（分析化学专业论文）基于微流控芯片的小型流式细胞仪研究.pdf

浙江入学硕上学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文学名叶嗌乙签字吼硝年 学位论文版权使用授权书 月 弓日 f 本学位论文作者完全了解迸鎏盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名。叶战l p 飙晰乡月乡日日f 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 5 7 导师签名： 签字目 邮编： 电话： 月留 l 摘要 随着微流控芯片加工技术逐渐普及和微流控分析方法研究的不断深入，微型 全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，g t a s ) 已将分析实验室的部分 功能转移到便携化的分析设备中，为化学分析设备的微型化与集成化提供了基 础，最终可以实现分析实验室的“个性化 、“家用化”，使分析仪器从化学实验 室解放出来，进入千家万户。本研究组在2 0 0 5 年提出了应用于微流控芯片的正 交型激光诱导荧光检测光路新模式，具有光路结构简单，易于搭建的特点。该检 测模式曾被用于构建微流控芯片流式细胞分析装置，该实验中，在荧光微球前向 小角度( 6 0 ) 方向上检测前向光强度的变化，实现了芯片上荧光微球的计数功能； 利用芯片侧壁作为采集面，实现荧光微球荧光的同时采集。在上述工作基础上， 本文进一步进行了正交光路激光诱导荧光检测一芯片流式细胞分析仪的小型化研 究。该仪器具有仪器结构简单、体积小、试样消耗量少、价格低廉等优点。 第一章，对流式细胞仪原理和基于微流控芯片的流式细胞仪的发展进行了 综述。 第二章，基于芯片正交光路检测模式，搭建了一套小型的微流控芯片流式 细胞仪。以5 3 2n n l 小型半导体激光器作为激发光源，激光束被透镜聚焦于芯片 通道中央，采用光电二极管检测芯片通道内流动细胞的前向散射光信号，采用小 型光电倍增管检测荧光信号，整套仪器体积为1 9c m x l 5c m x 2 5e m ( 长度宽度 高度) ，具有结构简单、体积小、价格低廉等特点。荧光检测系统对四甲基罗 丹明异硫氰酸的检测限为4 4x1 0 8m o l l ，采用6 岬荧光微球作为模型样品考 察了仪器的分析性能，同时初步实现了细胞样品的分析。 关键词：微流控芯片，正交光路检测，流式细胞仪 a bs t r a c t i n2 0 0 5 ，as i m p l el a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o ns y s t e mb a s e do na l l o r h o g o n a lo p t i c a la r r a n g e m e n tf o rm i c r o f l u i d i cc h i p sw a sd e v e l o p e db yo u rg r o u p l a t e r , t h eo r t h o g o n a ll i fd e t e c t i o ns y s t e m sw e r ee m p l o y e di nm i c r o f l u i d i cf l o w c y t o m e t r y i nt h i sw o r k ，ac o m p a c tm i c r o f l u i d i cc h i p b a s e df l o wc y t o m e t e rh a sb e e n d e v e l o p e db a s e do nt h eo r t h o g o n a lo p t i c a la r r a n g e m e n t t h ep r e s e n ts y s t e mh a sm a n y a d v a n t a g e s ，i n c l u d i n gs i m p l es t r u c t u r e ，s m a l ls i z ea n dl o wc o s t i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h ec o n c e p to ft r a d i t i o n a lf l o wc y t o m e t r ya n dt h ed e v e l o p m e n t o fm i c r o f l u i d i cc h i pb a s e do nf l o wc y t o m e t e rw e r er e v i e w e d i nt h es e c o n dc h a p t e r , ac o m p a c tm i c r o f l u i d i cc h i p b a s e df l o wc y t o m e t e rh a sb e e n d e v e l o p e db a s e do nt h eo r t h o g o n a lo p t i c a la r r a n g e m e n t a5 3 2 n n ll a s e rd i o d ew a s u s e da st h el i g h ts o u r c e b o t hp h o t o d i o d ea n di n t e g r a t e dp h o t o m u l t i p l i e rt u b ew e r e u s e da sd e t e c t o r sf o rt h ef o r w a r ds c a t t e r e dl i g h ta n df l u o r e s c e n c e ，r e s p e c t i v e l y t h e s i z eo f t h ef l o wc y t o m e t e rw a s1 9c m x l 5c m x 2 5c m ( l x h x w ) t h ed e t e c t i o nl i m i to f t h es y s t e mf o rt e t r a m e t h y l r h o d a m i n ei s o t h i o c y a n a t e ( t r i t c ) w a s4 4 x 10 一m o l l t h ep e r f o r m a n c eo ft h es y s t e mw a sd e m o n s t r a t e di nt h ea n a l y s i so ff l u o r e s c e n tb e a d s ( 6p m ) a n dc e l ls a m p l e s t h ea d v a n t a g e so ft h ep r e s e n ts y s t e mi n c l u d e ds i m p l e s t r u c t u r e ，s m a l ls i z ea n dl o wc o s t k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ，on _ h o g o n a lo p t i c a la r r a n g e m e n t ，f l o wc y t o m e t e r 2 浙江大学硕士学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究 第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究 1 1 流式细胞仪的基本概念及工作原理 流式细胞仪的发展凝结了半个世纪以来科学家的心血和成果，是一项有多 年历史的【1 ，2 1 、发展迅速的生物医学分析技术【3 1 。1 9 3 4 年，m o l d a v a 提出了一个设 想：使悬浮的单个血红细胞通过一根玻璃毛细管，用光电仪记录通过的细胞数 量，他是世界上最早试图使细胞检测自动化的人。1 9 5 3 年，c r o s l a n d t a y l o r 根据 牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室，奠定了现代流式细胞术中的液流 技术基础。1 9 5 6 年，c o u l t e r 在多年科学研究的基础上，利用c o u l t e r 效应生产了 c o u l t e r 计数器。随后经k a m e n t s k y 、h o l m 、g o h d e 和d i t t r i c h 等的不断努力，完成 了计算机与仪器的物理连接及多参数数据的记录和分析，开创了细胞的免疫荧 光染色及检测技术，将流式细胞仪推向了临床方面。随着仪器和方法不断完善， 人们将更多的精力投向样品的制备，细胞染色方法和软件开发等方面，从而扩 大流式细胞仪的使用效果和应用范围。 1 1 1 流式细胞仪的概念与构造 流式细胞仪( f l o we y t o m e t r y ，f c m ) 是对高速直线流动的细胞或生物微粒 进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分 选技术，计算机对数据的采集和分析技术等，基本结构见图1 1 。它作为测量细 胞表面标记、形态特征、内部结构的精密仪器在实验室中得到了广泛的应用。 流式细胞仪是以流式细胞术为理论基础，综合了光学、流体动力学、电子学和 计算机控制技术的现代化医疗应用仪器【4 】。流式细胞术是一种自动分析和分选 细胞或亚细胞的技术。 双 6 6c h a 。，掣 p l a t e sm ”勰，! 、 b 二础9 0 岫h ts c a t e r t o w ar d 1 9 r a n u l a r i t y 圈l - 1 流式细胞仪基本结构 f 1 9 l - 1s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e o p t i c a ls e t u p o f t h ec o m m e r c i a l f l o wc y t o m e t e r t + 】 流式细胞仪主要有四部分构成：激光源和光学系统；流动室和液流系统； 检测系统；计算机和数据分析系统。其中流动室是仪器的核心部件。 ( 一) 光源和光学系统 激光是一种相干光源，能够提供高强度的照射光，稳定性强，发射角度小， 能聚焦到细胞尺度，是细胞快速分析的理想光源。流式细胞仪是以氩离子激光 器最为普遍，也有使用氪离子激光器或染料激光器的报道。经特异荧光染色的 细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测，因此，光源的选择主 要根据被激发物质的激发光谱而定。 光学系统包括各种透镜、滤光片、分光镜等，来自细胞的各种信号，如不 同角度的散射光、不同波长的荧光等通过这些光学系统分别被送到不同的检测 器。 激光光束经透镜聚焦到检测区，聚焦得到的激光光斑直径应和细胞直径相 浙江大学硕上学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究 近，这样可以使细胞得到均匀照射，并且能够提高分辨率。聚焦光斑直径可由 公式( 1 ) 确定： d = 4 x f r t d ( 1 ) 其中，d 为光斑直径；伪透镜焦距；d 为激光束直径；九为激光波长。 为了进一步提高荧光讯号的信噪比，在光路中使用了滤片，目前常用的滤 光片可以分为三种：截止滤光片，带阻滤光片和带通滤光片。带阻或带通滤片 是有选择性地使某一波长区段的光线滤除或通过，如b p5 0 0 5 0 表示其允许通 过波长范围为4 7 5n m 5 2 5n n l 。 ( 二) 液流系统和流动室 主要是由鞘液、细胞悬液和流动室组成。在气体压力的作用下，流动室内 充满的鞘液从喷嘴喷出形成鞘液流，细胞悬液在鞘液流的夹带下和气体压力的 作用下经导管输入流动室，正对流动室的喷嘴喷射。细胞悬液内的细胞在鞘液 流的约束下排列成单列，由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。 ( 三) 光电管和检测系统 荧光染色的细胞经特定波长的光激发所产生的荧光，可通过光电转换器转 变成电信号后进行测量，最常用光电转换器为光电倍增管( p m t ) 。p m t 的响 应时间短，仅为1 1 s 数量级；光谱响应特性好，在2 0 0 - - 9 0 0n n q 的光谱区，光量 子产率都比较高。光电倍增管的增益从1 0 3 到1 0 8 可连续调节，因此对弱光测量 十分有利。但是从p m t 输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析 仪器。流式细胞仪一般备有两类放大器： 1 线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系。适用范围：较小 范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如d n a 、r n a 测量等。 2 对数放大器，输出信号和输入信号之间成常成对数关系。适用范围：免 疫学，由于免疫分析时时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的 荧光强度相差1 2 个数量级，用对数放大器采集数据易于解释。 ( 四) 计算机和数据分析系统 5 浙大学碗l 掣论女 第一章微疏拄# 片漉武胞仪的”究 放大后的电信号被送往计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器进行处 理，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，计算机把所测量到的 各种信号进行处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可 以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 11 2 流式细胞仪的工作原理 经荧光染色的细胞悬液由气压装置送入流动室，流动室由鞘流管和样品管 组成，当鞘流液和样品流达到一定的压力时，鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序 地排列成单列，并以稳定的速度同方向经过5 1 0 0 岬的喷嘴，从而确保细胞 液流稳定，并且垂直通过激光聚焦区，图1 - 2 所示。 图1 0 流式细胞仪鞘流图 f i g l - 2p r i n c i p l eo f t h e f l o we y t o m c t r yo f s h e a t h f l o w 荧光标记的细胞经过激光聚焦区后，产生的信号以细胞为中心，向空间3 6 0 0 立体角发射( 见圉1 3 ) ，这些信号主要为以下几种： 细胞前向散射光信号( f o r w a r ds c a t t e r e dl i g h t ，f s ) 、9 0 0 散射光信号( s i d e s c a t t e a x ! dl i g h t ，s s ) 和荧光信号( f l u o r e s c e n c el i g h t ) 。 新i l ： 学“r 士学位论文第一章徽漉控z 片l 流式目胞倥的目f 究 2 黑= | ：嚣微帮”“” “”訾。ht b c i d e n t _ 种 雹 黜黼然。：椭。 e r o d e c “h d ， t 、：岫。；。甜。，“ l l g h l i o i i c e , s i z ev 汕l m 图i - 3 细胞信号图 f 1 9 1 3 m e a s u r e m e n t p r i n c i p l eo f f l o wo y t o m , t 一5 1 细胞的散射光信号是由细胞的反射、折射和衍射组成的，取决于细胞的大 小、形状和密度等。前向角散射又被称为小角度散射光信号，角度为05 w ， 与被测细胞直径的平方密切相关，对于同一种细胞群体，前向散射光强，则说 明细胞体积比较大，前向散射光弱，则表示细胞体积较小。细胞大角度散射光 ( l a r g e 跖茸es c a t t e r e dl i g h t ，l s ) 信号，角度为1 5 。- 1 5 0 6 ，所包含的信息较多， 主要包括细胞表面和内部的精细结构以及细胞大小的信息。9 0 。角散射光对细胞 膜、细胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的 信息。细胞前向消光度信号是指当光束通过细胞后，在前向方向的能量降低， 与细胞的本身吸光性质和散射有关。细胞的前向消光度信号可以反映细胞的体 积、活性、胞质内物质含量( 如蛋白质含量) 等信息。 细胞的荧光信号分析是流式细胞术中一个重要的组成部分，荧光强度和细 胞内各种组分如d n a 、r n a 和蛋白质等的含量成正比，通过测定荧光强度就 可以知道细胞内各组分的含量。荧光信号有两种一种是细胞本身的荧光信号， 即在激光照射下发出微弱的荧光信号；第二种是经荧光物质标记后的细胞在激 光照射下发出特异性的荧光信号，即选择不同的荧光染料试剂与细胞膜表面抗 原、受体或膜蛋白特异性结合，或穿透细胞膜与胞质内物质结合，在一定波长 浙江大学硕士学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究 的激光照射细胞后，这些与抗原、蛋白或其它物质结合的染料就会发出荧光信 号。利用这些荧光信号可以对标记的特异性物质进行定性和定量分析，从而实 现对细胞亚群功能的测定。 以上产生的散射信号和荧光信号可以通过一些滤光片分辨开。散射光是从 细胞表面或者细胞内颗粒散射出来的原激发光谱，其信号较强，用光电二极管 即可检测，但是荧光信号较弱，必须用光电倍增管( p m t ) 才可检测。 流式细胞仪的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。喷嘴射出的液 流柱在流动室的压电晶体发出几十k n z 的电信号作用下发生振动，断裂形成均 匀的液滴，待测定细胞分散在这些液滴之中，一般液滴间距约数百 a m 。 振荡信号频率由实验公式( 2 ) 确定： f = v 4 5 d ( 2 ) 其中v 是液流速度，d 为喷孔直径。 根据选定的某个参数由逻辑电路判明细胞是否将被分选，而后由充电电路 对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器 中，充电电压一般选+ 1 5 0v 或1 5 0v ，偏转板间的电位差为数千伏。使用不同 孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再 到脉冲充电需要一段延迟时间，精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可 根据具体要求进行适当调整。图1 - 4 为传统流式细胞仪的细胞分选过程。 尊， 酗1 4 传统流式细胞仪分选过利 f j g l 4s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f t h e o p e r a t i n g p r o c e s so f a t r a d i t i o n a l f l o wc y t o m e t e r 1 13 流式细胞仪的应用 流式细胞术相对于其它细胞分析技术，具有以f j l 个优点： i ) 高分析速度，每秒可检测分析5 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 个细胞。 2 ) 高分选速度，精度可达9 9 以上。 3 ) 高荧光灵敏度，能够区分仅有5 差别的两个细胞。 4 ) 多参数检测。 因此，基于流式细胞术的流式细胞仪在细胞生物学，免疫学，肿瘤学等方 面有着极其广泛的应用。 l 13ld n a ，r n a 和细胞周期的分析 随着流式细胞仪在临床肿瘤病中的应用，测定细胞d n a 含量的异常增加， 对于肿瘤的诊断具有结论性的意义。肿瘤细胞有其特定的细胞周期，利用流式 浙江大学硕士学位论文 第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究 细胞仪测定细胞周期内各个时期的动力学参数，借以揭示肿瘤细胞的生物学特 点，作为指导肿瘤治疗、病症发展过程、预后等的参数。 人体正常的体细胞应该有比较稳定的d n a 二倍体含量，但细胞发生癌变 的过程中，细胞的d n a 含量会发生异常改变，出现非整倍体。流式细胞仪能 够测出d n a 含量的改变，然后将细胞群体的各个荧光强度绘制成图，从而显 示细胞的相对d n a 含量。 测量r n a 的含量可用于血液中的网织红细胞的检测和计数。网织红细胞是 从骨髓最新释放到外周血的成熟红细胞的前体，它的数目是反映红细胞造血功 能的重要指标。 1 1 3 2 淋巴细胞亚群分析 淋巴细胞具有表面特异性抗原差异，这些不同抗原表现型的亚群执行不同 的机能，当亚群之间的比例失调时，人体已经受到疾病的侵害。 在流式细胞仪上结合免疫荧光方法，可以辨别和计数带有不同表面特异性 抗原的淋巴细胞，对于机体的细胞免疫状况提供了依据。 通过检查血液中c d 4 的含量，可以检测艾滋病。艾滋病是一种由人类t 淋 巴细胞病毒( h l l v i ) 感染而造成的疾病，该病毒主要侵袭c d 4 + t 淋巴细胞， 在临床上表现为，外周血中c d 4 细胞减少，并且c d 4 在淋巴细胞中所占的比 例下降。 1 1 3 3 细胞受体的分析 受体研究是当代医学研究的热点，因为许多生物的活性物质需要通过细胞 受体起作用。通过对细胞表面受体( 如转铁蛋白受体、低密度脂类受体、淋巴 因子受体等) 进行定性定量分析，有助于对许多疾病进行确诊，如肿瘤、冠心 病、内分泌疾病等。 1 1 3 4 其它方面应用 流式细胞仪的其它应用还包括：诊断和治疗白血病；研究和诊断获得性或 1 0 浙江人学硕士学位论文第一章微流控芯片上流式细胞仪的研究 先天性缺陷病；血液中大肠杆菌等。 1 2 微流控芯片流式细胞分析系统的研究进展 传统的流式细胞仪虽已实现商品化，但仍存在仪器体积大、结构复杂、造 价高等局限性，所以对流式细胞仪改进已迫在眉睫。微流控芯片所具有的特点， 使其最有可能应用到流式细胞分析，从而降低成本和体积。具体包括： 微流控芯片上1 0 2 0 0 岬级的通道结构与生物细胞尺度上相容。 微流控芯片网络式二维或三维通道结构较易实现单个细胞进样与控制。 微流控芯片微通道中利用流体动力、气压、重力、电压等多种手段，可 以简化单细胞计数、筛选、胞内分析等过程。 微流控芯片微加工技术，可以将多个部件和功能集成到同一个芯片上， 较易制成功能齐全的便携式仪器。 因此，微流控芯片用于流式细胞分析是近年来该技术发展的热点之一，自 s o b e k 等【7 】首次建立微流控流式细胞仪以来，国内外研究者不断将光散射法，荧 光标记法，阻抗变化等方法应用到芯片流式细胞分析中。 1 2 1 基于微流控芯片的流式计数方法 1 2 1 1 库尔特技术 库尔特( c o u l t e r ) 技术通过测量电阻变化进行微粒计数，当细胞通过小孔 引起电阻的变化时，电路电流中将会产生一个脉冲，脉冲越大，表示通过的细 胞体积越大，就可以对细胞进行计数和分选。 1 9 9 7 年，l a r s e n 等【8 】研制出了一套基于微流控芯片的库尔特粒子计数器。 如图1 5 所示，该装置中有5 股溶液，最中间为样品液，靠近样品液的2 股液 体为电解液，可以起到鞘流作用；最外层的2 股液体为非电解液，具有动态调 节鞘流有效宽度的能力。样品液中的微粒在2 股电解液的作用下逐个通过中间 狭小的区域，从而引起出口处电阻的变化。 l ：n o nc o n d u 曲ei k l u l d 2 ：t k d r o i 健 3 ：i , m n l o t e 图1 - 5 微流控芯片库尔特计数器 f i g1 5m i c r oc o u l t e r c o u n t e r i 2 0 0 1 年，g a w a d 等n 1 在库尔特计数技术基础上，利用正弦交流阻抗方法， 发展了一个微流控芯片细胞计数装置。检测细胞频率达1 0 0e e l l s s ，能区分微粒 的体积。图1 - 6 是模拟微流控芯片通道中细胞流动造成电阻变化，a ，b ，c 为 三个电极，b c 之间的电阻与a c 之间的电阻差值，即为细胞的电阻。该仪器还 处于初步测试阶段，还有许多部分需要进一步完善。 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 图1 币微流控芯片细胞计数器 r 9 1 - 6s i m u l a t e dc o m p l e x i m p e d a n c es p e c t r u m o f t h ec d l 浙江人学颐i 学位论文第一章微流拄# hr 流式细胞仪的研究 2 0 0 5 年，k i m 等将阻抗变化的检测进一步应用到细胞计数。如图1 7 所 示，微流控芯片通道内集成了聚合电解质盐桥电极，可以检测流经细胞的电阻 变化，从而完成细胞计数，且能辨别细胞的体积。 图1 - 7 基于聚合电解质盐桥的流式细胞分析系统 “8 1 7 。“9 。4 ”蜘“。：兰：；：”。“。”咖“”1 ”“8 8 。“”8e l e c o d e ”一 1 21 2 检测细胞光散射和荧光技术 利用光散射法和荧光标记法检测微粒或细胞，是流式细胞计数最常用的技 术。将荧光染色的细胞排成单列通过微通道，用激光照射通过的单细胞，将发 出的瞬间散射光和荧光转换成电信号，最后用计算机进行处理，进行细胞的计 数和分选。 1 9 9 9 年，r a m s e y 等1 报道了一种基于简单微流控十字通道芯片的流式细 胞分析系统。如图1 8 所示，系统中使用4 8 8n m 的氲离子激光器，以电渗流方 法对细胞或荧光微球进行鞘流驱动，当细胞或荧光微球通过检测区时，发出的 散射光和荧光，都由同一个目镜接收，再使用二向色镜将散射光和荧光分开， 分别由不同的光电倍增管检测。如图1 - 9 所示。m c c l 撕n 等”1 在微流控蕊片通 道内覆盖一层聚- r p 基硅氧烷( p d m s ) ，防止细胞贴壁，如图l 一1 0 所示，在电 渗流作用下，对细胞进行散射光和荧光检测。 撕 学明l 学论空第一# 微“。拧bj jf ：m 式胞住的研究 图1 - 9 简单十字芯片的鞘流圈 f i 9 1 - 9 t i m e - i n t e g r a t e d c c d i m a g e o f e t e c t r o k i n e t i c a l l y 自d 】8 8u m l a b e l e dp a r t i c l e so n m i c r o c h l p 】 图1 1 0 用于细胞计数的微流控芯片 f i 9 1 1 0 i m a g e o f t h e f o c u s i n gc h b e r o f t h e m i c m c h i p u s e d f o r t h cc y t o m e t f y e x p e r i m e n t s g r o o t h 等 i ”研制了一套检测细胞内d n a 片段的流式细胞分析仪( 图1 - 1 1 ) 。 实验中分别使用绿光激发的t o t o 一1 和红光激发的c y s 染细胞，在各自的激光 激发下，细胞发出的荧光由不同的雪崩二极管接收。由t o t o i 染色的细胞得 到的荧光信号强度，可以反映出整个细胞d n a 的长度；c y 5 染色的细胞荧光信 号能够反映特殊d n a 的长度。仪器的灵敏度可达到单分子水平，对单个c y 5 分子的信噪比s f n 为17 。 图l - 1 1 检测d n a 片段的流式细胞仪 f i 9 1 一i i o p o c a is c h e m e o f t h e f l o wc o m e “1 ” 浙人学硎t 学位论文第章馓控o l ：“l 式女n 胞仪的q 宄 m a l l z 等【“i 对基于微流控芯片的多角度散射光进行了研究。该仪器在1 5 。和 4 5 。两个方向上检测散射光，利用这两个散射光的信号，可以进行微粒的计数和 体积大小的分辨。如图1 1 2 所示，微粒在真空泵和夹流液的作用下，逛个通过 激光斑点处，发出散射光信号，并使用光电倍增管在1 5 。和4 5 。方向检测散射光， 用于进一步的分析。该研究组不仅将该仪器应用到荧光微球的计数和体积大小 的分析，而且还应用于c 反应蛋白含量的分析，用于急性炎症、组织损伤、心肌 梗塞、心脏病等疾病的研究。 图1 - 1 2 ( a ) 仪器结构图( b ) 仪器实际照片 f i g l - 1 2 ( a ) s c h e m a t i co f t h ee x p e r i m e n t a ls e t u p o ) p h o t o g r a p ho f t h es e t u p 1 4 l l i n 等【i ”提出了一套集成化的流式细胞计数装置，在芯片通道处植入光纤接 收细胞散射信号。图1 - 1 3 所示，计算机控制的注射泵调整鞘流流速，使得细胞通 过激光聚焦点，由雪崩二极管接收散射光信号，最后可以测定不同细胞的体积。 2 0 0 5 年该研究组”报道了基于微流控技术的流式细胞仪，该仪器集细胞计数 和分选功能于一体，如图1 - 1 4 所示。在芯片上实现了细胞两层鞘流结构，增强了 细胞计数能力。细胞通过各自鞘流区的检测点时，由高分辨率的c c d 摄像机采 浙大学顺1 学位论文 第帝融流挡芯片j ：洫武日仪w 究 集信号。陔研究组进行了细胞训数，井计算了细胞在各自鞘流通道中的速度。 见外，在芯片下游通道内安胃了i 乜极，利用电撒产。e 的负介电电泳作用，对血 细胞进行分选。 幽1 13 微流控芯片流式细胞计数装置 f i 9 1 - 1 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ee x p e r i m e n t a ls e l u p f o r t h e m i e r o c h i p f l o w e y t o m e t e r r j 粪 。i 压渴i 妒声等= 忑三引 ；! = ! ! yi 巨# j； l 巨訇叵j 习 l 一二苫二 酗1 1 4 流式细胞仪两层鞘流结构图 f i 9 1 1 4s c h e m a t i c i l l u s t m l i o no f t h e w o r k i n g p f i n c i p l e 卸de x p e d m e n t a ls e t u p f o ra t w o c h a p e lf l o wc y t o m e t e r 浙 学碰i 岸位论文第一章徽拉g ”l ：流式自胞仪的研究 2 0 0 7 年，t a k a y a m a $ 7 1 成功地研制出了高效且不损害细胞的流式细胞分析 仪，可对较少量珍贵细胞进行分析。如图1 1 5 所示，泵位于计算机控制的盲文显 示器处，能够精确调整液体流速。采用p d m s 芯片，并在微通道处增加扩散装置， 以减小泵产生的影响。样品液池为夹角为6 0 。的圆锥形结构，位于泵的前面，可 以减小使用过程中对细胞的机械损害。采用荧光微球检测仪器的分析性能，分 析了经d n a 探针染色的h l 6 0 细胞周期，并进行了细胞计数，速度为3 0 0e e 埘m i n 。 圉1 - 1 5 p d m s 芯片二维通道结构 f i 9 1 1 5 t w o 一一仃ca一协ocoo田m二o：一k 浙江大学硕十学位论文第二章小型微流控芯片流式细胞仪的研究 的1 0 0 0 1 0 0 0 0c e l l s s 的分析速度相差较大，下一步可以通过采用更高性能的光 电倍增管和数据采集卡，来提高仪器的分析速度。 2 3 3 仪器的检测性能 分析仪搭建之后，首先采用t r i t c ( 荧光激发波长为5 5 0n l t l ，发射波长为 5 7 0n m ) 溶液为样品，以门式进样方法考察了系统的检测性能。如图2 1 3 所示， 在2 x 1 0 7 - 1 x 1 0 击m o l l 浓度范围内，荧光信号强度与t r i t c 浓度之间具有良好 的线性关系，线性回归方程为f = 7 4 1 1 0 4 c 一5 3 x 1 0 3 ，线性相关系数r - = 0 9 9 7 。 对t r i t c 的检出限( 3 0 ) 为4 4 5 x 1 0 一m o l l 。相对文献报道的高灵敏激光诱导 荧光检测系统，本系统的检测灵敏度偏低，主要原因是小型的半导体激光器功 率不稳定，造成本底噪声较高。同时，集成化的小型光电倍增管的检测性能指 标也低于常规的光电倍增管。 0 0 8 o 0 7 o 0 6 0 0 5 0 0 4 o 0 3 0 0 2 o 0 1 o 02 e - 0 74 e - 0 76 e - 0 78 e 一0 71 e - 0 61 2 e 一0 6 c m 图2 1 3 荧光信号与浓度的关系图 f i g 2 - 1 3c a l i b r a t i o nc u r v eo f t r _ i t cr e s p o n s ev e r s u sc o n c e n t r a t i o n 2 3 4 细胞检测 p i ( 碘化毗啶) 是一类嵌入式染料，不能通过活细胞膜，但是可以穿过破 4 7 浙江大学碗学位论女 第= 章小型微流控芯片漉式细胞仪的目究 损的细胞膜对核染色，释放红色荧光，图2 1 4 为标记好的细胞荧光图，使用 p i 染细胞，方法简单，操作方便。但是，经固定液固定后的细胞为死细胞，极 易吸附到芯片壁上，严重阻碍了细胞的运动，使细胞出现速度缓慢，停流甚至 改变流向的现象。困此寻找一种能降低芯片表面对细胞吸附的添加剂足非常必 要的，并且可以避免对芯片通道进行物理或化学涂层处理的繁琐过程【”i 。 。 i 图2 一1 4 仓鼠卵巢细胞荧光图 f i 9 2 - 1 4 t i m e - i n t e g r a t e d c c d l m w o f c h o 2 341 添加剂的选择 羟丙基甲基纤维素( h p m c ) 是一种非离子型表面活性剂，具有良好的分 散、增稠、乳化、保持水分及成膜等多种特性，可以在通道内形成动态涂层 使微粒均匀地悬浮于微通道中，减少其与通道底部的接触和吸附。h p m c 分子 结构式如2 1 5 所示式中n 为聚合度，r 为 i ，一c h h - ( c h ：c h ( c h ，) o 埔等。杨 蕊等1 2 0 1 利用h p m c 的非离子型表面话性，将微球包在其中，其疏水端向内，亲 水端向外，使微球与缓冲体系形成一个有机的整体而共同运动，在很大程度上 避免了微球教基与玻璃管壁上羟基之间的吸附，使微球在液流中稳定而快速地 运动。姚波等口”在细胞溶液中加入质量浓度为02 的f i p m c 溶液，降低芯片 通道中的渗透压，同时由于h p m c 溶液对细胞的分散作用，减少细胞在通道口 和通道内的沉积。本实验通过不断优化h p m c 溶液的浓度，选择最佳浓度为 浙江大学硕十学位论文第二章小型微流控芯片流式细胞仪的研究 o 4 h p m c 的细胞溶液。 图2 1 5h p m c 的分子结构式 f i g 2 - 15t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao fh y d r o x y p r o p y l m e t h y l c e t l u l o s e 2 3 4 1 染色细胞的检测 由于h p m c 溶液的加入，溶液的粘性增大，荧光微球条件下的最佳液位差 不适用于细胞，实验中不断改变储液池的液位差，最终选择在b 储液池中加入 3 0 0 皿含有o 4 的h p m c 的细胞溶液，a ，c 储液池中分别加入1 0 0p l 的p b s ， t y g o n 管底部的注射器抽取不超过0 0 2 m l ，所得的结果如图2 1 6 所示。图中可 以看到散射光的倒峰信号和荧光的正峰信号有较好的对应度，说明仪器对于细 胞的测定较为准确，可以初步实现细胞的检测。 4 9 浙江大学硕士学位论文第一二章小型微流控芯片流式细胞仪的研究 图2 1 6 细胞前向散射信号和荧光信号结果记录图 f i g 2 1 6r e c o r d i n g so f i n t e n s i t i e so ff o r w a r ds c a t t e r e dl i g h ta n df l u o r e s c e n c ev s t i m e 2 4 结论 本文报道了一种小型微流控芯片流式细胞仪，具有结构简单，操作方便， 体积小，价格低廉等特点，并初步应用于细胞分析。显示该仪器在细胞学和临 床诊断领域中具有广阔的应用前景。其体积小，成本低的特点，尤其适合应用 于床旁分析( p o i mo f c a r et e s t i n g ，p o c t ) 和小型医院，对于流式细胞术在社 区和广大农村医院的普及，具有重要意义。 现在我们已经初步完成对细胞的检测，这是远远不够的，我们需要进一步 改进仪器，为以后投身于社区和广大农村医院事业做准备。 今后，对上述系统的改进和应用拓展可由以下三个方面入手： 一芯片通道构型 实验中，采用两股缓冲液实现细胞的鞘流结构，并在激光聚焦点检测细胞 惦：5；：；巧加侮竹 套|scm芒=mc西is f、，、套价cm芒=c西is 浙江大学硕士学位论文第二章小型微流控芯片流式细胞仪的研究 各项性能，对于同样大小的荧光微球，理论上，散射光信号大小应相同，但是 在实验中却存在差异，综合考虑各方面因素，可以改变芯片分离通道中检测区 域处的通道结构，采用三维夹流模式，使细胞在水平和竖直方向上都不偏离激 光聚焦点。使用该方法，就可以根据细胞散射光信号的强弱，来判定细胞体积 的大小。 二细胞染色方法 选择与该仪器相符的染料，采用直接或间接免疫染色法染色活细胞，扩大 细胞分析范围。 直接免疫法，细胞上的抗原与荧光标记的单克隆抗体直接反应，或者是先 将在抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗 体定位检测出来。该方法误差小，操作简单，但是费用较高。 间接免疫法，先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特 异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光 抗体之间，故称夹心法。使用这种方法，费用相对较低，但是过程相对比较复 杂。 三仪器应用方面 ， 通过单克隆抗体方法识别特殊抗原，使用该仪器计数带有不同表面特异性 抗原的细胞，并可利用荧光信号鉴别免疫活性的或非活性的淋巴细胞，为免疫 学研究提供依据。 利用该仪器测定细胞周期和d n a 含量。随着细胞不典型增生程度的增加， 细胞中d n a 异倍体出现的可能性增加，这是癌变的一个重要标志。通过该仪 器检测细胞在各个时期内的动力学参数，从而得到每个周期内细胞的相对d n a 含量，对早期诊断癌症是有很重要的作用的。 对网织红细胞的r n a 进行荧光染色，利用荧光检测进行网织红细胞计数， 前向散射光进行血液中细胞的计数，从而测定血液中网织红细胞的含量。 浙江大学硕士学位论文 第二章小型微流控芯片流式细胞仪的研究 参考文献 1 j a r o s z e s k imj ，r a d c l i f fgm o lb i o t e c h n 0 1 1 9 9 9 ，11 ：3 7 5 3 2 】k e a t i n gp c a m b r o s i oa jh i s tb i 0 1 1 9 9 4 ，2 7 ：4 4 9 4 7 9 3 m a n za ，h a r r i s o ndj ，v e r p o o r t eemj ，f e t t i n g e rj c j c h r o m a t o g r 19 9 2 ，5 9 3 ： 2 5 3 2 6 0 4 】h a r r i s o ndj ，f l u r ik ，s e i l e rk ，f a nz ，e f f e n h a u s e rcs ，m a n za s c i e n c e 19 9 3 ， 2 6 1 ：8 9 5 - 9 0 3 5 】m a n za ，b e c k e rh m i c r o s y s t e mt e c h n o l o g yi nc h e m i s t r ya n dl i f es c i e n c e s n e w y o r k ：s p r i n g e r - v e r l a g ，19 9 9 6 】s o b e kd ，s e n t u r i as ，g r a ym s o l i d - s t a t es e n s o ra n da c t u a t o rw o r k s h o p ，h i l t o n h e a d ，sc 1 9 9 4 ，1 2 0 1 2 1 7 】w o o l l e yat ，m a t h i e sra a n a l c h e m 1 9 9 5 ，6 7 ：3 6 7 6 - - 3 6 8 0 8 】h a a bbb ，m a t h i e sra a n a l c h e m 1 9 9 9 ，7 1 ：5 1 3 7 - - , 5 1 4 8 9 】l i a n gzh ，c h i m en ，o c v i r kgt a n gt ，f l u r ik ，h a r r i s o ndj a n a l c h e m 1 9 9 9 ， 6 8 ：10 4 0 10 4 6 【10 】c h a b i n y cml ，c h i udt ，m c d o n a l d jc ，s t r o o c kad ，c