（分析化学专业论文）基于溶胶凝胶技术的纳米生物传感界面构建.pdf

摘要 摘要 自1 9 6 2 年c l a r k 提出了第一个酶电极模型以来，生物传感器的研究得到了迅 速发展，已成为现代分析化学和生命科学的重要前沿课题。性能优良的生物载 体材料的选择和切实可行的固定化方法的建立，是高灵敏度、高选择性生物传 感器成功研制的核心问题，成为传感技术研究领域的热点和难点。近年发展起 来的溶胶凝胶技术，其载体为无机多孔材料，具有许多高分子材料无法比拟的 特性，为生物活性物质的固定化提供了性能优良的材料。本论文将溶胶凝胶的 材料优势和多种固定化方法相结合，成功研制了多种具有应用前景的溶胶凝胶 电化学生物传感器，主要内容如下： 1 基于蒸汽溶胶一凝胶技术的g o d s 0 1 g e l p b 修饰电极 采用电沉积方法将普鲁士蓝沉积到金电极表面；再采用蒸汽溶胶凝胶技术， 将葡萄糖氧化酶- - 氧化钛溶胶凝胶( g o d t i 0 2s 0 1 g e l ) 固定在普鲁士蓝膜修饰 的金电极上，构建了一种新型的安培型葡萄糖生物传感器。t i 0 2s 0 1 g e l p b 膜具 有大的比表面积、良好的机械稳定性和亲水性，为葡萄糖氧化酶的固定化提供 了良好的生物微环境，有效保持了固定化酶的生物活性。电化学方法对g o d t i 0 2 s 0 1 g e l p b 传感器构建过程的表征结果表明，采用本文方法可以实现酶在电极表 面的有效固定。p b 对h 2 0 2 的电化学还原具有良好的催化性能，同时，p b 良好的 导电性还有利于促进电子在电极表面和反应物之间的快速传递。将制备的 g o d t i 0 2s 0 1 g e l p b 修饰电极用于对葡萄糖的催化检测，具有响应快速( 1 0s ) 、 灵敏度高( 1 2 7 4t t a m m 。1c m 2 ) 、稳定性好、检出限低( 5 州) 、线性范围宽( 0 0 2 1 5m m ) 和抗干扰能力强等优点。 2 碳纳米管普鲁士蓝复合材料的制备及生物传感应用 采用蒸汽溶胶凝胶法将碳纳米管普鲁士蓝( m w c n t s p b ) 纳米复合材料 固定于金电极表面，制备了用于检测h 2 0 2 的m w c n t s p b 修饰电极。采用电化 学方法研究了t i 0 2 、m w c n t s t i 0 2 、p b t i 0 2 以及m w c n t s p b n 0 2 修饰电极 对h 2 0 2 的催化还原作用，结果表明，m w c n t s p b t i 0 2 修饰电极对h 2 0 2 的催 化还原能力远远大于m w c n t s t i 0 2 和p b t i 0 2 修饰电极，m w c n t s p b 纳米复 摘要 合物中的m w c n t s 和p b 对h 2 0 2 的电化学还原具有良好的协同催化效应。进而 将葡萄糖氧化酶固定于m w c n t s p b t i 0 2 修饰电极表面，制备了葡萄糖生物传 感器，用于对葡萄糖的催化测定，具有响应快速、灵敏、选择性好等特点。本 方法不仅拓展了蒸汽溶胶凝胶技术的应用范围，还为研究协同效应提供了良好 的模型体系。 3 葡萄糖氧化酶溶胶一凝胶普鲁士蓝生物传感器的研制及应用 采用电化学共沉积法将葡萄糖氧化酶- - 氧化硅溶胶凝胶沉积于普鲁士蓝 修饰电极表面，扫描电镜对g o d s 0 1 g e l 杂化膜在电极表面的形貌表征结果表明， 采用电沉积法制得的g o d s 0 1 g e l 杂化膜表面均匀、无团聚，且具有大量的三维 结构微纳孑l 洞，有利于被分析物向电极表面的快速传质；还采用红外光谱和紫 外光谱法对g o d s 0 1 g e l 杂化膜在电极表面形成过程中g o d 的生物活性进行了 表征，结果表明，s 0 1 g e l 三维网络结构不仅为g o d 提供了良好的生物相容性微 环境，有利于保持酶的原始结构，而且还有效防止了g o d 的泄漏。葡萄糖在 g o d 的催化下与0 2 发生反应生成葡萄糖内酯和h 2 0 2 ，而预沉积在电极表面的 p b 又对产生的h 2 0 2 具有良好的电催化还原特性，因此，通过检测h 2 0 2 在修饰 电极上的催化还原电流，可以实现生物体内葡萄糖的高灵敏检测。本方法制备 的g o d s 0 1 g e l p b 生物传感器对葡萄糖检测的灵敏度高、稳定性好、使用寿命 长。 4 铂纳米粒子碳纳米管溶胶一凝胶葡萄糖氧化酶生物传感器的研制 利用碳纳米管和铂纳米粒子( p tn p s ) 均对h 2 0 2 具有的电化学催化氧化效 应，采用电化学沉积法在多壁碳纳米管( m w c n t s ) 预修饰电极表面沉积一层 p tn p s ，构建了对h 2 0 2 具有高灵敏性协同催化氧化响应的p tn p s m w c n t 修饰 电极。实验中进一步将葡萄糖氧化酶二氧化硅溶胶凝胶电沉积于n n p s m w c n t 修饰电极表面，构建了g o d s 0 1 g e l p tn p s m w c n t s 修饰电极。 将制备的传感器用于对葡萄糖的催化性能研究，结果表明，g o d 在0 2 存在下催 化葡萄糖生成h 2 0 2 ，电极表面的p tn p s m w c n t s 复合物又对h 2 0 2 具有高灵敏 协同催化氧化效应，因此，制备的g o d s 0 1 g e l p tn p s m w c n t s 修饰电极可实 现对葡萄糖的高灵敏度、快速、低检出限、宽线性范围的稳定检测。 关键词：溶胶凝胶；生物传感器；固定化酶；电沉积；普鲁士蓝；葡萄糖 i i a b s t r c t a b s t r c t s i n c e19 6 2 ，t h ef i r s tm o d e lo fe n z y m ee l e c t r o d eh a sr e p o r t e db yc l a r k ， d e v e l o p m e n to fb i o s e n s o rw a sv e r yf a s t a s s e m b l yo fb i o l o g i c a lm o l e c u l e sw i t h i na s o l i d - s t a t ef r a m e w o r kp r o v i d e ss e v e r a lu n i q u ea d v a n t a g e sf o rd e s i g no fb i o s e n s o r s t h em a i nl i m i t a t i o n si nt h i sd i r e c t i o nh a v e b e e nal a c ko fa l l a p p r o p r i a t e i m m o b i l i z a t i o np r o c e s sa n dam a t r i xt h a tc a np r e v e n td e n a t u r a t i o no fb i o m o l e c u l e s t h es o l g e l p r o c e s s p r o v i d e se x t r a o r d i n a r yo p p o r t u n i t i e s t o i n t e g r a t es o l u t i o n c h e m i s t r yo fm o l e c u l a re n t i t i e si n t oas o l i d s t a t ef r a m e w o r ku n d e rm i l dc o n d i t i o n s t h er i g i ds o l g e lm a t r i xn o to n l yr e s t r i c t sm o l e c u l a rm o t i o na n df i x e st h e s em o l e c u l e s i n s p a c e ，b u ta l s o ，b yv i r t u eo fi t sf r a m e w o r k ，p r o v i d e sm e c h a n i c a ls t r e n g t ha n d i m p r o v e dl o n g - t e r ms t a b i l i t y t h ep r e s e n tr e s e a r c hw o r kf o c u s e so nt h es e l e c t i n ga n d o p t i m i z i n gs o l g e lm a t e r i a l s ，i m p r o v i n gi m m o b i l i z i n gm e t h o d s ，a n dd e s i g n i n gs e v e r a l t y p e so fn o v e le l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rs y s t e m s t h em a j o rc o n t e n ta n dr e s u l t so ft h i s d i s s e r t a t i o na r es u m m a r i z e da n dd e s c r i b e da sf o l l o w s 1 a na m p e r o m e t r i eg l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do nt i t a n i as o l - g e l p r u s s i a n b l u ec o m p o s i t ef i l m a ni m p r o v e da m p e r o m e t r i cg l u c o s eb i o s e n s o rw a sc o n s t r u c t e db yi m m o b i l i z i n g g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i nat i t a n i as o l - g e lf i l m ，w h i c hw a sp r e p a r e db yav a p o r d e p o s i t i o nm e t h o d ，o nap r u s s i a nb l u e ( p b ) 一m o d i f i e de l e c t r o d e t h em e t h o d c o m b i n e dt h em e r i t so fi m m o b i l i z i n gb i o m o l e c u l e si nt h et i t a n i as o t - g e lf i l mb yv a p o r d e p o s i t i o nm e t h o d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef a b r i c a t e dt i t a n i as o l - g e l p bm e m b r a n e p o s s e s s e dh i 曲s u r f a c ea r e a , g o o dm e c h a n i c a ls t a b i l i t y , a n dg o o dh y d r o p h i l i c i t y , w h i c hp r o v i d e da b i o c o m p a t i b l em i c r o e n v i r o n m e n tf o rm a i n t a i n i n gt h eb i o a c t i v i t yo f t h ei m m o b i l i z e de n z y m ea n dp r e v e n t e dt h ee n z y m ef r o ml e a k i n go u to ft h ef i l m t h e r e f o r e ，t h ep r e s e n tb i o s e n s o re x h i b i t e df a s tr e s p o n s et i m e ( 10s ) ，h i 曲s e n s i t i v i t y ( 1 2 7 4p am m “c m 呓) ，l o n g t e r mo p e r a t i o n a ls t a b i l i t y , g o o ds u p p r e s s i o n o f i n t e r f e r e n c e ，a n daw i d el i n e a rr a n g ef r o mo 0 2t o15m m 谢t l lal o wd e t e c t i o nl i m i t o f5l a mf o rt h ed e t e c t i o no f g l u c o s e i i i _ _ _ - - - _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ i _ _ _ _ _ _ - - _ _ - _ - _ _ - - _ _ - _ l _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。_ - - _ 。_ 。_ - _ - - _ _ _ _ 。一 一。一。 2 p r e p a r a t i o no fm w c n t s p bc o m p o s i t em a t e r i a lm o d i f i e de l e c t r o d e an e wt y p eo fc o m p o s i t en o v e le l e c t r o d ew a sf a b r i c a t e db yi n c o r p o r a t i o no f m w c n t s p bc o m p o s i t em a t e r i a lm o d i f i e dg o l de l e c t r o d ew i t hav a p o rd e p o s i t i o n m e t h o d t l l em o d i f i e de l e c t r o d es h o w e de x c e l l e n tc a t a l y t i ca c t i v i t yf o rh y d r o g e n p e r o x i d e ，w h i c hc o m b i n e dt h em e r i t so ft h es y n e r g i ec a t a l y s i se f f e c t so fp ba n d m w c n t s i na d d i t i o n ，g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) w a si m m o b i l i z e do nm w c n t s p b m o d i f i e de l e c t r o d e a n dt h eg l u c o s eb i o s e n s o re x h i b i t e df a s tr e s p o n s et i m ea n dh i 曲 s e n s i t i v i t y t h i sm e t h o dc o u l dw i d e nt h ea p p l i c a t i o na r e ao fs o l - g e la n dp r o v i d ea c o m m e n d a b l em o d e ls y s t e mf o rr e s e a r c ht h es y n e r g i cc a t a l y s i se f f e c t s 3 p r e p a r a t i o no fg o d s o l g e ls i l i c a f i l mo np r u s s i a n b l u em o d i f i e d e l e c t r o d ef o rg l u c o s eb i o s e n s o ra p p l i c a t i o n an o v e la m p e r o m e t r i cg l u c o s eb i o s e n s o rw a sf a b r i c a t e db yi ns i t ui n c o r p o r a t i n g g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) w i t h i nt h es o l g e l s i l i c af i l mo nap r u s s i a nb l u e ( p b ) m o d i f i e de l e c t r o d e t h em e t h o di ss i m p l ea n dc o n t r o l l a b l e ，w h i c hc o m b i n e dt h e m e r i t so fi n s i t ui m m o b i l i z i n gb i o m o l e c u l e si ns o l - g e ls i l i c af i l mb ye l e c t r o c h e m i c a l m e t h o da n dt h es y n e r g i cc a t a l y s i se f f e c t so fp ba n dg o dm o l e c u l e s s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) s h o w e d t h a tt h eg o d s o l g e ls i l i c af i l mw a s h o m o g e n e o u sw i t hal a r g en u m b e ro ft h r e e - d i m e n s i o n a ln a n o p o r e s ，w h i c hi m p r o v e d t h es t a b i l i t ya n ds e n s i t i v i t yo ft h eb i o s e n s o r t h ef t i ra n du v - v i ss p e c t r u mi n d i c a t e t h a tg o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l yi n c o r p o r a t e di n t ot h es o l - g e ls i l i c am a t r i xa n dt h e s e c o n d a r ys t r u c t u r ew a sm a i n t a i n e dw e l l t h ef a b r i c a t e dg o d s o l g e l p bb i o s e n s o r s h o w e df a s tr e s p o n s et i m e ，h i g hs e n s i t i v i t y , l o n g t e r ms t a b i l i t y , g o o ds u p p r e s s i o no f i n t e r f e r e n c e ，a n dw i d el i n e a rr a n g et og l u c o s ec o n c e n t r a t i o n 4 p r e p a r a t i o no fg o d s 0 1 g e ls i l i c af i l mo np tn p s m w c n t sm o d i f i e d e l e c t r o d ef o rg l u c o s eb i o s e n s o ra p p l i c a t i o n an e wt y p eo fc o m p o s i t el l a n o m a t e r i a lm o d i f i e de l e c t r o d ew a sc o n s t u r e t e db y e l e c t r o c h e m i c a l d e p o s i t i o no fp l a t i n u mn a n o p a r t i c l e so n t o m w c n t sm o d i f i e d p l a t i n u me l e c t r o d e n 伦m o d i f i e de l e c t r o d es h o w e de x c e l l e n tc a t a l y t i ca c t i v i t yf o r h y d r o g e np e r o x i d e ，w h i c hc o m b i n e dt h em e r i t so ft h es y n e r g i cc a t a l y s i se f f e c t so f m w c n t sa n dp l a t i n u mn a n o p a r t i c l e s i na d d i t i o n , s o l - g e l g o dw a si m m o b i l i z e do n p tn p s m w c n t sm o d i f i e de l e c t r o d eb ye l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o n , a n dt h eg l u c o s e i v a b s t r c t b j o s e i l s o r e x h i b “e df a s t r e s p o n s et i m e e x p e r i m e n t a l r e s u l t si i l d i c a t et t l a t m g h d i s p e r s 阳p l a t i n 啪n a n o p a r t i c l e s o nm w c n t s ，w h i c hh a s l a r g es u r f a c ea r 擘1 m 把d a9 0 0 d e k c t r o c a t a l y t i c a la c t i v i t yt o w a r dh y d r o g e np e r o x i d e t h eg l u c o s e b l o s e n s o rw h i c nw a sb a s eo na d s o r p t i o no fg l u c o s e o x i d a s ea tp tn p 洲w n t s ? 觚e b yu 8 i n g 呦0 p 哪i c l e sr e s u l t si ne x c e l l e n ts e n s i t i v i t y , l o wd e t e c t i o n l i m i t ， k e yw b r d s ：s o l 。g e l ；b i o s e n s o r ；i m m 。b i l i z e d e n z y m e s ；e l e e t r o c h e m i c a l d 印。s i t i 。n ； p r u s s i a nb l u e ；g l u c o s e v 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：蒋京利签- - 7 ：日期：2 0 0 8 年z 月2 5e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：蒋删导师签名：琢渚协 签字日期：2 0 09 年f 2 月2 s 日 签字日期：山裾年门月p 妇 第1 章引言 第1 章引言 随着生产力的发展，在工农业生产、环境保护、临床检验以及食品工业等 领域，每时每刻都有大量的样品需要分析和检验，而且往往要求在很短的时间 内完成样品检测，有的甚至要求在线或活体内直接检测。生物传感器作为直接 或间接检测生物分子、生理或生化过程相关参数的分析器件，由于具有灵敏度 高、选择性好、响应快、操作简便、样品需要量少、可微型化、价格低廉、可 以实现连续在位检测等特点，在生物医学、环境监测、食品医药工业等领域展 现出十分广阔的应用前景【1 1 。 生物传感器( b i o s e n s o r ) 以生物活性物质( 如酶、抗体、核酸、细胞等) 为生物敏感基元，通过信号转换器将生物化学信号转化为相应物理化学信号从 而实现检测目的。其中以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换 器，以电势、电流或电容为特征检测信号的生物传感器称为电化学生物传感器 ( e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ) ，也称为生物电极【2 】。电化学生物传感器以其选择 性好、灵敏度高、分析速度快、操作简便、可实现在线、活体分析等特点，在 分析化学的研究中起着越来越重要的地位，已广泛用于生命科学、环境分析、 药物分析等领域。 。 溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而 固化，再经过热处理而制得氧化物或其他化合物固体的方法。早在1 9 世纪中期， e b e l m a n 和g r a h a m 就发现了正硅酸四乙酯( t e o s ) 在酸性条件下水解可以得 到“玻璃状透明材料，并且从此粘性的凝胶中可制备出光纤及光学透镜的现 象，但由于凝胶的易碎性限制了它的技术应用。1 9 世纪末至上个世纪2 0 年代， 凝胶中产生的l i e s e g a n gr i n g s 现象吸引了大量学者投入到溶胶凝胶过程的周期 性沉淀现象的研究，而对此过程的物理化学原理认识不足。直到上世纪五、六 十年代，r o y 等才注意到了溶胶凝胶体系高度化学均匀性，并采用此方法成功 地合成了大量用常规方法不能制备的新型陶瓷复合材料。尤其是近2 0 年来，溶 胶凝胶技术在薄膜、化学、生物、复合材料等方面展开了其广阔的应用前景【3 】。 1 1 生物传感器 第1 章引言 1 1 1 概述 生物传感器是由生物识别元件( b i o r e c e p t o r ) 和换能器( t r a n s d u c e r ) 两个 部分组成的分析工具或系统，其中生物识别元件包括酶、抗体、微生物等生物 活性物质。这些活性物质固定在一定基质上，并且与适当的转换器件密切接触， 当被测物通过扩散进入到生物敏感膜层中，经分子识别，发生生化反应以后， 所产生的信息被相应的换能器转化为定量的物理信号如电、光等，从而实现对 特定底物的快速检测，其工作原理如图1 1 所示。 一 测试仪器 分折耪 ! 一；竺三， 换缝器 _ ：剜物质 图1 1 电化学生物传感器的原理图 生物传感器按转换类型不同可以分为电化学生物传感器、光学传感器、热 敏电阻式生物传感器、压电晶体式生物传感器等；按被选生物化学受体的不同， 可分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生物传感器、细胞传感器等； 按生物传感器与底物作用机理不同，又r 一 将生物传感器分为生物催化型传感器 和生物亲和型传感器。酶传感器、组织传感器、微生物传感器等为生物催化型 传感器，而免疫传感器和d n a 传感器等属于生物亲和型传感器。生物传感器由 于灵敏度及选择性高，能将分离过程和检测过程技术合为一体，因而受到广泛 重视，目前发展很快，己应用于临床医学检测、工业过程控制、环境检测、化 学物质安全性评价以及食品、制药等许多领域。而电化学传感器由于其测定原 理相对简单，仪器设备价格便宜，目前在各种传感器中起着主导作用，其研究 已经取得显著进展。 1 1 2 电化学生物传感器 电化学生物传感器是以生物材料为敏感元件，以电化学电极为信号转换器， 以电势或电流为特征检测信号的生物传感器。由于电化学生物传感器表面的微 结构可提供各种能利用的势场，使待测物能进行有效的分离富集，借控制电极 电位又能进一步提高选择性，而且还能把测定方法的灵敏度和表面物质化学反 应的选择性相结合，因而可以认为电化学传感器是把分离、富集和选择性测定 2 第l 章引言 三者合而为一的理想体系，其在提高选择性和灵敏度方面具有独特的优越性。 电化学传感器种类繁多，在生化传感器研发及其商业化领域中处于重要地位， 可广泛应用于医疗保健、食品工业、农业、环境等领域，被认为是2 1 世纪最具 有前途的研究领域之一。 根据检测信号的区别，电化学传感器包括p h 、电势、电导、电流式几种， 其中电位传感器及电流传感器在分析科学中有着极其重要的应用。电位型传感 器将生物识别反应转换为电信号，该信号与生物识别反应过程中产生或消耗的 活性物质浓度对数成正比，从而与待测物质的浓度对数成正比。电位型离子选 择电极的选择性渗透离子导电膜可设计成与待测离子相关的产生电位信号的敏 感膜，测试在电流为零的条件下进行。电流型生物传感器通过固定工作电极的 电位给电活性的电子转移反应提供驱动力，探测电流随时间的变化，该电流直 接测量了电子转移反应的速度，反映了生物分子识别的速度，即该电流正比于 待测物质的浓度。 酶是一种能催化生命体系的化学反应蛋白，作为一种催化剂，它具有催化 效率高，选择性好等优点，因而，生物电化学，特别是酶的电化学是电化学研 究中极为活跃的领域【4 】。酶传感器反应原理是传感器敏感膜中包含有固定化的 酶，当酶与被测定物质反应时，反应产物被传感器响应。关于酶电极的报道出 现在6 0 年代【5 j ，目前已经报道的酶传感器有几百种，商品化的有几十种，如葡 萄糖氧化酶电极传感器、l 乳糖单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器、胆固 醇传感器、生化需氧测定仪等。通过对酶电极进行深入研究不仅可以获得其热 力学和动力学性质，还可以了解生物体内的能量转换和物质代谢，探索生物分 子的结构及其在生命体内的生理作用和作用机制，这些研究对理解基于组织、 细胞、微生物分子的传感器也有着重要的意义。 1 1 3 生物传感器的三代历程 电化学生物传感器是最早问世的生物传感器。2 0 世纪6 0 年代，c l a r k 和l y o n s 首先提出使用含酶的膜将尿或葡萄糖转变为产物，使用p h 或氧电极来检测的设 想1 4 j 。在1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 把含有葡萄糖氧化酶的聚丙烯酞胺凝胶膜固 定到氧电极上制备了第一支葡萄糖传感器，开创了生物传感器的历史【6 1 。自2 0 世纪8 0 年代以来，由于生物技术与传感技术的提高与应用，带动了生物传感器 的发展，使之成为国际上广泛研究的重要课题。 3 第1 章引言 按照酶或者其它生物分子与电极之间的电子转移机理不同，电化学生物传 感器大致分为三代生物传感器【7 1 。 1 1 3 1 第一代生物传感器 以氧为电子传递体来沟通酶的电活性中心与电极之间的电子通道【8 9 】，实现 电催化的生物传感器为第一代电化学生物传感器。以葡萄糖氧化酶为例，此类 生物传感器通过检测反应物的消耗( 0 2 的减少) 或产物的增加( h 2 0 2 或者旷 的增加) 来检测反应物浓度的变化。但这种检测易受环境中氧分压的影响，晌 应时间较长且难以进行活体分析，灵敏度也不高，同时，h 2 0 2 在金属电极或者 碳电极上存在着氧化过电位高，抗坏血酸、尿酸等严重干扰，所以严重影响了 第一代电化学生物传感器的广泛应用。 1 1 3 2 第二代生物传感器 以小分子电子媒介体代替氧来沟通酶的电活性中心与电极之间的电子通 道，通过检测媒介体在电极上被氧化的电流变化来测量底物浓度的变化，由此 为基础构建了第二代电化学生物传感器。目前用于生物传感器研究的电子媒介 体按分子结构特点和分子量大小可以分为有机小分子和高分子媒介体。有机小 分子媒介体包括：二茂铁及其衍生物 1 0 - ii 】、钉和锇等金属的配合物【1 2 1 4 1 、有机 染料 1 5 - 1 6 】、醌及其衍生物【17 1 、四硫富瓦烯、富勒烯和导电有机盐【1 8 】等。它们 具有以下优点：( 1 ) 能迅速与还原态酶反应；( 2 ) 过程的可逆程度高：( 3 ) 有 较低的氧化电位；( 4 ) 氧化态和还原态都较稳定；( 5 ) 对0 2 反应呈惰性。第二 个阶段是以媒介体修饰剂的电催化为基础而构建的，它增加了化学修饰层，扩 大了基体电极检测化学物质的范围，同时也提高了测定的灵敏度。电子媒介体 的使用促进了电子传递，降低了工作电位，己成功开发出性能优良的产品，但 是使用介体存在着着电极制作复杂、介体污染电极、测量电位比较正，电活性 物质干扰测定等问题【1 9 】。 1 1 3 3 第三代生物传感器 1 9 7 8 年俄国科学家发现在分子氧存在下漆酶( 1 a c c a s e ) 【2 0 1 和过氧化物酶 ( p e r o x i d a s e ) 【2 i 】可以实现直接电子转移。此后，其它蛋白质及酶的直接电化学 从不同角度得到广泛的研究。这种不需要电子媒介体的存在，利用生物功能物 质与电极间的直接电子转移即直接电化学，实现生物分子的直接电催化，由此 4 第1 章引言 构建的生物传感器为第三代电化学生物传感器【2 2 圆】。这种传感器己成为生物电 化学研究最重要的发展方向之一。寻找有效的方法和手段实现蛋白质和酶的直 接电化学，以满足生物医学、环境监测和工业快速分析的需要，必将成为这个 领域的发展趋势。但氧化还原蛋白质( 酶) 与裸露的电极表面直接接触通常会 引起蛋白质( 酶) 的结构和功能发生变化，并失去其生物活性，使蛋白质( 酶) 在电极上的电子转移受到抑制【3 0 1 ，而且蛋白质( 酶) 的电活性中心通常被包埋， 不易暴露，难于接近电极表面，因此实现蛋白质( 酶) 与电极间的直接电子转 移通常比较困难。当酶固定在电极表面时，只有第一层的酶才能够实现电子直 接转移。电极表面所固定的具有活性的酶的量限制了生物传感器的稳定性和灵 敏度，同时，直接吸附在碳、铂、金表面的蛋白质分子易失活，从而导致电极 表面的污染，影响蛋白质的电子的直接转移。 实现蛋白质的电子转移的方法之一为酶的各向异性和定向排列设计合适的 表面，如自组装单层表面( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 。自组装单层表面 是指某些物质通过静电吸附或共价键合固定在固液、固气界面，自发地组装成 一种热力学稳定且高度有序的单分子层f 2 3 捌1 。含硫化合物在金电极表面【3 2 。3 7 1 、硅 烷在二氧化硅【3 8 0 9 域其它氧化物电极表面都能发生这种自组装。它可以使固体 表面带上所需地官能团，实现修饰电极功能的多样化，提高检测的灵敏度和选 择性，为生物传感器的制备提供了良好的途径。 实现蛋白质的电子转移的另一种方法是将酶分子包埋在一些导电材料中。 应用这些导电材料构成的酶固定的基质某些意义上增加了电极的实际面积，他 们允许固定在这个基质中的远离电极表面的酶分子也能够实现直接电子传递。 这一点对于制备微型化的生物传感器非常重要。迄今为止，已有大量文献报道 了酶在含有导电纳米材料及导电聚合物膜中的包埋【4 0 1 。这种方法制备的传感器 固定酶容量比较大，通用性强，可渗入特定粒子，以增加密度或赋予磁性等其 它性质，因此得到了较为广泛的研究。 新型纳米材料的合成为发展新型生物传感器提供了新的途径。纳米材料具 有比表面积大，表面反应活性高，表面活性中心多，催化效率高，吸附能力强 等优良的特性。当纳米材料作为酶固定的载体时，能增加酶的负载量，提高传 感器的灵敏度和选择性。例如金纳米粒子可以提高葡萄糖氧化酶的生物活性及 葡萄糖传感器的稳定性等【4 1 1 。 5 第1 章引言 1 1 4 电化学生物传惑器的固定化技术 生物分子识别物质的固定化技术是制作电化学生物传感器的关键技术，很 大程度影响着生物传感器的稳定性、灵敏度等主要性能。因此，它必须兼顾生 物分子识别物质的活性和分子识别物质固定的牢固性两个方面。常见的固定化 技术有物理吸附【4 2 4 3 1 、物理包埋【4 4 4 9 1 、共价键合【5 0 5 2 1 、共价交联 4 4 3 、自组装等 技术。 1 1 4 1 物理吸附法 利用物理吸附法将分子识别物质固定在电极表面是一种较为简单的固定化 技术。条件较为温和，可保持分子识别物质较高的生物活性。由于载体的不同， 载体与分子识别物质的吸附作用力不同。常用的载体包括天然或人工合成的无 机或有机高分子材料等。如果载体是离子交换剂，则生物识别物质如酶、抗体 或抗原、d n a 借助静力吸附在载体表面；如果载体表面是非极性的，则靠范德 华力将分子识别物质吸附在载体表面。物理吸附法存在以下的缺点：分子识别 物质与载体表面结合力弱；在表面上取向不规则分布；制得的生物传感器易发 生分子识别物质的泄漏；分子识别物质的负载量有限。 1 1 4 2 物理包埋法 物理包埋法一般是在温和条件下的聚合物包埋法，在形成聚合物的同时， 将分子识别物质包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构中；或利用物理 方法把分子识别物质包裹在溶胶凝胶中；也可将分子识别物质包埋在类脂层中。 常用的高分子凝胶有：聚丙烯酰胺、明胶、聚乙烯醇、丝素蛋白胶。高分子聚 合物的典型代表有聚吡咯( p p y ) 、聚苯胺( p a n ) 和聚噻吩( p t h ) 等。 1 1 4 3 共价键合法 将分子识别物质通过共价键与电极表面结合而固定的方法成为共价键合 法。通常要求在低温、低离子强度和生理p h 条件下进行。共价键合法的过程通 常包括三个步骤：基底电极表面的活化、分子识别物质的偶联及除去键合疏松 的分子识别物质。这些步骤中每一步合适的试验条件都取决于生物活性单元及 偶联剂的特性。共价键合法的优点是载体与分子识别物质的连接较为牢固。其 缺点主要有：共价键合发应使酶的活性损失较大，且操作过程复杂、成本较高。 6 第1 章引言 1 1 4 4 共价交联法 共价交联法是用双功能基团试剂与分子识别物质交联成不溶性的网状结 构，从而使分子识别物质固定于电极表面的方法。通过采用双功能基团试剂， 在分子识别物质之间、分子识别物质与凝胶聚合物之间交联形成网状结构而使 分子识别物质固定化。常用的双功能基因试剂有戊二醛【5 3 - 5 4 1 、氯甲酸乙酯和2 ， 4 二异氰酸酯。如戊二醛能在温和条件下与蛋白质的自由氨基反应，其原理反应 式如下： 载体- - n h 2 + o h c ( c h 2 ) 3 一c h o + n h 2 一酶一哼 载体- - n h c h ( o h ) ( c h 2 ) 3 一c h ( o h ) n h - - 酶一 许多研究工作采用牛血清白蛋白固定分子识别物质。采用牛血清白蛋白可 让较多的分子间成键且防止分子识别物质过于拥挤，同时也为分子识别物质提 供了合适的微环境，从而提高了测定灵敏度。此方法操作简单、固定化效率高， 常用来作为其它固定化方法的辅助手段以防止分子识别物质的泄漏。交联法的 缺点主要为反应难以控制、形成的分子识别物质膨松、所需生物样品量多、扩 散阻力大。 1 1 4 5 自组装法 自组装法是一种基于化学发应的化学吸附法【5 5 1 。自组装膜的基本组装步骤 是：将基片放入含有活性物质的溶液或活性物质的蒸汽中，活性物质在基片表 面发生自发的化学吸附或化学反应，在基片表面形成化学键连接的二维有序单 层膜。如果单层膜表面也是具有某种发应活性的活性基团，则又可与别的物质 反应，如此反复，构筑同质或异质多层膜。采用此技术制备的超薄层体系通常 有两类：一类是巯基化合物在金、银、铜、铂表面吸附形成的单层，另一类是 在硅、玻璃、金属氧化物表面通过硅烷化反应形成的单层。其中，硫醇类分子 自组装单层( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ，s a m ) 是被研究得最为广泛和深入的体 系。如在单晶金电极表面先修饰一层硫醇类化合物，这是通过分子间的引力进 行自组装构成的单分子层，然后再通过自组装方法将酶介体和酶一层一层地修 饰与电极上，构成传感器。自组装单分子膜制作简便，具有良好地稳定性、有 序性。但由于起步较晚仍是一种不成熟的方法，许多问题如杂质吸