞离子检测。迄今为止，只有为数几个有机小分子荧光探针实现了生物 模型的汞离子荧光成像h q 。 2 0 0 4 年钱旭红阳增人成功将探针e p n p 孵育人胚肾上皮细胞( h u m a nk i d n e y t u b u l a re p i t h d i a lc e i l s ，h k cc e l l s ) 中，得l u h k c 细胞的荧光显微图像。2 0 0 6 年， s h i n 和k 1 蛳1 等人以罗丹明为母体，利用汞的亲硫性设计不可逆的荧光探针用于 检测生物体内汞离子。实验表明，该探针能够监测生物体组织内汞离子的富集浓 度。该探针在生理环境下表现出优越的选择性和灵敏度，成功实现了小鼠成肌细 胞、人类骨骼肌细胞，神经元细胞和斑马鱼的荧光显微成像( 图1 4 ) 。 ：黢苦：髭“ 丁 图卜4 不可逆荧光探针与汞的反应机理及其在神经细胞和斑马鱼中的荧光成像 2 0 0 7 年，c h a n g ”“1 利用氮氮杂硫杂冠醚作为汞离子响应基团设计荧光化学传 感器m g l ，具有良好的选择性和灵敏度，用于检测水体、细胞和组织中的汞离子 浓度( 图1 5 ) 。 麟臼辩3 b i n 舒 图1 - 5 荧光探针m g l 在人胚肾细胞( h e k 2 9 3 t ) 中的汞离子荧光成像圈 近期，q i a n , 和x i a o 4 “博人基于共振能量转移机理设计荧光比率探针用于检 测活细胞中汞离子。该比率探针由罗羽明、b o d i p y 和连接i i n k 组成，与汞离子 1 1 山东师范大学硕七论文 反应后罗丹明闭环与b o d 吖发生共振能量转移( 图1 6 ) 。用探针孵育乳腺癌 m c f 7 细胞的荧光成像图证明了加入汞离子前后t 两种不同发射的荧光强度明显 发生变化，b o d i p y 绿色荧光减弱，罗丹明红色荧光增强( 图1 7 ) 。 、积 t ：“h 、“ s 岳 图l - 6 荧光比率探针与汞离子的荧光共振能量转移反应机理 图卜7 比率探针在m c f 一7 细胞中汞离子荧光成像。a ) 比率探针孵育m c f 一7 细 胞3 0 m i n 的荧光成像( xe r a = 5 1 4 _ + 1 5 r i m ) ；b ) ，c ) 加入汞离子后m c f 一7 细胞的荧光 成像( b ： e m = 5 1 4 1 5 n m c ： e m - 5 8 9 1 5 n m ) 本课题组【删以花菁为母体设计近红外荧3 恻- d m a - c y ，基于光诱导电子 转移( p h o t o i n d u c c d e l c c t r o n t r a n s f c r ，p e t ) 猝灭机理来检测汞离子，得到人肝癌 细胞( h e p g 2c e l l s ) 的荧光成像图( 图1 - 8 ) 。由于生物样品基体在近红外荧光光 区的吸收或荧光强度很小，背景干扰太大降低，因此近红外荧光探针由于其特殊 的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的优点，且其测定条件 适宜生命体的生理环境而被广泛地应用于生命科学研究领域。 2 圈1 8 近红外荧光探针d m a c y 在人肝癌细胞中汞离子荧光成像图 山东师范大学 研究发现上述几种有机小分子荧光探针存在共性，都是基于h g 与s 原子或n 原子之间共价非共价相互作用。由于s 原子和n 原子也经常被用于其他金属离子 ( 女1 c u ，n i n ，z n l l ) 探针的特异性活性基团，这就使得此类探针对特定目标离子的 高选择性和高灵敏度比较困难。因此，为更好的检测生物体系和环境体系的汞离 子，需要提出一个提高选择性和灵敏度的新途径。 第三节硒元素的生物学功能及有机硒化合物的生物检测发展简介 3 1 硒元素的生物学功能 1 9 1 8 年，瑞典化学家j b e r z e l i u z 发现了元素硒，一直被认为是对人体有害的 元素，直至r j 2 0 世纪6 0 年代，对硒的研究才从毒性作用转为营养研究。1 9 5 7 年 s c h w a r t z 和f l o t z 首先认识到了硒的生物学作用。1 9 7 3 年r o t r u c k 等发现硒是谷胱甘 肽过氧化物酶g s h - - p x 必要的组成成分，在细胞抗氧化系统中占有重要位置。同 年，世界卫生组织专家确定硒是人和动物生命活动的必需的微量元素，中国营养 学会也于1 9 8 8 年把硒列为必须微量元素。近年来，研究者们利用7 7 s e 从哺乳动物血 浆和肝、肾等组织中分离出数种含硒蛋白，从而使硒的生物学研究进一步深入， 有关硒在酶学和生物有机化学中的应用【4 7 】的文献报道也越来越多，其重要性日益 显现。 硒可分为有机硒和无机硒，但是真正发挥生物活性作用的是有机硒。硒在生 物体内主要以硒代半胱氨酸的形式存在，构成含硒蛋白质和硒蛋白。哺乳动物和 微生物中主要是硒代蛋氨酸( s e m e t ) 和硒代半胱氨酸( s e c y s ) 。植物中的存 在形式比较复杂，除了上述两种形式还有其他形式，如硒与核糖核酸、多糖果胶、 多酚等结合。大蒜是最能富硒的植物，其中硒多糖占有机硒的2 7 之多。 硒有许多重要的生理功能，抗氧化性是硒的生化作用基础，也是在生物体内 最主要的生物功能，主要表现在含硒蛋白质清楚机体内的活性氧自由基及其衍生 物。硒的抗氧化作用可以分为酶和非酶，氧化还原酶通过催化机体代谢过程中产 生的过氧化物转变成无毒产物，从而抑制膜磷脂过氧化而发挥作用，亦达到清除 活性氧自由基的目的。除含硒酶外，体内大量存在的非酶形式硒对抗氧化也发挥 重要的作用。 硒是影响机体免疫功能的重要因素之一，从多方面影响机体的免疫功能。 1 3 山东师范大学硕士论文 虽然目前就硒对免疫功能的影响的报道结果尚有差异，但综合有关资料，硒对免 疫功能的增强作用概括起来有：硒参与细胞免疫过程，硒的抗氧化作用而清楚机 体产生的活性氧，减少脂质过氧化物，是免疫细胞免受损害，从而促进免疫功能； 硒能够影响淋巴细胞酶系，诸如a c p 、a k p 等的活性而加强淋巴细胞的功能；作用 于巯基化合物，借助于巯基化合物有刺激各种细胞和组织分裂的能力，进而调节 免疫细胞的增殖和分化，影响免疫应答水平【钢。 硒对重金属毒性的拮抗作用。硒作为带负电荷的非金属离子，在生物体内可 以与带正电有害金属离子相结合，能拮抗和减弱机体内砷、汞、铬、锑、铅等微 量元素的毒，形金属一硒一蛋白质复合物，把能诱发癌变的有害金属离子接排除 体外，或以胆汁分泌排出体外，消解了金属离子的毒性，起到解毒和排毒作用，故 获得了“天然解毒剂的美名。对于硒的解毒作用，研究较多的是硒和无机汞盐 的拮抗机制的探讨，但是它的解毒机理仍然没有明确。硒与无机汞毒性的拮抗机 制主要存在着以下两种看法：一种认为汞与硒直接结合以h g s e 胶体的形态存在 【4 9 1 。另一种说法则认为汞与硒先相互结合，然后再与特定的蛋白质结合成无活性 的化合物，即p r o t e 证一s s e _ - l 誊删。 另外，硒能影响肝血红素代谢，降低黄曲霉素b 1 的毒性。硒与人类多种癌症 的发病率呈负相关，并能显著地预防和抑制动物的自发性、移植性和化学致癌剂 、 诱发的肿瘤的发生、发展、散播和复发。硒对预防心血管疾病也有重要作用，有 利于维持心血管系统正常的结构与功能，预防动脉硬化与冠心病的出现，能维持机 体的正常血压