（分析化学专业论文）固相萃取和样品堆积耦联胶束电动色谱富集分离双酚a和烷基苯酚.pdf

上海大学硕士学位论文 摘要 胶束电动色谱( m e k c ) 自从1 9 8 4 年由t e r a b e 和他的同事们提出后，在分 离分析中性和带电化合物方面得到了广泛的应用，使c e 技术得到了进一步的 发展。m e k c 是一种既能分离带电组分又能分离中性溶质的模式。这一技术具 有分离效率高、分析时间短、容易操作和分析成本低的优点。但是，由于受检 测器、检测光程和进样量的限制，浓度检出限偏高，成为阻碍该项技术进一步 扩展其应用范围的主要问题。本论文对固相萃取和在线富集及两者的耦联与毛 细管电泳重要操作模式胶束电动色谱的结合三方面进行了研究，以期有效地改 善胶束电动色谱浓度检出限，拓宽胶束电动色谱对复杂环境样品中痕量组分分 析的应用。 第一章、简述了与本论文研究内容相关的基本理论以及国内外研究现状。 第二章、研究了用b 环糊精键合硅胶( c d s ) 作选择性吸附剂和1 金刚烷 酸作顶替洗脱剂对含有4 叔丁基苯酚和双酚a 的样品水溶液进行s p e 处理， 收集下的洗脱溶液直接进行m e k c 分离测定的方法。实验中c d s 对4 叔丁基 苯酚和双酚a 表现出良好的保留能力。1 金刚烷酸可以有效的洗脱下b 环糊精 键合硅胶所保留的4 叔丁基苯酚和双酚a ，并实现对样品的富集，富集倍数达 3 0 倍以上。 第三章、基于当携带有分析物的1 3 环糊精穿过1 金刚烷酸溶液区带时，分 析物被1 金刚烷酸置换下来后经分配进入s d s 胶束而使分析物迁移速度降低的 机理，建立了一种改进的样品堆积m e k c 富集分离方法，使b p a 和三种烷基苯 酚得到了5 倍以上的富集。另外，采用此样品堆积m e k c 富集分离测定方法在 实际湖水样中检测到了两种未知化合物。 第四章、采用以上研究中建立的s p e 和改进的样品堆积方法，建立了固相 萃取和样品堆积耦联m e k c 富集检测分析方法，迸一步改善了m e k c 对b p a 的浓度检出限，最低检出限为2 “g l ，实现了约3 0 0 倍的富集效果( 以峰高计) 。 显示出固相萃取和样品堆积耦联m e k c 方法不但可以起到对b p a 进行富集的 目的还可以实现对分析样品进行净化的作用。 第五章、总结全文。 关键词：胶柬电动色谱，固相萃取，p 环糊精键合硅胶，1 一金刚烷酸，样品堆 积 v 上海大学硕士学位论文 a b s t r a c t m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) h a sg a i n e dp o p u l a r i t y i n a n a l y t i c a ls e p a r a t i o no fn e u t r a lc o m p o u n d sa sw e l la sc h a r g e do n e ss i n c ei tw a s i n 廿o d u c e db yt e r a b ea n dh i sc o w o r k e r si n1 9 8 4 m e k ci so n eo ft h ec o m m o n f o r m a t so fc e ，h a v i n gw i d ea p p l i c a t i o n s t h i st e c h n i q u es h o w sa d v a n t a g e so fh i g h s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y ，s h o r ta n a l y s i st i m e ，e a s yo p e r a t i o na n dl o wo p e r a t i o nc o s t h o w e v e r ，a p p l i c a t i o no fm e k ci sr e s t r a i n e db yi t sl o wc o n c e n t r a t i o ns e n s i t i v i t y a s s o c i a t e dw i t ht h ec o m m o nl r v - v i sd e t e c t o r so ft h el i m i t e do p f i c a lp a t hl e n g t hf o r o n - c a p i l l a r yp h o t o m e t r i cd e t e c t i o na n dt h em i n u t ev o l u m eo fs a m p l es o l u t i o nt h a t c a nb el o a d e d d e v e l o p m e n to fc o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e si so fg r e a tn e c e s s i t yf o r e x p a n d i n gi t sa p p l i c a t i o n st os a m p l e sc o n t a i n i n ga n a l y t e sa tl o wc o n c e n t r a t i o nl e v e l s i nt h i st h e s i s ，s t u d yo nc o u p l i n gs p ea n ds t a c k i n gt om e k cf o rt h es e p a r a t i o no f b i s p h e n o laa n da l k y l p h e n o l sw i t hc o n c e n t r a t i o ne n h a n c e m e n ti sp r e s e n t e d t h e p u r p o s eo ft h er e s e a r c hi s t o i m p r o v ec o n c e n t r a t i o ns e n s i t i v i t ya n de x p a n dt h e a p p l i c a t i o no f m e k c t oa n a l y s i so f t r a c ep o l l u t a n t si ne n v i r o n m e n t a ls a m p l e s c h a p t e r1 b a s i ct h e o r i e sa n dd e v e l o p m e n t si nt h er e l a v a n tt e c h n i q u e sa r eb r i e f l y i n t r o d u c e d c h a p t e r2 u s eo f1 - a d a m a n t a n e c a r b o x y l a t ea sd e s o r b i n gd i s p l a c e rf o re l u t i n g s o l u t e sr e t a i n e dw i t ht h es o r b e n to f1 3 - c y c l o d e x t f i nb o n d e ds i l i c a ( c d s ) w a ss t u d i e d f o rc o u p l i n gs o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) w i t hm e k c t h es o r b e n ts h o w e ds t r o n g c a p a c i t yo fr e t a i n i n g4 一t e x t b u t y l p h e n o l ( 4 - t b p ) a n db i s p h e n o la ( b p a ) s p i k e di n d o u b l e - d i s t i l l e dw a t e r u s i n gt h ed e s o r b i n gd i s p l a c e ro f1 - a d a m a n t a n e c a r b o x y l a t ew a s m o r ee f f e c t i v ei ne l u t i n g4 - t b pa n db p ar e t a i n e df r o mt h ec d ss o r b e n ti nt h es p e c a r t r i d g e st h a nc o m m o no r g a n i cs o l v e n t s t h ee l u a t e c o l l e c t e dc a nb e d i r e c t l y i n t r o d u c e dt om e k cf o rs e p a r a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o nf a c t o r so ft h es p ep r o t o c o l w a sg r e a t e rt h a n3 0 一f o l df o rb c l t h4 - t b pa n db p aa sm e a s u r e dw i t hm e k c c h a p t e r3 am o d i f i e ds t a c k i n gt e c h n i q u ew a sd e v e l o p e d i tw a sb a s e do nt h e v i 上海大学硕士学位论文 r e d u c t i o no fm i g r a t i n gs p e e do fa n a l y t e sw h e nt h ea n a l y t e sw a sd i s p l a c e do u tt h e c a v i t yo f - c y c l o d e x t r i nb yi - a d a m a n t a n e c a r b o x y l a t ea n dp a r t i t i o n e di n t ot h es d s m i c e l l e t h em o d i f i e ds t a c k i n gt e c h n i q u ew a sa b l et oc o n c e n t r a t eb p aa n dt h et h r e e a l k y l p h e n o l sb ym o r et h a n5 f o l d i na d d i t i o n , t w ou n i d e n t i f i e dc o m p o u n d sw e r e d e t e c t e di nar e a ll a k ew a t e rs a m p l eb yu s i n gm e k cw i t ht h em o d i f i e ds t a c k i n g t e c h n i q u e c h a p t e r4 c o n b i n a t i o no ft h es p ea n dt h em o d i f i e ds t a c k i n gt e c h n i q u ew a s a c c o m p l i s h e di nc o u p l i n gw i t ht h em e k c s u c hac o u p l i n gm e t h o di m p r o v e d f i 】m 嫩t h ec o n c e n t r a t i o ns e n s i t i v i t yi nt h em e k c t h ec o n c e n t r a t i o nf a c t o ro ft h e p r o c e d u r ew a sa b o u t3 0 0 - f o l df o rb p aa n dt h ed e t e c t i o nl i m i t ( s 斛兰3 ) w a sa sl o wa s 2 肛p ；la sm e a s u r e dw i t ht h em e k cc o u p l e dw i t h t h es p ea n dt h em o d i f i e ds t a c k i n g i tw a sa l s on o t e dt h a tt h ec o u p l i n gp r o c e d u r eh a da n o t h e rr o l eo fs a m p l ec l e a n - u p c h a p t e r5 s u m m a r yo f t h et h e s i s k e y w o r d s ：m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) ，s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) ，i - - c y c l o d e x t r i nb o n d e ds i l i c a , 1 - a d a m a n t a n e c a r b o x y l a t e ，s t a c k i n g v i i 上海大学硕士学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发 表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：茸日期：立弛t ) 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学 校可以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：己硅堑导师签名：垒塑浆日期：2 咀：丑：哆 i i 上海大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章概述 毛细管电泳( c e ) 是近2 0 多年来发展起来的一种高效分离分析技术，近年来 在环境分析应用上已经表现出强劲的发展势头【l 】。就c e 技术特点而言，毛细管 电泳应该说是一项环境友好的分析检测技术，具有分离效率高、分离速度快、 所需样品用量少、试剂消耗少、产生的二次污染少等优点。然而，它的突出问 题是其浓度检出限偏高，限制了毛细管电泳对复杂环境样品中痕量组分分析的 应用。近年来，许多研究工作者为了改善毛细管电泳浓度检出限，拓宽毛细管 电泳的实际应用做了大量的研究工作。相关工作可以简单地归结为三个方面： 灵敏检测器的开发、毛细管电泳在线富集技术和毛细管电泳与样品前处理联用 技术。 灵敏检测器的开发应用无疑是最有发展前途和应用价值的研究方向。通过 设计改造毛细管检测窗口可以将紫外检测的灵敏度提高1 2 , 3 1 。对于普通的实验 室来讲，这些新型的检测器因价格昂贵其普及应用还需要一段时间。激光诱导 荧光和电化学检测可以将检测灵敏度提高几个数量级，但是前者仪器昂贵，后 者要求分析物具有电化学活性1 4 - 7 ，使其广泛应用受到限制。 在线富集技术的出现并得到人们的认可只经历了较短的一段时间，其有效 的富集能力和简单的操作方法对分析工作者具有极大的吸引力。近些年发展了 一系列在线富集技术并得到了广泛的应用 8 - 1 3 1 。样品富集的分析对象从阴、阳 离子扩展到中性分子或混和离子1 1 4 17 】。 固相萃取作为样品前处理方法操作简单、成本低廉、易于自动化，富集效 果也能达到很高的水平，固相萃取与毛细管电泳联用具有较高的潜在应用价值， 目前人们正在努力开展这方面的研究工作。同时，将在线富集技术与固相萃取 技术相结合，有助于更好地改善毛缅管电泳浓度检出限。本论文对固相萃取和 在线富集及两者的耦联与毛细管电泳重要操作模式胶束电动色谱的结合三方面 进行了研究，以期有效地改善胶束电动色谱浓度检出限，拓宽胶束电动色谱对 上海大学硕士学位论文 复杂环境样品中痕量组分分析的应用。 1 2 毛细管电泳简介 电泳( d e c t r o p h o m s i s ) 是带电粒子在电场作用下的于液相介质中作定向移 动。高效毛细管电泳( h i g h p a c o r m a a o e e a p i u a r ye l e e t r o p h o r e s i s ，h p c e ) ，简称 毛细管电泳( c e ) ，是以高压电场为驱动力，以石英毛细管为分离通道，依据 样品离子和荷电分子按其迁移速度的差异而进行分离分析的一种新技术【l 引。它 是八十年代发展起来的一种新的分离分析技术。其可以分析从离子到分子，从 小分子到生物大分子的一系列化合物，具有高效、快速、样品和试剂用量少、 环境污染小、基体效应小、仪器及操作简便和分析成本低等特点，已经广泛应 用于食品、环境监测、药物分析、生物分析等领域。 1 2 1 毛细管电泳应用发展简史 早在1 9 世纪中叶就有人对电泳的现象进行过研究t 1 9 1 ，但作为一种在生物和 生物化学中有重要意义的分离分析技术，则是在1 9 3 7 年由瑞典科学家t i s e l i u s 成功地研制出界面电泳仪而得以迅速发展的，t i s e l i u s 利用界面电泳仪首次从人 的血清中分离出白蛋白和* ，b ，t - 球蛋 2 0 1 。但是传统电泳的最大局限是难 以克服由两端的高电压所引起的焦耳热，这种焦耳热会引起管子内部产生径向 的温度梯度、粘度梯度和速度梯度，从而导致区带展宽，影响迁移，降低效率。 这种影响极大地限制了高电场强度的使用，也就难以加快电泳过程分离分析的 速度1 2 ”。1 9 6 7 年，h j e n e n 最先提出在高电场强度，直径为3n l m 的玻璃管内作 自由溶液的区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) ，它通过旋转玻璃管 来减小对流及对分离效率的影响，此法设计巧妙，但是操作过于麻烦，同时由 于样品过载，未能实现很高的分离效率。1 9 7 4 年，v i r t a n e n 提出用2 0 0 5 0 0p a n 内径的毛细管作电泳分离，尽管没有完全克服传统电泳的弊端，但大大缩短了 其和现代电泳技术之间的距离 2 2 j 。 8 0 年代，c e 技术取得了突破性的进展 2 3 ，2 4 1 。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u e a e s 使用7 5g r n 内径的毛细管，采用柱上荧光检测，3 0k v 的高电压，分离了氨基 2 上海大学硕士学位论文 酸和多肽，获得了4 0 多万的理论塔板数，这被认为是当今c e 技术发展的里程 碑。1 9 8 4 年，t e r a b e 提出了以组分在胶束和缓冲溶液之间的分配为基础的胶束 电动色谱( m i e e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e k c ) ，弥补了c z e 不能分离中性组分的缺陷，进一步拓展了c e 的应用范围1 2 5 。1 9 8 7 年h j e r t e n 提出了毛细管等电聚焦( c a p i l l a r y i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ，c l e f ) 。同年，c o h e n 和 k a r g e r 提出了毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e e t r o p h o r e s i s ，c g e ) 。 随着c e 理论的逐渐成熟，仪器的不断改进和完善，新方法的不断诞生， c e 还有很大的发展空间。激光诱导荧光( l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，u f ) 技 术应用到c e 中显著降低了检出限和提高了检测灵敏度 2 6 1 。质谱( l a s s s p e c t r u m ，m s ) 与c e 的联用使得分离分析与结构解析一体化，而且能够提供 分子水平上的检测【2 7 l 。近年来，以c e 为核心技术，以芯片为操作平台的微全 分析系统( m i n i a l u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ，i l t a s ) 的迅速崛起，有可能引 起分析化学领域的一场变掣2 8 9 1 。9 6 根阵列c e 的实用化大大加快了人类基 因组计划的进程，使之由原定的2 0 0 5 年提前到2 0 0 0 年基本完成1 3 0 j 。毛细管电 色谱( c a p i l l a r ye l e e t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 将c e 的高柱效、分析速度快、 样品用量少等优点与h p l c 的高选择性有机地结合起来。毛细管免疫电泳 ( c a p i l l a r yi m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ，c i e ) 是建立在抗原与相应抗体之间的免疫 结合的基础上，利用抗体( 或抗原) 作为选择性试剂测定抗原、半抗原( 或抗 体) 的方法f 2 9 ，3 ”。在临床医学等领域得到应用和发展。 仪器和方法的发展使得c e 在生命科学、医药学和环境保护等领域中取得 重要的应用。c e 在基因工程研究方面被用于d n a 分析，在生命科学研究方面 被用于单细胞分析，在药物分析方面被用于药物的分析检测等，在环境保护方 面被用于环境污染物的分析。 1 2 2 电泳与电渗 荷电粒子在外电场的作用下于溶液中作定向移动的现象叫电泳 ( e l e c t r o p h o r e s i s ) 。通常毛细管电泳中所用石英毛细管柱为硅胶表面，在一定的 p h 下，其表面的硅羟基解离并带负电( - s i o ) ，由于静电引力，一s i o 将把电解 上海大学硕士学位论文 质溶液中的阳离子吸引到管壁附近，并在一定距离内形成阳离子相对过剩的扩 散双电层。在外电场的作用下，带正电荷的溶液表面即扩散层的阳离子向阴极 移动。由于这些阳离子实际上是溶剂化的( 水化的 ，它们将带动毛细管中的液 体一起向阴极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。在电渗力的驱动下毛细 管中整个液体的流动叫毛细管电泳中的电渗流( e l e c t r o o s m o t i c f l o w ，e o f ) 。 由于电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度来描述荷电 粒子的电泳行为与特性。电泳淌度( ，k ) 定义为单位电场强度下离子的平均电泳 速度， 如= v i e ( 1 1 ) 类似于电泳中用淌度来描述荷电粒子的电泳行为，在此用电渗淌度( 心。) 表示e o f 的大小， 如= e ( 1 2 ) e o f 速度可用实验方法按下式计算 = l ( 1 3 ) ，为毛细管的进样端至检测窗口的长度，称为有效长度。 k 为电渗流标记物从进样端迁移至检测窗口所需时间。 电渗流是伴随着电泳产生的一种电动现象，在毛细管电泳分离中起着重要 作用。多数情况下，e o f 速度比电泳速度快5 7 倍，因此，在毛细管电泳中， 利用e o f 可带动正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，在次 毛细管电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。通过对e o f 大小和方向的 控制，还可影响毛细管电泳分离的效率、选择性和分离度，成为优化分离条件 的重要参数。 1 2 3 毛细管电泳仪 毛细管电泳仪通常由一个高压电源、一根毛细管、一台检测器、两个供毛 细管两端插入并又和电源相连的缓冲液贮糟、输出讯号和数据处理器组成，装 4 上海大学硕士学位论文 置示意简图如图1 - 1 所示1 3 2 1 。 毛细管柱是c e 的核心部件，毛细管的材料、几何尺寸、形状、内壁等都 是影响分离的主要因素，目前毛细管一般是由弹性熔融石英材料制得。柱的形 状目前一般采用内径为2 5 1 0 0p r n 圆形柱，柱长在1 0 0c m 以内。 图1 - 1c e 装置示意简图，h v ：高压电源，e ：缓冲液槽，p t ：铂电极，c ：毛细管，d ： 检测器，d a ：数据采集系统 f i g 1 - 1b a s i cs e t - u po f c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i ss y s t e m 在广泛应用的毛细管区带电泳中，毛细管和电极槽内充有相同组分和相同 浓度的背景电解质( 缓冲溶液) 。样品从毛细管的一端( 称为进样端) 导入。当 毛细管两端加上一定的电压后，荷电溶质便朝与其相反的电极方向移动。由于 样品组分间的淌度不同，它们的迁移速度不同，因而经过一定时间后，各组分 将按其速度( 或淌度) 大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的 电泳谱图。 1 3 胶束电动色谱简介 胶束电动色谱( m e k c ) 自从1 9 8 4 年由1 h a b e 【2 5 1 和他的同事们提出后，在 分离分析中性和带电化合物方面得到了广泛的应用。多数m e k c 在毛细管中完 成，所以又称为胶束电动毛细管色谱( m i e e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 。它的实质是以电渗流驱动的一种色谱技术。m e k c 上海大学硕士学位论文 是一种既能分离带电组分又能分离中性溶质的模式，具有以下显著优点：高效、 快速、样品和试剂用量少、操作成本低和自动化程度高。所有这些特点使胶束 电动色谱成为一种非常高效，快速和经济的分离分析技术，已广泛应用于环境 分析领域。 1 3 1 胶束电动色谱基本理论 m e k c 是在电泳缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，当缓冲溶液中表面活 性剂的浓度超过临界胶束浓度( c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ，c m c ) 时，表面 活性剂分子间的疏水基团聚集在一起形成胶束，这是一种与电泳缓冲液有相对 运动的假固定相，溶质基于在水溶液相和假固定相之间的分配系数不同而得到 分离。 在m e k c 中，分离度和分离效率表达和传统的高效液相色谱类似，可以分 别用方程( 1 ，4 ) 和方程( 1 5 ) 表示： r s = 坠4 譬。惫k 热t k 4 ， 口 1 + ，1 + l 。t 眦l n = 5 5 4 ( w t r ) 2 ( 1 5 ) 式中n 为理论塔板数，a 为分离因子，k 1 和k 2 分别为溶质1 和2 的容量 因子。增加表面活性剂的浓度，k 呈线性递增。t 以。为迁移时间窗1 5 1 的宽度， 是一个重要的参数。较小的t o k 。使迁移窗口变宽，因而有较高的分离度。a 是 分离度中最重要的一项，通过改变胶束的神类或修饰水相，可以改变溶质分子 在胶束假固定相和水溶液相之间的分配系数，调节n 值。因此为取得良好分离 度，可通过选择胶束的种类和改变其浓度，以及改变缓冲液的种类和浓度、p h 值、离子强度和添加有机改性剂等来进行优化，提高选择性和分离度。 1 3 2 胶柬电动色谱在环境样品分析中应用的研究概况 多环芳烃( 队h s ) 是指两个以上苯环以稠环形式相连的化合物，是一类致癌 性有机污染物，在环境中广泛存在，对环境和人体健康危害很大。p a h s 是憎水 性中性化合物，在c e 发展的初期p a h s 的c e 分析存在一定困难。m e k c 技术 6 上海大学硕士学位论文 可以很好地用于p a i l s 的分离。1 9 9 1 年t e r a b e l 3 3 】运用十六烷基磺酸钠( s d s ) 一尿 素m e k c 体系对多氯联苯和p a i l s 进行了分离研究。更进一步的研究是在缓冲 溶液中加入合适的有机添加剂( 如环糊精等) ，一方面可以增加p a i l s 的水溶性， 另一方面还可以提高分离效率。p a l m e r 等人1 3 4 1 j 垂用十一烯酸低聚物体系对p a h s 进行了分离。b r o w n 等人【3 5 1 运用环糊精系统分析了被污染土壤中的p a h s 。 多氯联苯( p c b s ) 是一组由一个或多个氯原子取代联苯分子中的氢原子而形 成的氯代芳烃类化合物，是国际上关注的1 2 种持久性有机污染物之一。s e l v i n 等人1 3 6 1 采用聚合表面活性剂，在7 5r a m o l l 硼砂和4 0 7 , 腈的缓冲溶液中分离 出了9 个p c b s 。g a r c i a 等口刀采用c d - m e k c 方法，用两种环糊精的混合物为 假固定相在1 2r a i n 内分离出了1 3 组对映体中的1 9 个p c b s ，考察了缓冲液的 浓度、p h 、c d 衍生物浓度对分离的影响。 农药( 包括除草剂和杀虫剂) 的测定传统上常采用气相色谱和高效液相色 谱法。m e k c 也被用于农药及残留的分离分析。可采用c z e 或m e k c 对农药 进行分析 3 s l 。j u n g 等【3 9 1 通过对芳酸盐除草剂的衍生化，结合m e k c 方法，采 用激光诱导检测器进行c e 分离，检测限可达到2 1 0 。5 9 。 环境中的许多人工合成的化学物质对人体和动物的内分泌系统具有干扰作 用。这些环境内分泌干扰物既包括环境雌激素，也包括环境雄激素和环境甲状 腺激素等。采用m e k c 分析酚类内分泌干扰物已有报道应用 4 0 1 。b p a ( 5 双酚a ) 是环境中存在的内分泌干扰物，它是生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要原料，包 装材料中大都会用到聚碳酸酯和环氧树脂。所以对b p a 的分析方法研究受到环 境分析研究人员的重视 4 1 - 4 3 1 ，t a k e d a h 2 1 等人采用胶束电动色谱成功的分离了三 种烷基苯酚和双酚a ，有机溶剂的添加使烷基苯酚和b p a 的分离得到改善，对 b p a 的检出限达到了0 0 0 7 1m g l 。 m e k c 也像其它毛细管电泳方法一样，不同程度地受检测灵敏度( 浓度检 出限) 的限制。常常不能满足实际复杂样品中痕量组分分析的要求，如环境样 品中痕量污染物的分析。为了进一步扩展胶束电动色谱的应用范围，寻求改善 胶束电动色谱检出限的方法是一项具有重要实际意义的工作。胶束电动色谱的 检出限可以通过样品富集方法( 包括在线富集和离线富集) 来改善。本论文对 7 上海大学硕士学位论文 固相萃取( 离线富集) 和样品堆积富集( 在线富集) 及两者的结合三方面进行 了研究，以期有效地改善毛细管电泳浓度检出限，拓宽毛细管电泳对复杂环境 样品中痕量组分分析的应用。 1 4 固相萃取简介 1 4 1 固相萃取的基本原理 固相萃取】的原理与液液萃取相似，都包括一个化学物质在两相之间的分 配过程。但与液液萃取不同的是，在固相萃取中，化学物质是在固相和液相之 闯进行分配。而且，在固相萃取的保留步骤中，一方面，待测物在固相上应具 有比其它成分更大的亲和力；另一方面，在下一个洗脱步骤中，保留在固相上 的待测物又能用具有更大亲和力的溶剂来洗脱。固相萃取特剐适合用于水样的 处理，当水中痕量物质通过固相吸附剂萃取后，再选择合适的洗脱方式进行处 理。因此，固相萃取是一种可同时进行萃取和浓缩双重功能的有效方法。 由于在待测物、吸附剂表面的活性位置、液相以及基体之间分子间相互作 用力不同，固相萃取的保留和洗脱具有不同的机理。 1 4 2 固相萃取的优点 固相萃取是在七十年代出现的新型萃取技术，具有以下一些明显的优点： 简单、快速、配套的s p e 单元大大地缩短了分析时间；处理过的样品易于储藏 和运输，便于在不同的实验室进行质控；不易乳化；不需大量的高纯溶剂；可 供选择的吸附剂和溶剂类型很多，能提供多种实验途径；减少溶剂的使用和暴 露，保证实验安全；易于与其它仪器联用，实现在线分析。 1 4 3 固相萃取的一般操作法 固相萃取一般有四个基本步骤：固定相活化、样品上柱、淋洗和分析物洗 脱。 1 、活化 上海大学硕士学位论文 活化的目的是创造一个与样品溶剂相容的环境并除去柱内所有杂质。通常 需要两种溶剂来完成上述任务，第一种溶剂( 初溶剂) 用于净化固定相，另一种 溶剂( 终溶剂) 用于建立一个合适的固定相环境使样品分析物得到适当的保留。 2 、上样 上样步骤指的是样品加入到固相萃取柱并迫使样品溶剂通过固定相的过 程，此过程中分析物也可能连同一些样品干扰物保留在固定相上。为了保留分 析物，溶解样品的溶剂必须较弱。 3 、淋洗 分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相来洗掉不需要的样品组分，淋洗 溶剂的洗脱强度是略强于或等于上样溶剂。淋洗溶剂必须尽量地弱，在不能强 到可以洗脱任何一个分析物前提下洗掉尽量多的干扰组分。有时淋洗步骤并不 十分重要，根据具体情况可以省略。 4 、洗脱 淋洗过后，将分析物从固定相上洗脱。洗脱溶剂需认真选择，溶剂太强， 一些更强保留的非分析物组分将被洗出来；若溶剂太弱，就需要更多的洗脱液 来洗出分析物，这样固相萃取柱的浓缩功效就会削弱。收集起来的洗脱液供后 续分离检测，也可以把它浓缩后溶于另一溶剂中进样和进一步净化。 1 4 4 固相萃取的固定相 s p e 采用的固定相与液相色谱常用的固定相类型相同。主要分为正相、反 相、离子交换三种。 c n ，d i o l ，s i ，n h 2 都可作为正相的固定相。正相固定相都是极性的， 用来保留( 萃取) 极性物质。对于正相和反相来说，组分在固定相上的保留或洗 脱直接与溶剂极性有关，溶剂的极性决定溶剂的强度。在洗脱被保留组分时， 强溶剂的用量比弱溶剂小。对于正相固定相，溶剂强度随极性增加而增加。 c 1 8 ( o d s ) ， c 8 ，c 2 ，c h ，p h 都是反相固定相。用来保留( 萃取) 非极 性的分析物。对于反相固定相，溶剂强度随其非极性增加而增加。通常使用水、 甲醇、异丙醇和乙睛作为反相洗脱的溶剂。有些时候，对强保留物质也用丙酮 9 上海大学硕士学位论文 或二氯甲烷洗脱。 离子交换固定相上的行为更多地取决于溶剂的p h 值、离子强度和反离子 强度，而与溶剂强度关系不大。 1 4 5 固相萃取技术在m e k c 中应用的研究概况 传统样品预处理液液萃取过程存在着操作手续繁琐、费时，不易实现自动 化以及大多数情况下要使用大量的有毒有机溶剂等缺点。鉴于这一情况，人们 迫切希望建立简单、快速、少用或不用有毒有机溶剂及其它有害健康的试剂和 易于与各种检测手段相结合的样品富集方法。固相萃取( s p e ) 是一种基本上 满足上述要求的富集技术，操作简单、成本低廉、易于自动化，富集效率高。 s p e 是目前与毛细管电泳联用应用较多的样品前处理技术。 s p e 是在七十年代出现的一种新型萃取技术。与传统液一液萃取相比，s p e 具有以下一些明显的优点：简单、快速、易于储藏和运输、便于在不同的实验 室进行质控、不易乳化、可供选择的吸附剂和溶剂类型多、能提供多种实验途 径、减少溶剂的使用和暴露、保证实验安全等。直到八十年代中期，固相萃取 的分析应用才日益增多。近年来，各种不同吸附剂的研究己成为s p e 的一个热 点。一般来说，s p e 用于m e k c 样品处理具有富集和净化样品两个功能，固相 萃取技术通常可以使分析物得到可观的富集和减少来自于复杂样品基质的干扰 的作用。在线的固相萃取与m e k c 联用技术通常很难实现，由于样品的迸样体 积很小，缺少有效的洗脱方法。目前s p e 在m e k c 样品处理中应用较多的是离 线方法【4 5 4 叼。离线s p e 方法具有装置简单，操作条件可调控性强等特点。 固相萃取中常用的填料主要有硅胶( 包括修饰有反相固定相的硅胶) ， a 1 2 0 3 ，硅酸镁，石墨碳以及树脂等1 4 9 1 。随着分子印迹识别材料的不断合成问 世，近年来发展出许多具有高选择性的s p e 填料。这些s p e 填料是通过模板分 子、功能单体和交联剂的作用合成分子印迹高聚物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r ) 产生有化学选择性的键合位点，作为底物的分析物通过与模板分子聚 合物在形状、大小和功能基团的定位方面吻合而被识别 5 2 1 。在环境污染物 m e k c 分析中，已经报道有许多种s p e 填料应用于样品的处理1 1 】。酚类化 1 0 上海大学硕士学位论文 合物是环境水样中必需检测的一类有机污染物。但是通常使用的s p e 填料对酚 类物质仅表现出中等的选择性。而最近报道的睁环糊精键合硅胶( c d s ) 表现 出对酚类物质更佳的选择性1 s 4 - 5 6 。争环糊精具有可与客体分子形成包结络合物 的能力【5 7 1 ，基于环糊精的这种能力所制成的高选择性吸附材料已有较多应用， 并有相关的综述对其进行了总结【矧。 1 5 样品堆积技术简介 毛细管电泳在线富集技术是通过对样品、背景缓冲溶液的组成及进样程序 进行简单的调控，从而实现样品的富集，具有操作简单、成本低廉、富集倍数 高、无样品损失和污染等优点，无需对商品仪器进行改造。样品堆积方法是c e 中应用最广泛的在线富集方法之一，1 9 7 9 年e v e r a e r t si s 9 等首先阐述了带电物 质在c z e 中样品区与缓冲溶液区界面的富集行为，证实了在毛细管中富集荷电 溶质的可能性。尤其是继9 0 年代早期c h i e n 和b u r g i 6 0 - 6 2 的深入研究之后，样 品堆积富集在c z e 中获得更广泛的应用。 样品堆积是将样品溶解于低电导溶液中，并使样品溶液在高电导背景溶液 中运行。当低电导和高电导溶液同时存在于毛细管中并施以电压时，低电导区 的电场较高电导区的强，样品离子在低电导区的运动速度比在高电导区快。当 样品离子穿越样品区域和缓冲溶液区的边界时，样品离子的运动速度骤降从而 导致了样品区带长度的缩短，样品浓度也就会相应地提高，从而达到了富集的 目的。样品堆积的进样方法有压力进样和电动进样。 样品堆积富集现已经应用于阴、阳离子和混合离子的分离分析中，也被推 广到m e k c 分析中性分析物的富集。在分离分析中性化合物时由于分析物的电 泳淌度为零，所以堆积过程需要引入离子型胶束作为电泳迁移载体来实现样品 堆积富集【6 3 - 6 r l ，带电荷的环糊精作为分离富集载体的分析方法也有报道陋7 0 i ， 不过对中性分子的样品堆积富集效率通常不如对离子样品的堆积富集效率。 1 5 1 常规堆积模式( n o r m a ls t a c k i n gm o d e ，n s m ) 常规堆积模式是一种最简单的堆积模式，即将溶解在低电导介质中的样品 上海大学硕士学位论文 通过压力进样，在高电导背景缓冲溶液中运行。由于样品离子在低电导介质和 高电导介质中电泳速度的不同，分析物在样品溶液区和背景溶液区的边界处发 生骤变而聚焦浓缩。 采用压力进样时，毛细管区带电泳堆积( s t a c k i n g ) 中，原始进样长度以 ( ) 与堆积后样品区带长度( k ) 有以下关系： = 0 ( 1 r ) ( 1 ，6 ) 其中r 为样品溶液中电场场强与背景溶液中场强之比，即r = e 岛。 相应的，压力进样所造成的堆积后浓度可由下式得到： g = x r ( 1 7 ) 其中c 乙为样品堆积后浓度，c 0 为样品原始浓度。如果在施加分离电压时， 样品( s ) 区带和背景溶液( b g s ) 区带的电导率都维持恒定，r 等于b g s 区带 的电导率与s 区带电导率之商。r 值越大，检测灵敏度提高的倍数也越大。但 是在实际情况中，由于在施加分离电压时，s 区带和b g s 区带界面处溶液的扩 散和对流混和造成r 值的减小、电导率的改变和堆积样品区带的增宽口1 ，7 2 1 。扩 散和对流混和可能是由于b g s 区带和s 区带中电渗速率的差别引起的。由于样 品堆积界面的混和导致了已经堆积缩短的样品区带又再次增宽，并且在毛细管 中还产生了紊流。r 值越大，区带增宽和紊流效应越明显，限制了富集因子的提 高。 1 5 2 大体积样品堆积( l a r g ev o l u m es a m p l es t a c k i n g ，l v s s ) 当压力进样的体积大于n s m 中的最大迸样量时，则必须把样品基质排出 毛细管以确保分离效率。样品基质的排出可通过压力泵或电渗泵来实现，泵的 方向与带电溶质的电泳移动方向相反，泵的速率要低于带电溶质的电泳速率。 这种方法的局限性在于每次都只能富集带同种电荷的离子。这种方法的富集因 子对简单离子能达到1 0 0 以上。 1 2 上海大学硕士学位论文 1 s 3 场放大进样( f i e l d a m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ，f a s s ) 前两种方法都是采用压力进样，其中样品的低导基质必须尽量排出毛细管， 否则就会影响富集效果。在场放大进样方法中采用电动进样，即将溶解于低电 导介质中的样品进行电动进样。施加电压的极性由样品离子带电情况决定。这 种方法在一次进样中只能引入一种电荷的离子。如果电渗流的方向与样品离子 的电