（生理学专业论文）利用原始卵泡体外重构模型对小鼠原始卵泡形成机制的研究.pdf

摘要 原始卵泡的形成涉及复杂的生殖细胞一体细胞互作，本实验利用原始卵泡重构模耻，研究了 决定小鼠原始卵泡形成的重要因素及其作用的调控机制，结果表明： 经酶解离的小鼠胚胎卵巢细胞经体外培养可以重构形成原始卵泡。通过组织学及基因表达的 分析，可咀确定体外重构形成的原始卵泡具有典型的原始卵泡结构。正常的原始卵泡相关基因 ( z p j 3 ，f i g a ，c x 4 3 ) 的表达以及n ：常的原始卵泡发育能力，原始卵泡启动发育所必须的调控 因子g d 炒，b m p l 5 和f s h r 基冈的表达都可以在体外培养的重构卵泡中检测到。 从1 3 5d p c 起，胎鼠卵巢细胞开始具有体外重构形成原始卵泡的能力。1 2 5d p c 胎鼠卵巢的 生殖细胞可以在体外培养中发育为卵母细胞，但不能与此时的卵巢体细胞互作形成原始卵泡。通 过对比原始卵泡相关基因在体外培养的1 3 5d p c 和1 2 5d p c 胎鼠卵巢细胞中的差异表达，得出印 基因的正常表达决定卵母细胞在发育早期的分化，f i g a 基因的持续表达是决定原始卵泡能够在体 外重构的必须因素。 利用上述胎鼠生殖细胞与体细胞之间细胞联系的分离和重构模型，我们随后研究了在体外重 构形成转基因卵泡的可能性。转基因技术是研究基因功能的强有力的手段。然而对于卵母细胞而 言，细胞分裂的特殊性和卵泡结构决定了到目前为止仍不能够将外源基因导入发育中的卵母细 胞。本实验中，我们研究了将外源基因导入胎鼠卵巢生殖细胞的方法及可行性。选择从1 1 5d p c 到1 5 5d p c ，处于不同细胞分裂状态的胎鼠卵巢生殖细胞用于转染实验。研究发现，通常的传染 方法：磷酸钙法和脂质体法均可以用于胎鼠卵巢生殖细胞的转染。脂质体法拥有较高的转染效率 并且对细胞没有明显的伤害，但是在适当的转染液孵育时间内( 3h ) ，虽然磷酸钙方法的转染效 率较低，但其对细胞后续的发育能力保护更好一些。从1 3 5d p c 起，当胎鼠卵巢生殖细胞开始进 入减数分裂时，全部的胎鼠卵巢生殖细胞便失去整合外源基因的能力。在1 5 ，5d p c 之前，尤其是 在1 1 5 1 3 5d p c ，外源基因在腑鼠卵巢生殖细胞中可表达，为在卵子发生早期阶段进行基因功 能的研究提供了新的实验手段。 基于原始卵泡体外重构模型和卵原细胞转基因方法，我们进一步研究了在体外原始卵泡形成 的过程中，生殖细胞与体细胞互作的机制。利用一系列的胎鼠卵巢细胞共培养，以及“互换、互 作卵泡重构”实验。我们发现，原始卵泡形成的过程要求高度同步发育的生殖细胞一体细胞互作。 同样具备卵泡重构能力的、不同胎龄的胎鼠卵巢生殖细胞和体细胞在体外互换、互作之后，正常 的原始卵泡形成过程不能完成。在培养过程中，生殖细胞f i g a 基因的表达逐渐缺失，原始卵泡 形成过程不能正常地进行，伴随着b o x 基因的异常表达，生殖细胞将发生退化死亡。 原始卵泡形成时生殖细胞将发生大量的凋亡而体细胞则处于细胞分裂的抑制状态。因此，基 于上述胎鼠卵巢中细胞数量控制的现象可能对原始卵泡库建立时卵泡的数量起调控作用的猜测， 在本实验中，利用原始卵泡重构模型，我们研究了生殖细胞与体细胞的数量对重构形成原始卵泡 数量的作用。结果发现，增加生殖细胞或体细胞的数量，并不会促进重构原始卵泡数量的增加， 相反会导致体细胞出现异常增殖生长，生殖细胞不能最终分化为健康的卵母细胞，进而最终导致 正常的原始卵泡形成过程不能发生。由此可见，原始卵泡的形成过程存在精确控制的生殖细胞一 体细胞数量的平衡，该平衡的破坏可导致原始卵泡形成的失败。 由于前人和我们现有的研究发现f i g a 基因是形成原始卵泡的必须因素，于是通过原位杂交 技术及t u n e l 凋亡检测，我们研究了f i g a 基因在1d p p 小鼠卵巢中的表达及其与原始卵泡形成时 生殖细胞的选择和生殖细胞凋亡的关系。研究发现，f i g a 基因在1d p p 小鼠卵巢中的表达存在生 殖细胞问的差异，即同时存在f i g a 基因表达的阳性和阴性生殖细胞，这种f i g a 基因在生殖细胞 间的差异表达在原始卵泡形成前的1 7 5d p c 胎鼠卵巢中即可以检测到。f i g a 基因在1d p p 小鼠卵 巢生殖细胞间的差异表达可能与原始卵泡形成时卵母细胞的选择有关。同时，由于凋亡的生殖细 胞中也可以检测f i g a 基因的表达，因此f i g a 基因在1d p p 小鼠卵巢中的差异表达可能并不决定 此时卵巢中的生殖细胞凋亡。 中肾组织对胚胎卵巢分化和发育的作用目前尚未明确，而挖5d p c 是胎鼠卵巢分化的关键时 期。因此在本实验中我们研究了1 2 5 d p c 的中肾组织对此时的胎鼠卵巢细胞体外分化发育的影响。 结果发现，中肾细胞并不能促进1 2 5d p c 胎鼠卵巢细胞在体外培养中获得体外重构形成原始卵泡 的能力。在无血清组织培养体系下，1 2 5d p c 胎鼠卵巢自身可进行卵巢细胞的分化并形成原始卵 泡。而在该培养条件下，中肾组织的存在会导致卵巢细胞的正常分化受到抑制，这主要表现为体 细胞未能完成前颗粒细胞的分化，卵母细胞未能形成原始卵泡并完成最终分化。即在1 2 5d p c 胚 胎小鼠中，中肾组织对卵巢的分化具有作用，其作用的方向可能依赖于某些未知的因子和激素的 存在。 连接蛋白被认为对卵泡发育过程中的细胞间互作和信号传递具有重要的意义。在本实验中， 利用免疫组织化学技术，我们系统的研究了在小鼠胚胎卵巢发育过程中连接蛋白2 6 ( c x 2 6 ) 的 表达情况。研究发现，c x 2 6 在胚胎卵巢发育的早期即可检测到，并且在生殖细胞之间存在差异 表达。在大量卵泡形成启动前( 1 8 5d p c ) c x 2 6 在生殖细胞之间的差异表达可能与原始卵泡形成 的启动机制有关。而在原始卵泡形成时( 1d p p ) ，c x 2 6 在原始卵泡中生殖细胞的差异表达提示其 可能并不参与原始卵泡形成时生殖细胞的选择。c x 2 6 在原始卵泡库建立后直到性成熟卵巢中仅 表达于卵母细胞和卵泡膜细胞的现象提示c x 2 6 可能参与原始卵泡库的最终建立。 综上所述，本论文通过对原始卵泡形成时生殖细胞一体细胞问互作( 发育阶段，细胞数量) ， f i g a 基因和c x 2 6 蛋白的表达，中肾组织对卵巢分化作用的研究，我们对小鼠原始卵泡形成机制 做了初步的探讨和研究。 美键词： 原始卵泡，胚胎小鼠，卵巢，f i g a 基因 i i a b s t r a c t t h ep r o c e s so f p r i m o r d i a lf o l l i c l e f o r m a t i o ni n v o l v e sc o m p l i c a t e dg e r mc e l l - s o m a t i cc e l l i n t e r a c t i o n i nt h i ss t u d y , u s i n gp r i m o r d i a lf o l l i c l er e c o n s t i t u t i o nc u l t u r em o d e l ，w ee x a m i n e dt h e m e c h a n i s mo fp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o ni nm i c e t h ed i s s o c i a t e df e t a lm o u s eo v a r i a nc e l l sc a nb er e c o n s t i t u t e di n t op r i m o r d i a lf o i l i c l ei ni nv i t r o c u l t u r e t h et y p i c a lp r i m o r d i a lf o l l i c l es t r u c t u r ea n dt h ee x p r e s s i o no fp r i m o r d i a lf o l l i c l er e l a t e dg e n e s ( z p l 一3 ，f i g aa n dc x 4 3 ) c o u l db ed e t e c t e di nr e c o n s t i t u t e df o l l i c l e s m o r e o v e r , f u n c t i o n a li n t e g r i t yo f t h e s ei nv i t r or e c o n s t i t u t e df o l l i c l e sw a si d e n t i f i e db yt h ee x p r e s s i o no fk e yg e n e s ( g 炒，b m p l 5a n d f s h r ) w h i c hp a r t i c i p a n ti nt h ep r i m o r d i a lf o l l i c l ed e v e l o p m e n t o f , s e t f r o m1 3 ，5d a y sp o s tc o i t u s ( d p e ) o n ，t h em o u s ef e t a lo v a r i a nc e l la c q u i r et h ea b i l i t yo fp r i m o r d i a l f o l l i c l er e c o n s t i t u t i o n g e r mc e l l sf r o m1 2 5d p ef e t a lo v a r yw o u l dd e v e l o pt oo o c y t e ，b u tt h e yc o u l dn o t i n t e r a c tw i t ht h e i rs u r r o u n d i n gs o m a t i cc e l l st of o r mt h ep r i m o r d i a lf o l l i c l ei nv i t r o t h r o u g hc o m p a r i n g t h ed i f f e r e n c eo fp r i m o r d i a lf o l l i c l er e l a t e dg e n e se x p r e s s i o nb e t w e e nt h ec u l t u r e d1 2 5d p ea n d1 3 5d p c f e t a lo v a r i a nc e i l s ，w ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no fz pg e n ew i l ld e t e r m i n et h en o r m a lo o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n ；t h ep e r s i s t e n te x p r e s s i o no f f i g ai sn e c e s s a r yf o r t h ep r i m o r d i a lf o l l i c l er e c o n s t i t u t i o u t a k i n ga d v a n t a g eo fp r i m o r d i a lf o l l i c l er e c o n s t i m t i o nc u l t u r em o d e l ，w ee x p l o r e dt h ep o s s i b i l i t yo f m a k i n gt r a n s g e n e t i ef o l l i c l ei nv i t r o t r a n s g e n e s i sp r o v i d e su sap o w e r f u la p p r o a c hf o rt h es t u d yo f g e n e sf u n c t i o n w h i l ef o rt h eo o c y t e ，t h ep e c u l i a r i t yo fc e l ld i v i s i o na n dt h ef o l l i c l es t m c t u l em a k e i t d i f f i c u l tt oi n t r o d u c et h ef o r e i g ng e n ei n t oo o c y t e h e r ew ee x a m i n e dt h em e t h o da n dp o s s i b i l i t yo f t r a n s f e c t i i l gm o u s ef e t a lo v a r i a nc e l l s f m m1 1 5d p ct o1 5 5d p c ，f e t a lm o u s eo v a r i e sc e l l sa td i f f e r e n t c e l ld i v i s i o ns t a t ew e l es e l e c t e df o rt r a n s f e c t i o n w ef o u n dt h a tu s u a lt r a n s f e c t i o nm e t h o d s ：c a l c i u m p h o s p h a t ea n dl i p o s o m em e t h o dc a nb eu s e di nt h ef e t a lm o u s eo v a r i a ng e r mc e l l st m n s f e c t i n n t h e l i p o s o m em e t h o dh a st h er e l a t i v eh i g h e rt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya n dd on o td a m a g e t h ec e l l so b v i o u s l y d u r i n gt r a n s f e c t i o n b u tw i t h i nt h ep r o p e ri n c u b a t i o nt i m eo ft h et r a n s f e c t i o ns o l u t i o n ( 3h o u r s ) ，t h e c a l c i u mp h o s p h a t em e t h o dw i l lp r o t e c tt h eg e r mc e l l sf r o md a m a g i n gm u c hb e t t e rt h a nl i p o s o m e m e t h o da l t h o u g ht h ec a l c i u mm e t h o dh a sr e l a t i v el o wt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y f e t a lm o u s eo v a r i a ng e r m c e l l sw i l ll o s et h ea b i l i t yo fi n c o r p o r a t i n gt h ef o r e i g ng e n e sa t1 3 5d p c ，w h e nt h e yb e g i ne n t e r i n g m e i o s i s b e f o r e1 5 5d p e , e s p e c i a l l ya t1 1 5 1 3 5d p e , t h ee x p r e s s i o no ff o r e i g ng e n e si nf e t a lm o u s e o v a r i a ng e r mc e l l sc e r t a i n l yp r o v i d eu sap o s s i b l em e t h o dt os t u d yt h em e c h a n i s mo fo o g e n e s i sd u r i n g f e t a la g e b a s i n g o 1t h ep r i m o r d i a lf o l l i c l er e c o n s t i t u t i o nm o d e la n do o g o n i at r a n s f e c t i o n ，w ef i l r t h e r e x a m i n e dt h eg e r mc e l l s o m a t i cc e l li n t e r a c t i o n d u r i n gp r i m o r d i a l f o l l i c l e f o r m a t i o n t h r o u g h c o - c u l t u r ea n dr e c i p r o c a lc u l t u r eo ff e t a lo v a r i a nc e l l s ，w ef o u n dt h a tt h ep r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o n r e q u i r es y n c h r o n i z e dg e r mc e l l - s o m a t i cc e l li n t e r a c t i o n t h ep r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o nc o m p e t e n t f e t a lo v a r i a ng e r mc e l l sa n ds o m a t i cc e l lw h i c ha td i f f e r e n tf e t a la g ec o u l dn o tf o r mp r i m o r d i a lf o l l i c l e d u r i n gr e c i p r o c a lc u l t u r e t h ef i g ae x p r e s s i o nw o u l dp r o g r e s s i v e l yl o s ea n dw i t ht h ea b e r r a n tb a x e x p r e s s i o n ，t h eg e r mc e l l sw o u l dd e g e n e r a t ee n o r m o u s l y 1 1 1 d u r i n gp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o n ，m o s tg e r mc e l l sw i l ld e g e n e r a t et h r o u g ha p o p t o s i s ；w h i l et h e o v a r i a ns o m a t i cc e l l sa r ei nt h er e l a t i v el o wc e l ld i v i s i o ns t a t e t oe x p l o r et h ep o s s i b l ef u n c t i o no fg e r m a n ds o m a t i cc e l l sn u m b e r0 1 3 t h es i z eo fp r i m o r d i a lf o l l i c l ep o o l ，w em o d u l a t et h er a t i oo fg e r mc e l l s n u m b e rv e r s u ss o m a t i cc e l l sn u m b e rd u r i n gf o l l i c l er e c o n s t i t u t i o nc u l t u r e t h ea d d e dg e r mo rs o m a t i c c e l l sw o u l dl e a dt h ea b e r r a n ts o m a t i cc e l lp r o l i f e r a t i o na n dt h ef a i l u r eo fp r i m o r d i a lf o r m a t i o n a n dw e s u p p o s e dt h a tt h en o r m a lp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o nr e q u i r ep r e c i s e l yr e g u l a t e dc e l ln u m b e rb a l a n c e ， a n da n yc h a n g eo ft h i sb a l a n c ew i l ld i s r u p tt h ep r o c e s so fp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o n a st h ef g ai st h o u 曲tn e c e s s a r yf o rp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o n ，w ea n a l y z e dt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ef g ae x p r e s s i o na n dg e r mc e l ls e l e c t i o n a p o p t o s i sf o rp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o nt h r o u g h i s ha n dt u n e lm e t h o d s w ef o u n dt h a tt h ef i g ap o s i t i v ea n dn e g a t i v eg e r mc e l l sc o u l db ed e t e c t e di n1 d p pn e o n a t mm o u s eo v a r y s a m ee x p r e s s i o np a t t e r nc o u l db ed e t e c t e di n1 7 5d p cf e t a lo v a r ya l r e a d y t h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no ff i g ai n1d p pm o u s eo v a r yi ss u p p o s e dp a r t i c i p a n ti nt h eg e r mc e l l s e l e c t i o nf o rp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o n ，b u td e t e r m i n i n gt h eg e r mc e i la p o p t o s i sa tt h i st i m e ，a st h e t u n e lp o s i t i v ec e l la l s oe x p r e s s e df i g ag e n e t h ef u n c t i o no fm e s o n e ；p h r o so nf e t a lo v a r i a nd i f f e r e n t i a t i o ni ss t i l lu n c l e a r i nm i c e ，1 2 5d p ei s t h ec r i t i c a lp e r i o df o rf e t a lo v a r y i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ee x a m i n e dt h ee f f e c t so f1 2 5d p cm e s o n e p h r o s o nm o u s ef e t a lo v a r ya ts a m ef e t a la g e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i s s o c i a t e df e t a lm e s o n e p h r i cc e l l s c o u l dn o ti n d u c et h e1 2 5d p cf e t a lo v a r i a nc e l l st or e c o n s t i t u t et h ep r i m o r d i a lf o l l i c l ei nc u l t u r e i nt h e s e r af r e et i s s u ec u l t u r es y s t e m ，1 2 5d p cf e t a lo v a r i e sc o u l dd i f f e r e n t i a t en o r m a l l yi nv i t r o b u tt h e p r e s e n c eo fm e s o n e p h r o sd u r i n gc u l t u r ew o u l db en e g a t i v e l ya f f e c t e do nt h ed i f f e r e n t i a t i o no ff e t a l o v a r i a ns o m a t i cc e l l st op r e - g r a n u l o s ac e l l s ，a n dl e a dt ot h ef a i l u r eo fn o r m a lo v a r i a nc e l ld i f f e r e n t i a t i o n a l1 2 5d p c t h ef u n c t i o no fm e s o n e p h r o so nf e t a lo v a r ym i g h td e p e n do ns o m eu n k n o w nf a c t o r sa n d h o n n o n o s c o n n e x i ni s t h o u g h ti m p o r t a n tf u rc e l l i n t e r a c t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o nd u r i n gf o l l i c l e d e v e l o p m e n t h e r ew ee x a m i n e dt h ee x p r e s s i o no fc o n n e x i n2 6f 2 6 ) i nf e t a lm o u s eo v a r y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec x 2 6c o u l db ed e t e c t e di nm o u s ef e t a lo v a r ya te a r l ys t a g e a tt h es a l n et i m e ，w e c o u l do b s e r v ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fc x 2 6i nf e t a lo v a r i a ng e r mc e l l s b e f o r ee n o l - o l o u sp r i m o r d i a l f o l l i c l ef o r m a t i o n ( 1 8 5a p e ) ，t h i sd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o nm i g h tp a r t i c i p a n ti nt h ef o l l i c l ef o r m a t i o no n s e t w h i l ed u r i n gt h ep r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o n ( 1d p p ) ，t h i sd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ni ng e r mc e l l si s t h o u g h tn o td e t e r m i n e st h eg e r mc e l ls e l e c t i o nf o rp r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o n b e y o n d5d p pt oa d u l t ， t h ee x p r e s s i o no fc x 2 6i no o c y t e sa n df o l l i c l et h e c ac e l l si m p l yt h a tc x 2 6m i g h tf u n c t i o ni nt h ef m a l i n t e g r a t i o no f p r i m o r d i a lf o l l i c l ep 0 0 1 i ns u m m a r y , t h r o u g hr e s e a r c h e so nt h eg e r m - s o m a t i cc e l li n t e r a c t i o n ( d e v e l o p m e n ts t a g e ，c e l l n u m b e r ) ，f i g aa n dc x 2 6e x p r e s s i o n ，t h ef u n c t i o n o fm e s o n e p h r o so no v a r i a nd i f f e r e n t i a t i o n , t h e p r e l i m i n a r ym e c h a n i s mo f p r i m o r d i a lf o l l i c l ef o r m a t i o nw a ss t u d i e d k e yw o r d s ：p r i m o r d i a lf o l l i c l e ，f e t u s ，m o u s e ，o v a r y , f i g a i v a m h b c i p b d n f b l i m p b m p c x d p c d p p e c g e s l 毫 f b s f g f f 1 g a f o x l 2 f s h r g c n a g d f g f p g v h c g i t s h n f 3 l h r u f m c f m i s m p s m n b t n g f n o b o x n t p b s p g c s r t - p c r s c f s c p 英文缩写中文对照 a n t i m u l l e r i a nh o r m o n e 5 - b m m o 一4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l p h o s p h a t e b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r bl y m p h o c y t ei n d u c e dm a t u r a t i o np r o t e i n b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n c o n n e x i n d a y sp o s tc o i t u s d a yp o s tp a o u m e q u i n ee h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g s f e t a ib o v i n es e r a m f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r f a c t o ri ng e r m l i n ea l p h a f o r k h e a db o xl 2 f o l l i c u l a rs t i m u l a t i n gh o r m o n er e c e p t o r g e r mc e l ln u c l e a ra n t i g e n g r o w t hd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r g r e e n f l u o l e s c e n c ep r o t e i n g e r m i n a lv e s i c l e h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n i n s u l i n ，t r a n s f e r r i n g ，s o d i u ms e l e n i t e h e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r l u t e i n i z i n gh o r m o n er e c e p t o r l e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r m a s tc e l lg r o w t hf a c t o r m e i o s i si n d u c i n gs t e r o l m e i o s i sp r e v e n t i n gs t e r o l m o u s ev a s ah o m o l o g n i u o b l u et e t r a z o l i u m n e r v eg r o w t hf a c t o r n e w b o r no v a r yh o m e o b o xg e n e n e u r o t r o p h i n s p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e p r i m o r d i a lg e r mc e l l s t e v e t s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n s t e mc e l lf a c t o t s y n a p t o n e m a lc o m p l e xp r o t e i n 抗缪勒激素 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚基一磷酸盐 脑源神经营养性因子 b 淋巴细胞诱导成熟蛋向 骨形态发生蛋白 连接蛋白 妊娠天数 分娩后天数 孕马血清促性腺激素 表达序列标签 胎牛血清 成纤维细胞生长因子 生殖细胞系因子a l p h a 箭头盒子l 2 卵泡刺激素受体 生殖细胞核抗原 生长分化因子 绿色荧光蛋白 生发泡 人绒毛膜促性腺激素 胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠 实质细胞核因子 黄体刺激素受体 自血病抑制因子 肥大细胞生长因子 减数分裂诱导甾酵 减数分裂阻止甾醇 小鼠管周源体 硝基四氮唑蓝 神经生长因子 新生卵巢h o m e o b o x 基因 神经营养蛋白 磷酸缓冲液 原始生殖细胞 反转录聚合酶链式反应 干细胞因子 联会复合体蛋白 v s r y t d l t g f b t n a p t u l i e l u g r z p p a r s e x d e t e r m i n i n gr e g i o no f y - c h r o m o s o m e t e s t i sd e f e n s i n - l i k e t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rb e t a t i s s u e - n o n s p e c i f i ca l k a l i n ep h o s p h a l a s e t r - m e d i a t e db i o t i n y l a t e d d u t pn i c kc o d l a b e l i n gm e t h o d u r o g e n i t a lr i d g e s z o n ap e l l u c i d a p a r t i t i o n i n gd e f e c t i v e y 染色体上的性别决定区域 睾丸防卫素类似物 转化生长因子b e t a 非组织特异性的碱性磷酸酶 末端脱氧核苷转移酶调节的生物素 化脱氧尿苷三磷酸缺口标记法 尿生殖嵴 透明带 极性蛋自 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 c 髫苗 时间：加年月移曰 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一虢砖砖 翩躲飞、碱 导师签名： 1 吖) 移一、 时间：刀t 年钿- 4 日 时间：年月 日 第篇文献综述 厅i j 舌 不育和人r 7 的快速增长是两个全球关注的人类健康问题。今天，随着科学技术的进步，人类 生存的质量得以大大的提高，人类生殖健康的状况也已随着生殖生物学的发展得到了显著的改 善，但是对生殖生理机制的尚不完全明确仍是人类承受许多生殖疾病和障碍困扰的根本原因。生 殖生物学的研究是当前生物医学研究的热点。雌性动物的生殖细胞卵母细胞其有发育过程的 复杂性，数量上的有限性，以及在早期胚胎发育中具有的主导性等特点。正是这些特点决定了对 卵母细胞发育机制的研究成为当前生殖生物学研究领域中极其重要的一部分。 卵泡是雌性哺乳动物卵巢最基本的功能单位。鉴于实际应用的意义，目前关于卵母细胞发育 机制的研究中大部分为卵母细胞成熟机制的研究，而关于原始卵泡形成机制的研究并不多。目前 现有的、为数不多的研究结果也仅仅限于各类生长因子和激素对原始卵泡形成过程的影响。原始 卵泡形成的机制，即原始卵泡形成过程中生殖细胞与体细胞相互作用，以及相互作用中所涉及的 基因表达，激素及生长因子的调控通路目前还是未知的。由于雌性哺乳动物一生所发育的卵泡都 来自于原始卵泡形成时所建立的原始卵泡库，因此研究原始卵泡的形成机制，对于了解卵泡发育 过程中所涉及的卵泡差异发育事件( 如，卵泡的优选和闭锁) 的研究提供了可能的、潜在的数据： 为解释遗传性卵巢疾病提供基础的理论依据；为定向诱导干细胞发育为卵母细胞提供可遵循的实 验和理论依据。 原始卵泡形成的过程包括以下一系列的步骤，这些步骤的总和决定了动物在出生时卵巢中卵 泡储备的大小。这些事件包括：( 1 ) 生殖细胞系或原始生殖细胞的建立；( 2 ) 原始生殖细胞向性 腺的迁移和增殖；( 3 ) 原始生殖细胞在性腺中的细胞分裂和分化；( 4 ) 卵原细胞的形成；( 5 ) 减 数分裂的起始和双线期阻滞；( 6 ) 颗粒细胞的发育，增殖和分化。 i。11，j。ij【。1。jj。i。j1。，。1上j e 7e 8 e 9e 1 0e t le 1 2 e 1 3e 1 啐e 1 5e 1 6 e 1 7 e 1 8p 3 图1 小鼠原始卵泡形成过程主要事件及时问( 引自e r i c s s o n , ，2 0 0 ( ) ( e ：胚胎日龄；p ：出生后日龄) 第一章生殖细胞的起源和早期发育 1 1 生殖细胞的起源 生殖细胞即指那些在生物机体发育的过程中最终发育为精子和卵子的细胞。在所有有性生殖 的动物和植物中，这些细胞发挥着重要的作用，即将遗传信息传递给下一代。精子和卵子的最终 生成( 精于发生和卵子发生) 在脊椎动物和无脊椎动物中都已技广泛而深入地研究。然而，生殖 细胞系的起源却很少被深入地研究，这可能是由于这方面的研究具有较少的应用价值以及在实际 操作上具有相当的困难性。 在一个世纪前，动物学家就认识到，在某些生物有机体中，存在一些细胞在发育的早期就与 那些最终发育为体细胞系的细胞，以及在发育过程中死亡的细胞隔离出来而发育成为生殖细胞 系。随后的研究在蛔虫( n i e u h a o p 和s u t a s u r y a ，1 9 8 1 ) ，蛙( m a h o w a l d 和h e n n e n ，1 9 7 1 )