（分析化学专业论文）基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的研究.pdf

硕上学位论文 摘要 生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系 中进行在线连续监测等优点，在化学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事 等领域有重要的应用价值。电化学生物传感器研究内容十分丰富，一直处于生物 传感器的主导地位，取得大量研究成果，并已经获得广泛应用。纳米材料具有独 特的光学、电学和催化特性及良好的生物相容性。将纳米材料应用于电化学生物 传感器的制备可以显著提高传感器的性能。本文合成了氧化石墨烯和石墨烯，并 将石墨烯用于电化学生物传感器的构建。另外，还发展了基于碳纳米管作电化学 标记物的新型电化学d n a 分析技术。所构建的生物传感器具有性能优良，可靠性 良好，灵敏度高等优点。具体内容如下： ( 1 ) 目前，物理学中热门材料之一就是单原子厚的二维晶体石墨烯。石墨烯由 于其独特的力学和电学的性质引起了广泛的注意。本文以石墨为原料，采用化学 合成途径合成了氧化石墨烯和石墨烯。具体包括三个步骤：石墨氧化、超声剥离 和化学还原。通过x r d 、t e m 、f t i r 和r a m a n 光谱等手段对氧化石墨烯和石 墨烯进行了详细的表征研究( 第2 章) 。 ( 2 ) 石墨烯具有大的比表面积、良好的化学稳定性以及优良的电子传递能力， 是一种理想的电极修饰材料。贵金属纳米颗粒例如钯纳米粒子，对过氧化氢有很 好的电催化效果。将钯纳米粒子固定在石墨烯表面后由于钯纳米粒子和石墨烯在 电催化方面的的协同作用能提高生物传感器的灵敏度。壳聚糖是一种带氨基的天 然生物高聚物，有良好的成膜性能和生物相容性，能为固定的酶提供一个很好的 微环境。用化学方法合成了钯纳米颗粒石墨烯壳聚糖复合物，并用该复合物修饰 电极与葡萄糖氧化酶交联，得到有较高灵敏度的葡萄糖传感器( 第3 章) 。 ( 3 ) 建立了一种基于单链d n a 修饰m w n t s ( s s d n m w n t s ) 作为电化学标 记物磁分离检测d n a 的电化学传感技术。在这种分析方法中，通过非共价作用可 将s s d n a 修饰到m w n t s 表面，这不仅能使m w n t s 稳定地分散水溶液中，同时 又能使修饰在m w n t s 表面d n a 与目标d n a 发生杂交反应。另外为了提高碱基 错配识别的能力，在磁性纳米颗粒表面修饰了发夹探针。当目标d n a 存在时，磁 珠表面的发夹探针构象发生变化，茎部双链结构变为柔性单链结构，再通过传统 的磁分离d n a 夹心反应可以选择性收集s s d n a m w n t s 标记物，当吸附到十八烷 i i 基于低维纳米碳材料的i h 化学牛物传感器的研究 基硫醇绝缘膜修饰的电极表面后，产生了二茂铁的氧化还原峰电流。该方法对目 标d n a 浓度检测的动态线性范围为lp m 5 0 0n m ，检测限可达0 9p m 。另外还 可利用此方法对乙肝病毒特异性序列突变情况进行检测，使得突变型和野生型得 到了很好的区分( 第4 章) 。 关键词：电化学传感器；葡萄糖传感器；d n a 传感器；氧化石墨烯；石墨烯； 钯纳米颗粒；碳纳米管 i i i 硕上学位论文 a bs t r a c t b i o s e n s o r sh a v ev a l u a b l ea p p l i c a t i o n si nc h e m i s t r y , b i o m e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a l p r o t e c t i o n ，f o o di n d u s t r y , m e d i c i n ea n dm i l i t a r ya f f a i r sb e c a u s eo fi t sg o o ds e l e c t i v i t y , h i g hs e n s i t i v i t y , f a s tr e s p o n s e ，l o wc o s ta n dc o n t i n u o u so n 1 i n ed e t e c t i o ni nc o m p l e x s y s t e m e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o ri sd o m i n a n ti nb i o s e n s o r s ，w h o s er e s e a r c hc o n t e n t s a r er i c ha n dr e s e a r c hf r u i t sa r ep l e n t y , a n da p p l i c a t i o n sa r ew i d e n a n o s t r u c t u r e d m a t e r i a l sa r ea t t r a c t i v ei nt h ed e v e l o p e m e n to fb i o s e n s o r sd u et ot h e i rn o v e lo p t i c a l ， e l e c t r i c a l ，e l e c t r o c a t a l y t i ca n db i o c o m p a t i b l ep r o p e r t i e s t h ep e r f o r m a n c eo ft h e r e s u l t i n ge l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sc o u l db eg r e a t l yi m p r o v e dw i t ht h ea p l l i e a t i o no f n a n o m a t e r i a l s i nt h i s t h e s i s ，g r a p h e n eo x i d ea n dg r a p h e n ew e r es y n t h e s i z e da n d a p p l i e df o rt h ep r e p a r a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s a d d i t i o n a l l y , w ed e v e l o p e d an o v e le l e c t r o c h e m i c a l s t r a t e g y b a s e do ns s d n a c o a t e dm w n t sa st h e e l e c t r o c h e m i c a ll a b e l s t h ed e v e l o p e db i o s e n s o r sh a v et h ea d v a n t a g e so fe x c e l l e n t p e r f o r m a n c e ，g o o dr e l i a b i l i t ya n dh i g hs e n s i t i v i t y t h ed e t a i l sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： ( i ) t h e s ed a y s ，t h eh o t t e s tm a t e r i a li np h y s i c si sg r a p h e n e ( g r ) ，t h ef i r s t e x a m p l eo ft h es t r i c t l yt w o - d i m e n s i o n a l ( 2 d ) a n do n e a t o m t h i c ks h e e t ，w h i c hh a s b e e na t t r a c t i n gm u c ha t t e n t i o n o w i n gt o i t s u n i q u em e c h a n i c a l a n d e l e c t r o n i c p r o p e r t i e s i np r e s e n ts t u d y , g r a p h e n eo x i d ea n dg r a p h e n ew e r es y n t h e s i z e d b y c h e m i c a lm e t h o du s i n gg r a p h i t ea st h er a wm a t e r i a l t h r e e s t e p sw e r ei n v o l v e d ： g r a p h i t eo x i d a t i o n ，u l t r a s o n i ce x f o l i a t i o n ，a n de h e m i c a lr e d u c t i o n t h eo b t a i n e d g r a p h e n eo x i d ea n dg r a p h e n ew e r ef u l l yi n v e s t i g a t e db yx r d ，t e m ，f t i ra n dr a m a n s p e c t r o s c o p y ( i nc h a p t e r2 ) ( 2 ) g r a p h e n er e p r e s e n tan e wk i n do fp r o m i s i n gc a r b o nm a t e r i a lo v e rt h ep a s t y e a r so w i n gt ot h eu n i q u ee l e c t r i c a lp r o p e r t i e ss u c ha sh i g hs u r f a c e t o v o l u m er a t i o ， h i g hc h e m i c a ls t a b i l i t ya n daf a s te l e c t r o n - t r a n s f e rr a t e n o b l en a n o p a r t i c l e s ( n p s ) ， s u c ha sp a l l a d i u m ( p d ) ，e x h i b i te l e c t r o c a t a l y t i cb e h a v i o rt oh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) i m m o b i l i z i n gp d n p so ng r a p h e n em a yg e n e r a t es y n e r g yo ne l e c t r o c a t a l y t i c a c t i v i t y a n dt h u se n h a n c et h e s e n s i t i v i t y o ft h e b i o s e n s o r c h i t o s a n ( c s ) i sa n a t u r a l b i o p o l y m e rw i t ht h ep r i m a r ya m i n ea tt h ec 2p o s i t i o no ft h eg l u c o s a m i n e r e s i d u e s i ti sb i o c o m p a t i l ea n dc a np r o v i d eag o o dm i c r o e n v i r o n m e n tf o rp r o t e i n so r e n z y m e s w ep r e p a r e dp d n p s c s g rc o m p o s i t et h r o u g hac h e m i c a lr o u t ea n dr e p o r t e d 基于低维纳米碟末于料的屯化学牛物俜感嚣的研究 ap d n p s c s g r b a s e d n a n o c o m p o s i t ef i l ma n dd e m o n s t r a t e e di t sa p p l i c a t i o nf o r s e n s i t i v eg l u c o s es e n s i n g ( i nc h a p t e r3 ) ( 3 ) w ee x p l o i t e ds i n g l e - s t r a n d e d - d n a - w r a p p e dc n t sa st h ee l e c t r o c h e m i c a l l a b e l sf o rt h em a g n e t i cs e p a r a t i o n - b a s e dd n a h y b r i d i z a t i o na s s a y i nt h i sm e t h o d ，t h e n o n c o v a l e n tw r a p p i n go fc n t sw i t hs i n g l e s t r a n d e dd n av i ah y d r o p h o b i ca n d 兀兀 s t a c k i n gi n t e r a c t i o n sn o to n l yi m p a r t sa q u e o u ss o l u b i l i t ya n ds t a b i l i t yo fc n t sb u ta l s o a l l o w saf u r t h e rm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nr e a c t i o nb e t w e e nt h ed n ao n t ot h ec n t sa n d t h et a r g e td n a m o r e o v e r , i no r d e rt oe n h a n c et h ed i s c r i m i n a t i o nc a p a b i l i t yf o rt h e s i n g l eb a s em i s m a t c h ，t h em a g n e t i cb e a d sw e r em o d i f i e dw i t ht h eh a i r p i nd n a w h e n t h ep r o b e sh y b r i d i z e dw i t ht h et a r g e tn u c l e i ca c i d ，t h ea l l o s t e r yo ft h eh a i r p i nd n ao n t h em b ss u r f a c ew a ss w i t c h e da n dt h es s d n a - w r a p p e dc n t sl a b e l sw e r es e l e c t i v e l y c o l l e c t e d b ym a g n e t i cs e p a r a t i o n - b a s e d d n ah y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n w i t ht h e a s s e m b l yo ft h e s ee l e e t r o c h e m i c a l l a b e l so n 也ecl8 h 3 7 s h b l o c k e de l e c t r o d es u r f a c e ，a s t r o n gr e d o x c u r r e n tw a so b t a i n e d t h e d e v e l o p e ds t r a t e g yc o u l dq u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n et h et a r g e td n ai nt h ed y n a m i cr a n g eo f1p m 。5 0 0n mw i t ht h ed e t e c t i o n l i m i to f0 9p m t h ep r e s e n ta p p r o a c hh a sb e e nd e m o n s t r a t e dw i t ht h ei d e n t i f i c a t i o no f as i n g l eb a s em u t a t i o ni nh e p a t i t i sbv i r u ss p e c i f i cs e q u e n c e ，a n dt h ew i l dt y p ea n d m u t a n tt y p ew e r es u c c e s s f u l l ys c o r e d ( i n c h a p t e r4 ) k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r ；g l u c o s es e n s o r ；d n as e n s o r ；g r a p h i t eo x i d e ； g r a p h e n e ；p a l l a d i u mn a n o p a r t i c l e s ；c a r b o nn a n o t u b e s v 硕l 二学位论文 1 1 生物传感器概述 第1 章绪论 传感器是能感受特定的被测量的物质量并按照一定规律将其转换成可用信号 的器件或装置，通常由敏感元件、转换元件及相应的机械结构和电子线路所组成1 1 1 。 1 9 6 2 年c l a r k 等提出了把酶与电极结合来测定酶底物的设想，1 9 6 7 年u p d i k e 和 h i c k s 研制出世界上第一支葡萄糖氧化酶电极，用于定量检测血清中葡萄糖含量， 标志着生物传感器的诞生。此后，随着生物、化学、物理学、医学、电子技术等 相关学科的迅速发展，各种类型的生物传感器相继出现；而生物传感器是其中一 类特殊的传感器，是一种对生物物质敏感并将其待测物质转换为声、光、电等信 号进行检测的仪器。由于其具有灵敏度高、选择性和稳定性好、价格低廉、能在 复杂的体系中进行快速在线连续监测等特点，因此它能广泛应用于基础研究、生 物、临床医学、农业和畜牧兽医、材料与化学、军事、过程控制和环保等领域1 2 西j 。 生物传感器诞生在2 0 世纪6 0 年代，而对其研究的全面展开是在2 0 世纪 8 0 年代。尤其8 0 年代中期是生物传感器发展的第一个高潮时期，其代表之一是 介体酶电极，它不仅开辟了酶电子学的新研究方向，还为酶传感器的商品化奠定 了重要基础。而2 0 世纪9 0 年代至今，生物传感器也获得了迅速地发展，表现在： 一是生物传感器的市场开发获得显著成绩；二是生物亲和传感器的技术突破，这 成为生物传感器发展的第二个高潮。 1 1 1 生物传感器的原理与特点 生物传感器定义为“使用固定化的生物分子( i m m o b i l i z e db i o m o l e c u l e s ) 结合 换能器，用来侦测生物体内或生物体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用 后产生响应的一种装置”。一般都包括二个主要组成部分：其一是生物分子识别元 件( 包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质) ，其二是信 号转换器( 如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等) ，把分子识别功能基底同高 灵敏的信号转换器件相结合，就构成多种多样、千变万化的生物传感器，其工作 原理如图1 1 。被测物通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别，发生生化反应 后，所产生的信息被相应的转换器转换成与被测物浓度相关的信号。 与传统的分析方法相比，生物传感器具有以下特点：1 ) 速度快、准确度高，可以 实现连续在线检测；2 ) 一般不需进行样品的预处理，可将样品中被测组分的分离和 检测统一为一体，操作系统简单，容易实现自动分析；3 ) 专一性强；4 ) 成本远低于大 型分析仪器、作用广，便于推广普及。 基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的研究 生信信 l 被分析物： 物 燃反应 号 蝴号 号 敏转处 感 换 理 膜器器 图1 1 生物传感器工作原理示意图 1 1 2 生物传感器的分类 生物传感器可从不同的角度进行分类，主要有以下三种方法： ( 1 ) 按照其感受器中所采用的生命物质分类，可分为：微生物传感器【7 1 、免疫传 感器【8 ，9 1 、组织传感器【10 1 、细胞传感器【1 、酶传感器【1 2 , 1 3 】、d n a 传感器等【1 4 , 1 5 】。 ( 2 ) 根据生物传感器的信号获取方式可分为：电化学生物传感器【1 6 】、光化学 生物传感器【17 1 、压电生物传感器【1 引、测热型生物传感器【1 9 】等。 ( 3 ) 按生物传感器与底物作用机理的不同，又可将传感器分为生物催化型传感 器和生物亲和型传感器。 1 2 电化学生物传感器 电化学生物传感器是将生物活性材料与电化学换能器( 即电化学电极) 结合 起来组成的生物传感器。它的核心部件是检测器，主要由两部分组成：一是生物 敏感元件，由对被测定的物质( 底物) 具有高选择性分子识别功能的材料膜构成； 二是转换器，它能把膜上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质信息转换成电 信号，电信号经过电子信息技术的处理在仪器上显示并记录下来，还可以进一步 进行数据处理和分析。电化学生物传感器研究内容十分丰富，取得大量研究成果， 并已经获得广泛应用。 1 2 1 电化学酶传感器 电化学酶传感器又称酶电极，是最早研发的一种生物传感器。它是在固定化 酶的催化作用下，生物分子发生化学变化后，通过换能器记录变化从而间接测定 出待测物浓度。其中有关电化学生物传感器的报导中，大多数都是基于酶电极， 这是因为作为生物催化剂的酶高效、专一，再加上温和的反应条件和化学放大作 用等，可结合化学修饰电极表面结构和功能的特异性设计，使得酶基电化学生物 传感器成为生物传感器研究的主流【2 0 1 。 按测量信号的不同，电化学酶传感器可分为电流型酶传感器、电位型酶传感 器和电导型酶传感器。电流型酶传感器是记录电极上酶促反应产生的电流信号， 硕 ：学位论文 从而建立与待测物浓度之间的关系，它所采用的是获得电流信号的检测换能装置 2 1 - 2 4 。电位型传感器是基于离子选择性电极原理而发展起来的，固定到电极表面 的酶对底物进行催化，产生离子型物质，能引起指示电极电位的改变( 即酶电极 与参比电极间输出的电位信号) ，电位变化关系服从n e r n s t 方程1 2 引。电导型传感器 是利用在酶促反应中，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶液导 电性的改变，以溶液电导率为响应信号【2 6 2 7 1 。电流型传感器与电位型传感器相比 较具有更简单、直观的效果。并且与电位型传感器相比，? 电流型传感器的输出信 号与被测物的浓度关系更直观，读数误差更小，灵敏度更高，使得电流型酶传感 器是生物传感器领域中研究较多的一类的电化学生物传感器 2 8 , 2 9 l 。 按照酶分子与电极间电子传递的机理不同，电化学生物传感器大致经历了三 个发展阶段【3 0 1 ，如图1 2 所示：第一阶段( 如图1 2 a 所示) ，以氧为电子传递体 来沟通酶的电活性中心与电极之问的电子通道，实现电催化的生物传感器为第一 代电化学生物传感器，此类生物传感器一般通过检测产物h 2 0 2 的增加来反映被测 物的浓度变化。但是这种检测易受环境中氧分压波动的影响，响应时间较长，其 灵敏度也不太高。而且检测h 2 0 2 一般在较高的电位( + 0 6 + 0 8v ，v s s c e ) 下进 行。这样高的检测电位使抗坏血酸、尿酸、乙酰氨基酚等电活性物质干扰严重。 所以严重影响了第一代电化学生物传感器的广泛应用。为克服第一代传感器受氧 分压影响和h 2 0 2 过电位高、干扰多、受氧溶解度限制等缺点，自7 0 年代起人 们开始用小分子的人造电子传递媒介体来代替氧沟通酶活性中心与电极之间的电 子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化，构造了第二代生物 传感器( 如图1 2 b 所示) 。常用的电子媒介体有：铁氰化物、聚合物、酚类、导电 有机盐类和二茂铁及其衍生物等【3 卜”】等。媒介体存在的方式有两种：一种是溶解 在试样的溶液中，另一种是固定在生物敏感膜内。其中将媒介体固定使得在测量 时无需加入其它试剂，为检测提供了方便，因此已成为传感器研制的一种趋势。 电子媒介体加强了酶与电极间的电子传递，加速了电极反应，降低了天然氧浓度 的影响，提高了测定的灵敏度。此外，采用氧化还原电位较低的电子媒介体，可 降低工作电位，减少了还原型电活性物质的影响，干扰少，测量浓度线型范围较 宽。在本研究的第三章制备的酶传感器就是属于第二代生物传感器。尽管媒介体 型第二代生物传感器有许多优点，人们仍在追求酶与电极间的直接电子转移，从 而发展了利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号的转换第三代生物传感 器( 如图1 2c 所示) 。由于酶蛋白质难于直接氧化，目前第三代生物传感器仍处 于初步探索阶段。 基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的研究 习 薷捷经典舅l l 耋擞t b ) 第。代舟体辩i 蛙檄 8 5 脱乙酰度) 购于s i g m a 公司( 美国) ： 戊二醛；壳聚糖；氯乙酸；邻苯二甲酸酐；水合肼；硼氢化钠；氯化钯；乙二醇； 醋酸；磷酸盐缓冲溶液( p b s ，1 0 0m m ) ：由o 0 1mn a 2 h p 0 4 和o 0 1mk h 2 p 0 4 配制，作为支持电解质；实验中所用的其它试剂均为分析纯，而且直接使用没有 经过进一步的提纯；所用水均为二次蒸馏水；所有实验均在室温下进行，约为2 5 ， 除非有特殊说明。 超声仪( k q 2 5 0 型号，高频数控超声波清洗器) 购于昆山市超声仪器有限公 司；真空干燥箱( d z f 6 0 5 0 型号，上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ；透射电 镜( j e m 3 0 1 0 ，j e o l ，c o l t d ，j a p a n ) 。循环伏安分析和电流检测在c h i7 6 0 b ( s h a n g h a i ，c h i n a ) 电化学工作站中进行；电化学实验采用三电极系统( 1 0 0m l ) ， 以修饰玻碳( g c e ，直径4 0r a m ) 电极为工作电极，饱和甘汞电极( s c e ) 为参 比电极，铂电极为对电极。所有检测和报道电位均是相对于s c e 。 3 2 2 钯纳米粒子石墨烯壳聚糖( p 心帅s c s g r ) 的合成 用第二章合成的氧化石墨烯为原料。把氧化石墨烯( 2 0 0m g ) 加入到1 0 0m l 二次蒸馏水中，使其浓度约为2 m g m l 。往该氧化石墨烯溶液中加入氯乙酸( 1 0 0 g ) 反应2h 得到羧基功能化的氧化石墨烯。过滤干燥后，将羧基功能化的氧化石 墨烯( 2 0 0r a g ) 溶于s o c l 2 ( 4 0m l ) 和d m f ( 1m l ) ，超声lh 分散。回流反应1 2 h 得到酰氯功能化的氧化石墨烯。将0 8 3g 邻苯二甲酸酐溶于6m l 含5 水的 d m f 加入0 3 9 壳聚糖在1 2 0 c 下反应8h 得到邻苯二甲酰壳聚糖。邻苯二甲酰壳 聚糖( 1 7 3 9 ) 与酰氯功能化的氧化石墨烯( 2 1 9 2r a g ) 在氮气保护下，搅拌反应2 h 得到壳聚糖修饰的氧化石墨烯。在将其分散在水合肼( 1 5m l ) ，在8 0 c 下反应 1 6 h ，反应完成后，过滤，用二次蒸馏水洗涤三次，得到含氨基的壳聚糖修饰的氧 硕十学位论文 化石墨烯。往该反应体系中加入硼氢化钠( 8 0 0m g ) ，8 0 c 下反应2h ，冷却到室 温后，过滤，用二次蒸馏水洗涤三次，在真空干燥箱中6 5 温度下干燥2 4h ，得 到目标产物c s g r ( 7 8r a g ) 。往c s g r 中加入氯化钯，再加入适量乙二醇还原得 至0p d n p s c s g r 复合物。 3 2 3p d n p s c s g r 和c s g r 电极的制备 首先在使用玻碳电极前，分别用l 和0 0 5l i m 的铝粉打磨电极，直到获得光 滑的玻碳电极镜面为止。然后冲洗干净，再分别用二次蒸馏水、乙醇溶液和二次 蒸馏水超声2m i n 。分别称量6m gp d n p s c s g r 复合物与c s g r 溶于3 m l 5 醋酸 溶液，超声2 4h 得到2 m g m l 的p d n p s c s g r 溶液和2 m g m l 的c s g r 溶液。分 别取6 1 1 l 滴于两支玻碳电极表面，在空气中自然干燥即可得到p d n p s c s g r 修饰 电极与作为对照的c s g r 修饰电极。 3 2 4 葡萄糖氧化酶的固定 分别将p d n p s c s g r 修饰电极与c s g r 修饰电极在o 5 戊二醛溶液中浸泡3 0 r a i n ，使戊二醛与带氨基的壳聚糖交联。用二次蒸馏水冲洗，在空气中自然干燥后， 再分别往电极表面滴9 “l3 m g m l 的葡萄糖氧化酶溶液，置于4 c 冰箱中过夜自然 干燥即可得到可得到所需的生物传感器。在第一次使用前，先在在1 0 0m mp b s ( p h = 7 5 ) 中搅拌洗涤以除去非共价连接的葡萄糖氧化酶。在不使用时，将制得 的生物传感器置于4 冰箱中干燥保存。 3 3 结果与讨论 3 3 1p d n p s c s g r 复合物的表征 利用透射电子显微镜对p d n p s c s g r 复合物的形貌进行了表征。图3 1a 图和 图3 1b 分别是p d n p s c s g r 复合物的透射电镜图和高分辨透射电镜图。通过透射 电镜图( 图3 1a ) 可以清楚地观察到p d n p s c s g r 复合物的纳米尺度的片状结构。 高分辨透射电镜( 图3 1b ) 图中的黑色颗粒就是p d n p s ，从图中可以清楚的看到 c s g r 表面较均匀地分散着p d n p s ，且这些纳米颗粒的直径集中在3 5n m 之间。 我们还考察了c s g r 与p d n p s c s g r 复合物在5 醋酸溶液中溶解的情况，如 图3 2 所示。从图中可以看出c s g r 和p d n p s c s g r 复合物很均匀地分散在5 醋 酸溶液中。这是由于共价修饰了壳聚糖之后，改善了c s g r 和p d n p s c s g r 复合 物的溶解性，推广了二者在电化学生物传感器中的应用。 基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的石) f 究 a圄 一 移 爹爹 图3 1 钯纳米粒子石墨烯壳聚糖复合物的t e m 图( a ) 和h r t e m 图( b ) 圆 图3 2 超声2 4h 后石墨烯壳聚糖( 左，2 m g m l ) 与钯纳米粒子石墨烯壳聚糖( 右，2 m g m l ) 分散在5 醋酸溶液中的光学照片 3 - 3 2p d n p s c s g r 修饰电极的电化学表征 在铁氰化钾溶液中进行循环伏安测定是表征修饰电极的重要方法。图3 3 分别 是p d n p s c s g r ( a ) ，c s g r ( b ) 修饰电极在含1 m 氯化钾的5m m 铁氰化钾溶液中的 2 2 硕一f ：学位论文 循环伏安图，扫描速度为2 0 m v s 。p d n p s c s g r 和c s g r 修饰电极均在o 3 2v 、 0 2 5v 处出现f e 3 + f e 2 + 的特征氧化峰和还原峰，氧化还原峰的峰间距仅为7 0 m v ， 说明是一个可逆的氧化还原过程。p d n p s c s g r 修饰电极的峰电流明显大于c s g r 修饰电极的峰电流，表明固载了钯纳米粒子的p d n p s c s g r 修饰电极的电子传递 能力有了明显提高。 ： 鼍 毒 1 ) o t 镪t i a l | n 图3 3p d n p s c s g r ( a ) ，c s g r ( b ) 修饰电极在含1mk c i 的5m mk 3 f e ( c n ) 6 溶液中 的循环伏安图 图3 4 是p d n p s c s g r 修饰电极在0 1m 硫酸溶液中的循环伏安图，电位范 围为0 3v 至1 2v ，扫描速度为5 0 mv s 。在o 0v 到o 3v 的范围可清楚地看到 氢的吸收解吸峰，以及p d 的特征氧化峰( 超过0 6v ) 和还原峰( o 4 1v ) ，再次说 明钯纳米颗粒已经成功地固定到了c s g r 上，与高分辨透射电镜的结果一致。 图3 5 a 为p d n p s c s g r 修饰电极在不同扫速条件( 2 0 1 0 0 0m vs o ) 下的循环伏 安图，从图中可以看到氧化还原峰的峰电流均随扫速的增加而增加。从图3 5 b 中 可以看出氧化还原峰电流与扫速平方根成良好的线性关系，表明修饰电极为扩散 控制。 基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的研究 p o t e m m a l v 图3 4p d n p s c s g r 修饰电极在0 1m 硫酸溶液中以5 0 m v s 速度，在一0 3 1 2v 问 的循环伏安图 p o t e n r l n w ( a ) 2 4 。、g一、o_9118 弓器-基o 硕十学位论文 ( s 船nr a t e ) o d ( b ) 图3 5p d n p s c s g r 修饰电极以不同扫速( 从里到外：o 0 2 ，0 0 5 ，o 0 8 ，0 1 ，0 1 2 ，o 1 5 ，0 1 8 ，0 2 ， o 3 ，0 4 ，o 5 ，0 6 ，0 7 ，0 8 ，0 9 ，1 ) 在含1mk c i 的5m mk 3 f e ( c n ) 6 溶液中的循环伏安图( a ) ， 峰电流与扫描速率平方根关系图( b ) 3 3 3p d n p s c s g r 修饰电极对过氧化氢的电化学响应 电极对过氧化氢良好的电催化活性，是构建基于氧化酶生物传感器的良好电 化学平台。图3 6 是p d n p s c s g r 修饰电极在含0 5m mh 2 0 2 的1 0m mp b s ( p h = 7 5 ) 的循环伏安图。从图中可以看出p d n p s c s g r 修饰电极对过氧化氢显示了很好的 电催化作用，氧化电流和还原电流大约分别始于o 4 v 和0 1 5 v 。如此强的电流信 号不仅是由于钯纳米粒子本身对h 2 0 2 有很好的电催化作用，还在于石墨烯的协同 作用，石墨烯本身也能催化h 2 0 2 氧化还原，碳纳米管的快速电子转移能力促进了 钯纳米颗粒的氧化还原活性。 3 3 4 葡萄糖生物传感器的性能 考察溶液p h 值对葡萄糖传感器电化学响应的影响。图3 7 是根据该传感器在 不同p h 的1 0m mp b s 中对0 0 8m m 的葡萄糖的响应电流制成的图。p h 的考察范 围从4 5 9 5 。从图中可以看出，葡萄糖传感器p h 为7 5 的p b s 中具有最高的灵 敏度，原因可能是固定在c s g r 修饰电极表面的葡萄糖氧化酶在p h 为7 5 时活性 毛i，-葺o-昌uio 基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的研究 ： 孽 k u p o t m t i z l ，v 图3 6p d n p s c s g r 修饰电极在含0 5m mh 2 0 2 的1 0m mp b s ( p h = 7 5 ) 的循环伏安图， 扫描速度0 1 v s 最大。当p h 逐渐降低或升高时，该传感器的灵敏度都逐渐降低。这与葡萄糖氧化 酶在接近中性的环境下活性最大的性质也相符合，过酸或过碱的环境都会导致葡 萄糖氧化酶的活性降低甚至变性。在接下来的测试中，都采用p h 为7 5 的磷酸盐 缓冲液。 图3 8 为p d n p s c s g r 葡萄糖传感器于0 7v 工作电位下，在1 0m m 磷酸缓冲液 ( p h7 5 ) 中对连续滴加0 0 8m m 葡萄糖的计时电流响应图。由图可知，响应信号 稳定、重复、快速( 2 秒内) ，线性范围为0 0 0 1 1m m ，检测下限为0 1 “m ( 3 s n ) ， 灵敏度为3 1 2p a ( r a m c m 2 ) 。 摹 、 窘 占 u 矗 。 占 量 。 笛 呈 ： 目 兰 s 1 1 0 1 o - 1 硕 学位论文 456 7 8 9 p l ：i 图3 7p h 值对葡萄糖传感器电化学响应的影响 o 1 2 0 0 t i m e ，s ( a ) 2 7 4 0 05 0 0 加 基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的研究 耋 ： 暑 芒 s g l u c o s e ，m m ( b ) g l u c o s e lm m ( c ) 图3 8 葡萄糖传感器在p b s 溶液中，o 7v 下，对连续加入o 0 8m m 葡萄糖计时电流响应图 ( a ) ，葡萄糖传感器的工作曲线( b ) ，葡萄糖传感器工作曲线的线性部分( c ) 考察了常见的干扰物对该葡萄糖传感器的影响。在o 7v 的电势下，往含0 5 m m 葡萄糖的1 0 m m p b s 中加入0 1 r n m 甘氨酸对该传感器的响应没有影响。而当加 2 8 硕十学位论文 入0 1 m m 尿酸或抗坏血酸时，传感器的电流输出信号有明显增大，但是二者的干 扰可以通过改变葡萄糖传感器的工作电位到加1 v 而消除。 考察葡萄糖传感器的稳定性和重现性。连续1 0 次对o 0 5m m 葡萄糖进行检测， 相对标准偏差为4 1 ，表明传感器重复性好，具有实际应用价值；使用4 根电极 对0 0 5m m 葡萄糖进行检测考察传感器的重现性，相对标准偏差为7 6 ，表明该 电极的重现性很好。传感器不用时保存在4 c 的冰箱中。在o 7v 下，定期检测传 感器对0 0 5m m 葡萄糖的响应，实验数据表明，前两周响应信号基本不变，一个 月内，响应信号没有显著的变化。响应的降低可能是g o x 的轻微流失。良好的稳 定性表明通过共价交联上的葡萄糖氧化酶能够很稳定地固定在电极表面，不易流 失或泄漏。 3 4 小结 本章中，用化学方法合成了钯纳米粒子石墨烯壳聚糖复合物。钯纳米颗粒能 很好地电催化过氧化氢的氧化还原，石墨烯本身良好的导电性起到了快速传到电 子和协同电催化过氧化氢氧化还原的作用。共价修饰在石墨烯上的壳聚糖具有很 优良的成膜性能，使该复合物能很方便地修饰在电极表面，并且壳聚糖本身含有 的- n h 2 能与戊二醛交联，为酶的固定提供了位点。钯纳米粒子石墨烯壳聚糖复 合物修饰电极与氧化酶结合可构建相应的电化学生物传感器，本文中选用葡萄糖 氧化酶制备了葡萄糖传感器。该传感器具有对葡萄糖响应迅速、检测限较低、灵 敏度高、重现性好等优点。该修饰方法对设计其他基于氧化酶的电化学传感器提 供了一种思路。 基于低维纳米碳材料的电化学生物传感器的研究 第4 章基于d n a 修饰碳纳米管作为电化学标记物 j 磁分离d n a 分析 4 1 前言 自1 9 5 3 年w a t s o n 和c l a r k 发现生物遗传分子脱氧核糖核酸( d n a ) 的双螺旋结 构，建立生物遗传基因的分子机理以来，有关d n a 分子的识别、测序一直为人们 所关注。随着结构基因组与功能基因组研究不断深入，特别是人类基因组计划的 完成，大大推动了对基因的研究。基因的分离及分析在卫生防疫、医学诊断、药 物筛选以及毒理研究等环境科学领域发挥着越来越重要的作用。众多的新兴生物 技术，为发展高灵敏、高特异的实用型生物分析检测注入了活力。依据寡聚核苷 酸( d n a ) 双链的碱基互补配对原则发展起来了各种各样的基因序列分析检测技 术【1 0 9 小1 1 。传统的基因序列检测方法是利用放射性元素来标记探针【1 1 2 , 1 1 3 】，然后进 行杂交检测。这种方法尽管灵敏度高，但是放射性元素对人体有害，价格昂贵， 并且对操作人员要求较高，因而限制了它的应用。此外，采用聚合酶链式反应 ( p c r ) 1 1 4 - 1 1 6 】可将微量样品反复扩增后进行测定。这种方法虽然十分灵敏，但需 要复杂的样品准备过程和较长的分析时间。因此迫切需要发展一些灵敏、简便、 快速的分析检测技术。电化学d n a 传感技术正是在这一思想指导下，近十年迅速发 展起来的一种较新的生物传感技术。依靠生物体内物质问特有的亲合力快速、直 接获取复杂体系组成信息，具有选择性好、种类多、测试费用低及适合联机化的 优点，根据d n a 互补的专一性和电信号的大小，可以测定样品中d n a 的序列和含 量。根据检测电化学信号指示杂交情况，检测特定序列d n a 的方法主要有直接检 测和间接检测两大类。直接检测是利用d n a 本身的氧化还原反应或电极表面形状 的改变所引发的电化学信号的变化来进行检测。这类方法尽管操作简单，但是灵 敏度较低。间接检测依赖于酶【1 1 7 , 1 1 8 】、杂交指示剂1 1 9 1 、纳米材料【1 2 0 ,