（分析化学专业论文）基于复合纳米材料组装的信号增强的电化学免疫传感器的研究.pdf

摘要 基于复合纳米材料组装的信号增强的电化学 免疫传感器的研究 分析化学专业博士研究生卓颖 指导教师袁若柴雅琴教授 摘要 电化学免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展起来的具有快 速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传感器。免疫传感器主要由生物识别系统( 感受 器) 和换能器组成。将抗原或者抗体分子固定到换能器表面称为传感器敏感界面的构建，这是 免疫传感器的研究和开发中最为重要和关键的步骤之一。本文从功能化复合纳米材料的制备， 传感器敏感界面的构建以及新型信号增强的免疫传感器的研制等方面进行了探索和研究。本 文主要分为以下几个部分： 第一章综述简要概述了现代免疫分析方法，详细介绍了免疫生物传感器的基本原理和 敏感界面的固定化技术，着重评述了多种纳米材料在生物传感器方面的应用；详细介绍了电 化学信号增强的免疫传感器的基本策略和信号增强的新型电化学免疫传感器的研究进展。 第二章由于抗原抗体蛋白均为非电活性物质，因此电化学免疫传感器一般需要对抗体或 抗原进行生物酶或者电活性物质的标记，从而实现把抗体和抗原结合信息转变为可测的电化 学信息。然而标记步骤复杂、耗时，且标记过程可能会影响免疫蛋白的特异性位点，致使生 物活性丧失。基于自组装技术和纳米技术，制备了染料硫堇包覆的s i o ：复合纳米粒子，再结 合具有比表面积大、吸附力强、生物亲和性好等优点的金纳米粒子，研制了纳米金硫堇s i 0 2 纳米金复合膜修饰的电流型癌胚抗原( g e a ) 免疫传感器。值得注意的是，基于硫堇固有的电化 学活性，该硫堇s i 0 2 复合纳米粒子修饰电极呈现出良好的氧化还原活性，其可以起到氧化还 原探针的作用，用以指示免疫反应发生的进程。从而无需在测试溶液中加入其他氧化还原探 针，进一步简化操作步骤，构建了无试剂型免疫传感器。与传统的免疫物质测试方法相比， 该方法具有无需对生物分子进行标记，不需竞争或者夹心反应，测试液中亦不需加入电活性 物质，只需在传感器表面进行常规免疫反应后，将其转移至测量池中测量响应电流信号即可， 具有操作简单、响应快、特异性强等特点。 第三章以具有独特的电学和光学特性的有机半导体材料花四甲酸二酐( p t c d a ， 3 , 4 ，9 ，1 0 0 p e r y l e n e t e t r a c a r b o x y l i cd i a n h y d r i d e ) 为原料，通过两步合成法制备了二茂铁基修饰的新 型成膜材料( p t c - f c ) 。p t c f c 具有导电性好，氧化还原活性强，易于成膜且比表面积大、表 i 西南大学博士学位论文 面活性位点多等优点，是一种理想的电极修饰材料。结合有机相合成和相转移技术制备的带 正电荷的金纳米粒子构建了电流型c e a 免疫传感器。正电荷金纳米粒子的引入不仅牢固的固 定了抗体蛋白，很好的保持了抗体蛋白的生物活性，同时与纳米多孔材料p t c f c 形成镶嵌结 构，起到了纳米导线的作用，加快了p t c f c 的氧化还原电子转移速率。该传感器具有制各简 单、灵敏度高、稳定性好、响应时间短等特点。 第四章酶免疫传感器将酶的化学放大作用与免疫物质的专一性识别相结合，兼有电化学 分析的灵敏性和免疫反应的特异性，为进一步提高免疫传感器的灵敏度，设计了免去传统酶 标操作的新型多层酶修饰的信号增强的电流型免疫传感器。以牛血清白蛋白( b s a ) 为固酶基 质，通过交联作用固载h r p 以提高酶膜的稳定性，基于联吡啶钻( c o c o p y ) 3 3 + ) 与b s a 之阎的静电 作用和疏水作用，c o f o p y ) 3 ”能够进入泼- h 耻复合膜中形成的具有电化学活性和生物相容性 的复合基质。固载抗体后又提出了使用h r p 封闭免疫电极上的非特异性吸附位点，并同时利用 h r p 的生物催化放大作用放大响应电流信号，进而提高免疫传感器的灵敏度的新方法。经实验 研究证明，该方法操作简单，协实可行，大大提高了免疫生物传感器的灵敏度。 第五章磁性纳米粒子具有易于磁性分离的特点，常用于标记免疫蛋白分子，构建可多次 再生的免疫传感器。本研究中合成了以磁性纳米颗粒f e 3 0 。为核，普鲁士蓝口b ) 为中间层并作 为电活性物质，a u 为外壳的多层结构的功能化磁性纳米颗粒( a u - p b - f e 3 0 4 ) ，该多层结构纳米 颗粒兼有在外磁场中可分离性以及生物分子快速固定化等特点，且由于中间层p b 的引入，其 还具有良好的氧化还原电活性。同时，将辣根过氧化物酶( h a p ) 、葡萄糖氧化酶( o 蝴蛋白 抗体同时标记到该纳米粒子表面。该多功能生物分子标记材料具有生物亲和性、催化活性、 电化学活性和易分离等优点。基于夹心免疫反应模式，借助生物标记的三层纳米粒子的多重 电化学催化作用可显著放大响应电流信号，构建了超灵敏易再生的电化学免疫传感器。 第六章在敏感界面的构建方面：将碳纳米管甩惰性蛋白b s a 分散，制得b s a 包覆的功能 化c n t 复合材料修饰到金电极表面，利用b s a 的小l h 2 残基吸附小粒径的纳米金颗粒。通过恒 电位沉积法，以小粒径的纳米金颗粒为品种，在h a u c l 4 溶液中电沉积纳米金，制得具有高比 表面积、强吸附作用和良好的生物亲和性的d p a u - c n t 纳米复合膜用以固载抗体蛋白。在信号 检测模式方面，设计了进一步增强电流响应信号，提高电极灵敏度的信号放大新策略：首先 制备了具有稳定性好、阻抗高等特点的聚合物n a f i o n 0 n 0 修饰的纳米s i 0 2 粒子，以此标记二抗 蛋白。当采用夹心免疫反应模式时，由于n f - s i o ：复合纳米粒子在电极敏感界面的引入，能显 著阻碍电子的传输，使电极的有效截面积大大减少，从而起到放大响应信号的作用，进而提 高传感器灵敏度。与直接免疫反应的方法相比，以二抗标记的n f - s i 0 2 纳米复合物为信号增强 手段的夹心免疫反应模式具有更宽的线性范围，高的灵敏度和强的特异性。 关键词：免疫传感器复合纳米材料电化学免疫分析信号增强 i l s t u d i e so i la m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r s b a s e do na s s e m b l yo fn a n o p a r t i c l e sa n d n o v e l s i g n a la m p l i f i c a t o r ys t r a t e g y s p e c i a l i t y ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y g r a d u a t e ：y i n gz h u o s u p e r v i s o r ：p r o f r u oy u a n a n dy a q i nc h a i a b s t r a c t e l e c t r 0 c h e r 血c a l l yb a s e d i t l l n l u n o s c l l s o r sa r ev a l u a b l ea n a l y t i c a lt o o l sf o rm o n i t o r i n g o ft h e 枷i b o d yo ra n t i g e na st h ea d v a n t a g e so fs h o r tr e s p o n s et i m e ，h i g hs e l l s l t l v 慨 1 1 i 幽s p e c i f i c i t ya n de a s ym a n i p u l a t i o n ，w h i c hc o m b i n e d t h em e r i t so fe l e c 仃0 c h 黜c a j t e c h n 0 1 0 9 ya i l di m m u n o a s s a y a ni m m u n o s e n s o ri sa na n a l y t i c a ld e v i c e t h a tr c s p 呲t 0 as u i t a b l ec o 暇l b i i l a t i o no fab i o l o g i c a lr e c o g n i t i o ns y s t e ma n da l l e l e c t r o c h e n m i c a j t m n s d l l c e r t l m st h ep l a t f o r m sc o n s t r u c t i o no ft h ea n t i g e no ra n t i b o d yb i o m o l e c u l e s i m m o b i l i z a t i o nh a v eb e e nt h ev i t a ls t e pi ns u c c e s s f u ld e v e l o p m e n t o fa l li m m u n o s e n s o r t h e r e f o r e t l l i sr e s e 缸c h f o c u s e so nt h ep r e p a r a t i o n o fm u l t i f u n c t i o n a l i z e d l l ；m o m a t e r i a l s ，纰c o n s t 删o no f t h ei m m t m o r e a c t i o ni n t e r f a c ea n dt h ed e v e l o p m e n to f s e i l s i t i v i t ye n h a n c e m e n te l e c t l ：o c h e m i c a l i l n m u n o s 睨l $ o r s t h ed e t m lc 0 撇a r e 弱 f o l l o w s ： i i nt h er 昏，i e ws e c t i o 玛a f t e rg e n e r a li n 仃o d u e t i o no fi m m u n o a s s a y i n c l u d i n gi t s p 咖c i p l ea n dt h ec o n s t r u c t i o n o fi m m u n o r e a c t i o ni n t e r f a c e ，t h ea p p l i c a t l o n o 士 n a l l o t e c h n 0 1 0 9 yi n t o i m m u n o s 锄s o r sw a sh i g h l i g h t e d m o r e o v e r , t h e r e s e a r c n d e v e l o p m e n to fi m m u n o s e n s o r sb a s e d o nn o v e ls i g n a la m p l i f i c a t o r ys 仃2 r t e g ) ，w 弱 p r e s 髓1 吼f i n a l l y , t h ew o r ka n ds i g n i f i c a n c eo f t h i st h e s i sw a sb r i e f l yi n 仃o d u c c d 2 s i n c em o s ti n l n l u l l ep r o t e i na r en o ti n t r i n s i c a l l ya b l et o a c ta sr e d o xp a m l e r sm 锄 e l e c 仃o c h 锄i c a lr e a c t i o n ，m o s ta m p e r o m e t r i ci m m u n o a s s a yt e c h n i q u e sa r er e l i e do n m el a b e lo fe i t h e ra n t i g e no ra n t i b o d y ，w h i c hr e q u i r e sh i g h l yq u a l i f i e dp e r s o n n e l ， t 觚0 u s 嬲s a yt i m e ，o rs o p h i s t i c a t e di n s t r u m e n t a t i o n i nt h i se x p e r i m e n t ，w e d e s c n b e d 1 1 1 西南大学博士学位论文 an e ws t r a t e g yf o rt h ed e v e l o p m e n to fan o v e lr e a g e n t l e s sa m p e r o m e t r i c i m m u n o s e n s o rb a s e do nt h ec a r c i n o e m b r y o n i ca n t i b o d y ( a n t i - c e a ) m o l e c u l et h a t w a sc o u p l e da th i g hd e n s i t yt o s a n d w i c h ( n a n o - a u s i o z t h i o n i n e n a n o o 岫 n a n o e o m p o s i t el a y e r s f o re f f i c i e n tc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) r e c o g n i t i o n h e r e i n , t h ei m m o b i l i z e ds i 0 2 t h i o n i n em a ya c ta se l e c t r o c h e m i c a lr e d o xp r o b et o m o n i t o rt h ev a r i e t yo ft h ek i n e t i cb a r r i e ro ft h ee l e c t r o d ei n t e r f a c e t h u s ，t h e d e t e c t i o nm o d ei sb a s e do nt h ec h a n g eo ft h ec u r r e n tr e s p o n s eb e f o r ea n da f t e rt h e s p e c i f i cb i n d i n go fa n t i - c e at oc e a ，d u et ot h ei m m u n o c o m p l e xi n h i b i t i n gt h e a c c e s so fr e d o xp r o b et oe l e c t r o d e t h ea s s a yf o r m a ta v o i d st h el a b e lo fa n t i b o d yo r a n t i g e n ，t h ec o m p e t i t i v eo rs a n d w i c hf o r m a t s ，t h ea d d i t i o no fa ne l e c t r o nt r a n s f e r m e d i a t o rt ot h es o l u t i o na n dt h es e p a r a t i o ns t e p t l l i ss i g n i f i c a n t l ys i m p l i f i e st h e i m m u n o a s s a yp r o c e d u r ea n ds h o r t e n sa s s a yt i m e s 3 t h i sw o r kd e s c r i b e sat w o - s t e pc o n j u g a t es y n t h e s i so fap o r o u so r g a n o m e t a l l i c n a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a l sc o m p o s e do ff e r r o c e n e m o n o c a r b o x y l i c ( f c - c o o h ) a n d 3 , 4 ，9 1 0 - p e r y t e n e t e t r a c a r b o x i l i cd i a n h y d r i d e ( p t c d a ) a n dt h e n ar e a g e n t l e s s a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rp r e p a r e dw i t hp o s i t i v e l yc h a r g e d9 0 l dn a n o p a r t i c l e s ( p g n ) i m m o b i l i z e di nt h i sn a n o s t m c t u r ec o n d u c t i v ef i l m i s d e v e l o p e d t h i s n a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a lc o m t a i n i n gf e r r o c e n y t ( p t c - f c ) c o u l de a s i l yf o r ms t a b l e f i l mo nt h ee l e c t r o d es u r f a c e 、析廿le f f i c i e n tr e d o x a c t i v i t ya n de x c e l l e n tc o n d u c t i v i t y f u r t h e r m o r e ，w i t ht h en e g a t i v e l yc h a r g e ds u r f a c e ，t h i sf i l m c a l lb eu s e da sa n i n t e r f a c et oa d s o r bt h ep g n , w h i c hw e r ep r e p a r e di no r g a n i cs o l v e n t sa tr e l a t i v e l y h i g hc o n c e n t r a t i o n sw i t hi m p r o v e dm o n o d i s p e r s i t yc o m p a r e dt ot h o s ep r e p a r e di n a q u e o u ss o l u t i o n t h ep r e s e n c eo fp g np r o v i d e dac o n g e n i a lm i c r o e n v i r o n m e n tf o r a d s o r b e db i o m o l e c u l e sa n dd e c r e a s e dt h ee l e c t r o nt r a n s f e ri m p e d a n c e t h u s ，w i t t l a n t i c e aa sam o d e la n t i b o d y , t h ep r o p o s e di m m u n o s e n s o rs h o w e dr a p i da n d l l i 曲l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s e t oc e aw i t ha c c e p t a b l e p r e p a r a t i o n r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t y 4 a l t h o u g ht h el a b e l f r e ei l d _ i n u n o s e n s o r sa r ea b l et od e t e c tt h ep h y s i c a lc h a n g e sd u r i n g t h ei m m u n ec o m p l e xf o r m a t i o n , w h e r e a st h ee n z y m e - l a b e l e di m m u n o s e n s o r su s e s i g n a l g e n e r a t i n gl a b e l sw h i c ha l l o wm o r es e n s i t i v ea n dv e r s a t i l ed e t e c t i o nm o d e s w h e ni n c o r p o r a t e di n t ot h ec o m p l e x t h u s ，ac o n c e p tb a s e d0 1 1an o v e l r e d o x - b i o c o m p a t i b l ec o m p o s i t ep r o t e i nm e m b r a n ef a b r i c a t i o n ，d o u b l ee t i z y m e m e m b r a n em o d i f i c a t i o nt e c h n i q u ea n da n t i b o d yi m m o b i l i z a t i o n , w a se x p l o i t e dt o a b s 。i r a c t d e v e l o pah i g h l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i ce n z y m ei m m u n o s e n s o rf o rd e t e c t i o no fc e a i nt h i sc o n c e p t ，as o l u t i o no fb o v i n es e t u l na l b u m i n s a ) c o n t a i n i n gh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( h r p ) i sc o a t e do nt h eg o l de l e c t r o d ei ns u c haw a y t h a tt h ef i r s t 既l z y n l e m e m b r a n ei sa c h i e v e d t h e nc o ( h p y ) 3 ”，a sar e d o xp r o b e s ，w a se m b e d d e di n b s a - h r p c o m p o s i t em e m b r a n e v st h ee l e c t r o s t a t i cf o r c ea n dh y d r o p h o b ef u n c t i o n s m o r e o v e r , t h en e ws t r a t e g yo ft h ee m p l o y m e n to fh r pt ob l o c kt h ep o s s i b l e r e m a i n i n ga c t i v es i t e sa n da m p l i f yt h er e s p o n s eo ft h ea n t i g e n - a n t i b o d yr e a c t i o nw a s p r o p o s e d t h ci m m u n o s e n s o rc o n s t r u c t e dw i t ht h ed o u b l el a y e rb i o c a t a l y t i ch r p m e m b r a n e sa n dt h ed e s i r a b l ec o ( b p y ) 3 j + b s ar e d o x - b i o c o m p a t i b l ec o m p o s i t e m e m b r a n ep e r f o r m e dh i g hs e n s i t i v i t ya n daw i d el i n e a rr e s p o n s et oc e 久，a sw e l la s g o o ds t a b i l i t ya n dl o n g t e r ml i f e 5 w i t ht h e i r u n i q u ep r o p e r t y - s u p e r p a r a m a g n e t i s m ，m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sh a v e b e c o m ea t t r a c t i v ef o re x p l o i t a t i o nm a i n l yi nb i o l o g ya n dm e d i c i n eb e c a u s et h e yc a n s i m p l i f yt h ep r o c e s so fp r o t e i n si m m o b i l i z a t i o na n ds e p a r a t i o n i nt h i sw o r k ，t h e p r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o no fat h r e e l a y e rm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e c o m p o s e do faf e 3 0 4m a g n e t i cc o r e ，ap r u s s i a nb l u e 伊b ) i n t e r l a y e ra n dag o l ds h e l l ( i t c a l lb ea b b r e v i a t e da sa u - p b f e 3 0 4 ) f o ra l lu l t r a s e n s i t i v ea n dr e p r o d u c i b l e e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s i n gf a b r i c a t i o nw a sd e s c r i b e df o rt h ef i r s tt i m e w i t ht h e e m p l o y m e n to ft h ea u - p b f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e ，an e ws i g n a la m p l i f i c a t i o ns t r a t e g y w a sd e v e l o p e db a s e do nb i e n z y m e ( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ea n dg l u c o s eo x i d a s e ) f t m c t i o n a l i z e da u - p b f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sf o ra ne l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s i n g f a b r i c a t i o nb yu s i n gc e aa n da f e t o p r o t e i n ( a f p ) a sm o d e ls y s t e m s ，r e s p e c t i v e l y t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wm a tt h em u l t i l a b e l e da u p b f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e se x h i b i t s a t i s f y i n gr e d o xe l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t ya n dh i g h l ye n z y m ec a t a l y s i sa c t i v i t y , w h i c h p r e d e t e r m i n e s t h e i r u t i l i t y i n h i g hs e n s i t i v i t ya n t i b o d y d e t e c t i o ns c h e m e s f u r t h e r m o r e ，t h i si m m u n o s e n s o rc o u l db er e g e n e r a t e db ys i m p l yu s i n ga ne x t e r n a l m a g n e t i cf i e l dw h i c he n s u r e dar e p r o d u c i b l ei m m u n o s e n s o rw i t hh i g hs e n s i t i v i t y 6 i nt h i sw o r k ，t h em u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) w e r ei n d i v i d u a l l yd i s p e r s e d i na na q u e o u ss o l u t i o nb yak i n do fn a t u r a lp r o t e i n s ，b o v i n es e r u ma l b u m i n0 3 s a ) ，t o o b t a i nb s am o l e c u l e sc o a t e dc n t s ( b s a - c n t s ) t h e nt h eg o l dc o l l o i d s ( n a n o a u ) w e r ea b s o r b e do nt h eb s a - c n r ss u r f a c eb yt h ea m i d oa n dd i s u l f i d eg r o u p so fb s a l a t e r , af u n c t i o n a l i z e d g o l d c a r b o n n a n o t u b e c o m p o s i t e n a n o h y b r i d ( d p a u n a n o - a u b s a c n t s ) m o d i f i e de l e c t r o d ew a s d e v e l o p e d b a s e do n v 西南大学博士学位论文 e l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o no fa u 抖o n t on a n o a u b s a m 仆盯ss u r f a c e t h u s ，a s e n s i t i v ei m m u n o s e n s o rf o rc a r b o h y d r a t ea n t i g e n19 9 ( c a l9 9 ) b a s e do na n t i b o d y i m m o b i l i z a t i o no naf u n c t i o n a l i z e dg o l d c a r b o nn a n o t u b ec o m p o s i t en a n o h y b r i dh a s b e e nc o n s t r u c t e dw i t ht h ea m p l i f i c a t i o nr e s p o n s eo fa n t i g e n - a n t i b o d yb yt h e e m p l o y m e n to fn a t i o nc o a t e ds i 0 2n a n o p a r t i c l e sl a b e l e ds e c o n d a r ya n t i b o d yb a s e d o nas a n d w i c hi m m u n o a s s a y m o r ei m p o r t a n t l y , t h es p e c i a lb i o m o l e c u l e - b i n d i n gc a l l n o to n l yc a u s et h ec o n s t r u c t i o no ft h ed i e l e c t r i ci m m u n o c o m p t e xl a y e rb u ta l s o i n t r o d u c et h ei n s u l a t e dn a t i o nc o a t e ds i 0 2n a n o p a r t i c l e sw h i c hd e m o n s t r a t et h e r e l a t i v e l yh i g hr e s i s t a n c e ，r e s u l t i n gi nas t r o n gd e t e c t i o ns i g n a l m o r e o v e r , t h e e x t r e m e l yh i 曲s t a b i h t yo ft h e f u n c t i o n a l i z e d g o l d c a r b o nn a n o t u b ec o m p o s i t e n a n o h y b r i dm o n o l a y e ra l l o w st h ed e s i g n e d 、b i o s e n s i n gi n t e r f a c et oo b t a i nag o o d s t a b i l i t ya n dl o n g - t e r ml i f c k e y w o r d s ：i m m u n o s e n s o r ；n a n o - m a t e r i a i se l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y ；s i g n a l e n h a n c e m e n t v i 独创性声明 学位论文题目：叁王复金纳盎盐盘缉蕉鲍焦量鲎堡鲍垫垡堂鱼瘗焦蹙 墨鱼盟塞 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了 标注。 学位论文作者： 牟颖 签字日期：膨夕月彩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：留不保密， 口保庙期限至年月止) 。 学位论文作者签名：年敬 签字日期：豳矽年彩月形日 导师签名： 签字日期：加7 年乒月刁日 ，1 第一章综述 第一章综述帚一早琢途 1 1 现代免疫分析 1 1 1 免疫分析法概述 任何一种物质当其通过非肠道的途径进入动物体后，机体识别其为病原体或 异物。为了防御外界病原体和异物入侵，识别和排除体外异性物质，以维持机体 的生理平衡与稳定，机体建立了一个完善而严密的防御系统，即免疫系统。机体 对病原体或异物，通过免疫系统作出的防御反应，叫做免疫反应。所有能作用于 机体而引起免疫反应、激活免疫系统产生抗体的病原体或异物等称为抗原( a n t i g e n , a g ) ，而身体内发生防御反应产生的专门对付抗原的物质叫做抗体( a n t i b o d y , a b ) 。 抗原和相应抗体，无论在体内或体外相遇，均可发生各种各样的反应，统称 为抗原抗体反应。根据抗原抗体反应的环境不同，可分为发生于体内沏v i v o ) 和发 生于体外( 加v i t r o ) 两种。在体内的抗原抗体反应主要表现为体液免疫应答，可介导 吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用。体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的 类型及参与反应的介质不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中 和反应等各种不同的反应类型。由于抗原抗体具有严格的特异性和较高的敏感性， 因此可采用已知抗原或抗体中的任何一方去检测未知的另一方，作为传染病的辅 助诊断、微生物的鉴定和化学分析测定等。 免疫分析法( i m m u n o a s s a y y e 是基于抗原和抗体特异性结合前后物理和化学性 质的变化建立的对生物蛋白的分析方法【i 2 】。免疫分析方法的理论基础是抗体一抗原 之间的特异性反应：即抗体与抗原之间的温和的、具有针对性的、专二性的相互 作用，该作用在一定条件下是可逆的【3 1 。通常具有化学结构和空间构型互补关系的 抗原和抗体，其免疫结合的实质是抗原的抗原决定簇( 也称表位) 与抗体的抗原 结合位点之间的非共价键结合，其结合的非共价键包括离子键、氢键、疏水力及 范德华力等【4 】。因此，抗体一抗原反应特有的高亲和性和高特异性使免疫分析成为 体外诊断最有效的蛋白分析方法。 。 通常免疫分析需要标记抗原或者抗体，标记物多为酶、光信号物质、电信号 物质等，也称标记免疫分析法，其利用标记物质的量与被测抗原或抗体的量呈相 关性的原理，通过对标记物的间接测定，实现对被测抗原或抗体的定性或定量检 测。通过抗原抗体特异识别作用，人们提出了夹心免疫反应和竞争免疫反应两种 免疫分析模式。其免疫分析过程及原理如图1 1 所示。夹心法是基于构建固相负载 抗体被测抗原标记抗体夹心免疫复合物的免疫分析方法。其要求抗原分 子表面有至少2 个抗原决定簇，才能先后与两个抗体结合，形成夹心之势。夹心 法只适合检测分子量大的抗原，灵敏度高，但步骤较繁琐。竞争法是基于被测抗 西南大学博士学位论文 原( 或抗体) 与标记的抗原( 或抗体) 共同竞争固定于固相的抗体( 或抗原) 所 提供的结合点的免疫分析方法。竞争法能检测生物大分子及半抗原小分子，分析 过程相对简单、快速，但灵敏度不及夹心免疫分析法。 除手旺争亭旷器 p 窿笛薯i 剖 免疫反应受多种因素的影响1 5 】。首先是抗原和抗体的自身的因素。作为免疫反 应的主体，抗原和抗体的性质、活性及浓度( 效价) 直接影响免疫反应。就抗原 而言，其理化形状、表面抗原决定簇的种类和数目均可影响免疫反应的结果：就 抗体而言不同来源的抗体其反应性能存在一定差异。同时，免疫反应的客观条件 也十分重要。 ( 1 ) 电解质电解质能降低抗原抗体结合物的表面电荷，从而促使其沉淀或 凝聚，是抗原抗体反应不可缺少的成分。抗原抗体结合后形成的免疫复合物由 亲水性胶体向疏水性胶体转换，此过程中要有适当浓度的电解质参与才能中和其 表面电荷使电势降低，使二者相互靠拢发生反应。在抗原抗体反应中，通常使用 o8 5 n a c i 溶液或各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。但参与反应的电解 质浓度不宜太高，否则会引起蛋白质非特异性沉淀，出现盐析现象。 ( 2 ) p h 当p h 值达到或接近蛋白质的等电点时，会引起蛋白质的自凝现象， 导致抗原抗体的非特异性沉淀，造成假阳性结果。p h 为2 3 时则会导致抗原一 抗体结合物解离。因此，维持适当的p h 值是抗原抗体反应必要条件之一，通常抗 原抗体反应最适p h 为6 0 80 。 ( 3 ) 温度反应温度与反应速度有密切关系。温度越低，反应速度越慢，但 抗原抗体结合越牢固；温度升高，抗原、抗体分子运动加快，碰撞机会增多，两 者反应速度也加快。若温度高于5 6o c ，可导致抗原、抗体变形或灭活，或使已结 第一章综述 台的抗原抗体复合物解离。抗原抗体反应最适温度为3 7o c 。 ( 4 ) 此外，机械振荡能加速反应，但强烈的振荡可是免疫复台物离解。反应 中如存在与反应无关的蛋白质、多耱等杂质，往往可能抑制反应进行甚至引起非 特异性反应。 1 12 免疫分析法的分类 根据免疫检测时是否使用标记物质，可以将免疫分析法分为非标记免疫技术 和标记免疫技术两类【6 ”。非标记免疫技术包括絮状、环状沉淀反应、单向琼脂扩 散反应、双向琼脂扩散反应和免疫电泳等。非标记免疫分析法通常是基于抗原抗 体结合形成抗原抗体复合物沉淀来进行分析，灵敏度