（分析化学专业论文）基于纳米材料的生物传感技术在食品安全中的应用.pdf

i s f l l f lf l f li i f f i j f f r l l l l l f r i x i i j i j l l l ji l l l y 19 0 7 3 2 9 a n a l y t i c a la p p l i c a t i o no fb i o s e n s i n gt e c h n o l o g yb a s e d o nn a n o m a t e r i a l si nt h ef o o ds a f t y b y z h a n g y i f a n g b s ( h u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 9 ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y l n t h eg r a d u a t es c h o o l o f h u n a n u n i v e r s i t y s u p e r v i s o r s p r o f e s s o ry u r u q i n j u n e ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：缎豸日期：夕汐，年易月文e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期：夕秒7 年秒月o z , 日 ， e t 期：知fy 年石月之日 d r l 吵 狂腐 硕士学位论文 摘要 纳米材料( n a n om a t e r i a l ) 由纳米粒子所组成，是指晶粒尺寸小于1 0 0i m 的材 料。由于粒径非常小，使得其具有独特的光学、电学、磁学、化学性能和催化性 能。将纳米材料应用于生物传感技术可以大幅地提高生物传感器的相应性能。近 年来由于一系列食品原料的化学污染、畜牧业中非法添加剂的使用、基因工程技 术的应用，使食品污染导致的食源性疾病呈上升趋势，食品安全问题为全世界所 关注。本文将纳米金、量子点两种纳米材料与合适的检测手段相连，以食品安全 中常见的赭曲霉素a 、克伦特罗( 瘦肉精) 、三聚氰胺为检测对象，构建了多种 生物传感器。具体内容包括： ( 1 ) g j 建了一种基于聚硫堇纳米金复合材料固定半抗原的电化学免疫传感器 用于赭曲霉素a ( o t a ) 的检测。首先利用硫堇在玻碳电极表面沉积形成一层聚合 膜，纳米金通过静电吸附及配位作用连接到硫堇聚合膜的表面，从而使赭曲霉素a 卵清蛋白( o t a o v a ) 偶联物在电极表面的负荷量显著提高。根据间接免疫竞争的 原理，当样品中存在游离的o t a 时，它与固定于电极表面的o t a o v a 偶联物分 子竞争结合溶液中有限的小鼠抗o t a 单克隆抗体，最终结合到电极表面的抗体与 样品中的o t a 含量成反比。碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠i g g 二抗选择性地与电 极表面的o t a 单抗反应，并催化底物1 萘酚磷酸酯( 1 n p ) 水解生成1 萘酚，1 萘 酚具有电活性，在电极表面氧化产生电信号，检测下限达2 5n g m l ，从而实现了 对o t a 的定量分析。 ( 2 ) 开发了一种基于纳米金信号放大的电化学免疫传感器用于瘦肉精一克伦 特罗( c l ) 的检测。首先在金电极表面自组装1 , 6 2 - - 硫醇( h d t ) 单分子膜，然后通 过纳米金与巯基间的a u s 作用组装一层金纳米颗粒构建传感界面，从而使克伦特 罗一牛血清蛋白( c l b s a ) 偶联物在电极表面的负荷量显著提高。将样品与一定量 的小鼠抗克伦特罗单克隆抗体培育一段时间，再滴于电极表面。最终结合到电极 表面的抗体与样品中的克伦特罗含量有关。最后利用碱性磷酸酯酶标记的马抗小 鼠i g g 二抗与一抗结合后，催化底物1 _ 萘酚磷酸酯( 卜n p ) 水解，从产生电信号并 进行检测。该传感器具备操作简单、灵敏度高、特异性好等优点，检测下限达到 2 0p g m l 。 ( 3 ) 利用胸腺嘧啶( 碱基t ) 与三聚氰胺之间能形成特异性的三氢键结构， 提出了一种基于荧光量子点淬灭的生物传感技术用于三聚氰胺的检测。将标记有 氨基的碱基t 与巯基乙酸修饰的c d s e z n s 水溶性量子点偶联。当样品中存在三聚 氰胺时，三聚氰胺能与碱基t 形成特异性的三氢键结构，从而使量子点团聚而发 生荧光淬灭。当三聚氰胺浓度在5i - t m o l l 2m m o l l 范围内时，随着三聚氰胺浓度 基于纳米材料的生物传感技术在食品安全中的应用 增加，荧光强度逐渐变小，检测下限达3 9t t m o l l 。 关键词：纳米金；量子点；生物传感技术；电化学传感器；荧光淬灭传感器；赭 曲霉素a ；克伦特罗；三聚氰胺 r 1 硕士学位论文 a bs t r a c t n a n o - m a t e r i a l s ，t h e g r a i ns i z e o fw h i c ha r el e s st h a nl0 0 n i n ， a r e f o r m e db yn a n o p a r t i c l e s d u et ot h e i rs m a l ls i z e ，t h e yh a v es o m eu n i q u ec h a r a c t e r si n o p t i c s ，e l e c t r i c i t y ，m a g n e t i s m ，c h e m i s t r ya n dc a t a l y t i cp e r f o r m a n c e w i t ht h eh e l po f n a n o - m a t e r i a l si nt h ef i e l do fb i o s e n s i n gt e c h n o l o g y ，t h ep e r f o r m a n c eo fb i o s e n s o r s c o u l db eg r e a t l yi m p r o v e da c c o r d i n g l y i nr e c e n ty e a r s ，t h ec h e m i c a lc o n t a m i n a t i o no f f o o dr a wm a t e r i a l s ，t h eu s eo fi l l e g a la d d i t i v e si na n i m a lh u s b a n d r y ，a n dg e n e t i c e n g i n e e r i n gt e c h n o l o g ym a k et h e f o o dn ol o n g e rs a f e ，w h i c hr a i s et h ef o o d b o r n e d i s e a s e sc a u s e db yf o o dc o n t a m i n a t i o n t h u s ，f o o ds a f e t yi s s u e sh a v ea t t r a c t e dal o to f c o n c e r n sa r o u n dt h ew o r l d t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so nd e v e l o p i n gas e r i e so f b i o s e n s i n gt e c h n i q u e s b a s e d n a n o - p a r t i c l e s s u c ha s g o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p ) ， q u a n t u md o t s ( q d ) ，t od e t e c ts e v e r a ls m a l lm o l e c u l a rt o x i n si nf o o ds a f e t y i s s u e s i n c l u d i n go c h r a t o x i na ( o t a ) ，c l e n b u t e r o l ( c l ) t h ed e t a i l e dm e t h o d sa r e 嬲f o l l o w s ： ( 1 ) as e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rb a s e do np o l y t h i o n i n e g o l df i x i n g h a p t e nw a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fo c h r a t o x i na ( o t a ) ，ac o m m o nt o x i c c o n t a m i n a n ti nv a r i o u sk i n d so fa g r i c u l t u r a lp r o d u c t s f i r s t l y ，p o l y t h i o n i n ef i l ml a y e r w a sb u i l to ft h et h es u r f a c eo fg l a s sc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) a sap o s i t i v es u b s t r a t et o a s s e m b l eg o l dn a n o p a r t i c l e sl a y e r ，w h i c hc o u l de n h a n c et h es u r f a c el o a d i n go f o c h r a t o x i na - o v a l b u m i n ( o t a - o v a ) c o n j u g a t e sa n d i m p r o v e t h e s e n s i t i v i t y i n e l e c t r o c h e m i c a lr e a d o u t s a f t e r c o m p e t i t i o n o ft h el i m i t e da n t i - o t am o u s e m o n o c l o n a la n t i b o d yb e t w e e ni m m o b i l i z e dh a p t e na n do t aa n a l y t ei ns a m p l es o l u t i o n ， a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( a l p ) - l a b e l e d h o r s ea n t i m o u s e i m m u n o g l o b u l i ng ( i g g ) a n t i b o d yw a ss e l e c t i v e l yb o u n d o n t ot h es u r f a c eo ft h ee l e c t r o d e ，a f f o r d i n ga ni n d i c a t o r f o ro t ac o n c e n t r a t i o ni nt h es a m p l e e l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s ea r i s i n gf r o mt h e o x i d a t i o no fe n z y m a t i cp r o d u c to f1 - n a p h t h y lp h o s p h a t ew a so b s e r v e dt ob ei n v e r s e l y p r o p o r t i o n a lt ot h el o g a r i t h mo fo t a c o n c e n t r a t i o nw i t had e t e c t i o nl i m i ta sl o wa s2 5 n g m l f u r t h e r m o r e ，an e g l i g i b l em a t r i xe f f e c ta n dg o o dr e c o v e r i e sw e r eo b t a i n e di n t h ed e t e r m i n a t i o no fc o l ns a m p l e s ，e v i d e n c i n gt h ef e a s i b i l i t yo ft h ep r o p o s e dm e t h o d f o ra c c u r a t ed e t e r m i n a t i o no fo t ai nc o r ns a m p l e s ( 2 ) ac o n v e n i e n t ，s p e c i f i c ，a n dh i g h l ys e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r b a s e do ns i g n a la m p l i f i c a t i o nb yg o l dn a n o p a r t i c l ew a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e c t i o no f c l e n b u t e r o l ( c l ) 1 , 6 一h e x a n e d i t h i o lm o n o l a y e rw a sf i r s t l y s e l f - a s s e m b l e do nt h e w i t hg i v e nc o n c e n t r a t i o no fa n t i c lm o u s em o n o c l o n a la n t i b o d y ，w h i c ht h e nr e a c t e d w i t ht h ec l b s ac o n j u g a t e so nt h es u r f a c eo ft h ee l e c t r o d e s ot h ea n t i b o d yb i n d i n g t ot h ee l e c t r o d es u r f a c eh a dam a t h e m a t i c a lr e l a t i o n s h i pw i t ht h ea m o u n to fc li nt h e s a m p l e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) - l a b e l e dh o r s ea n t i m o u s ei m m u n o g l o b u l i ng ( i g o ) a n t i b o d yw a sb o u n do n t ot h es u r f a c eo ft h ee l e c t r o d ew i t ht h em o u s ea n t i b o d y ，s oa st o a r i s eae l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lf r o mt h eo x i d a t i o no fe n z y m a t i cp r o d u c to f1 - n a p h t h y l p h o s p h a t e t h ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o ri sc o n v e n i e n t ，s p e c i f i c ，a n dh i g h l y s e n s i t i v e ，w i t hd e t e c t i o nl i m i ta sl o wa s2 0p g m l ( 3 ) ac o n v e n i e n t ，s p e c i f i c ，a n ds e n s i t i v es e n s i n gt e c h n o l o g yw a sd e v e l o p e dt o d e t e r m i n a t em e l a m i n eb a s e do nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gr e s u l t e df r o mq u a n t u m d o t ( q d ) a g g r e a g t i o n ，w i t ht h ef a c tt h a to n l yt h y m i n eo fa l lt h ef o u rd n ab a s e sc o u l d h i g h l yr e c o g n i z em e l a m i n ei na q u e o u sm e d i u mb yt h ef o r mo ft r i p l eh - b o n d sw i t hi t a m i n om a r k e dt h y m i n ew a sc o n j u g a t e dw i t hm e r c a p t o a c e t i ca c i dm o d i f i e dc d s e z n s q d ，w h i c hc o u l da g g r e g a t et h eq db yf o r mt h es p e c i a lt r i p l eh - b o n d sa sl o n ga st h e s a m p l ec o n t a i n e dm e l a m i n e ，r e s u l t i n gi nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed y n a m i cl i n e a rr a n g ef o rm e l a m i n ed e t e c t i o nw a sf r o m5 l 上m o l lt o2m m o l l ，w i t had e t e c t i o n1 i m i to f3 9p m o l l k e y w o r d s ：g o l d n a n o p a r t i c l e s ；q u a n t u md o t s ；b i o s e n s i n gt e c h n o l o g y ； e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s ；f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gs e n s o r ；o c h r a t o x i n a ；c l e n b u t e r o l ；m e l a m i n e v 硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书。i 摘要i i a b s t r a c t ： 第l 章绪论l 1 1 几种重要的纳米材料及其在生物传感分析中的应用1 1 1 1 纳米金2 1 1 2 量子点4 1 2 电化学生物传感器7 1 2 1 电化学生物传感器的原理7 1 2 2 电化学生物传感器的分类和应用一8 1 3 荧光生物传感器一1 l 1 3 1 荧光d n a 传感器1 2 1 3 2 荧光免疫传感器。1 3 1 4 本研究论文的构想1 3 第2 章基于聚硫堇纳米金复合材料固定半抗原的电化学免疫传感器检测赭曲霉素a 11 ； 2 1 前言1 5 2 2 实验部分1 6 2 2 1 试剂与仪器16 2 2 2 纳米金的制备1 6 2 2 3 偶联物的制备。1 6 2 2 4 样品的制备17 2 2 5 传感界面的构建17 2 2 6 竞争免疫分析过程1 7 2 3 结果与讨论17 2 3 1 竞争免疫分析的原理1 7 2 3 2 玻碳电极表面沉积硫堇的电化学特性1 9 2 3 3 免疫传感器的电化学特性2 1 2 3 4o t a o v a 偶联物和o t a 抗体用量的优化。2 2 2 3 5 电化学免疫传感器的分析性能2 4 2 3 6 玉米样品中o t a 回收率的测定。2 5 基于纳米材料的生物传感技术在食品安全中的应用 2 4 小结2 5 第3 章基于纳米金信号放大的电化学免疫传感器检测克伦特罗2 6 3 1 前言2 6 3 2 实验部分。2 7 3 2 1 试剂和仪器2 7 3 2 2 纳米金的制备2 7 3 2 3 传感界面的构建2 7 3 2 4 竞争免疫分析过程2 8 3 3 结果和讨论2 8 3 3 1 竞争免疫分析的原理2 8 3 3 2 传感器分析过程的阻抗法表征3 0 3 3 3c l b s a 偶联物和c l 抗体用量的优化3 0 3 3 4 电化学免疫传感器的分析性能3 2 3 3 5 猪肝脏中克伦特罗回收率的测定。3 3 3 4 小结一3 3 第4 章基于量子点荧光淬灭的荧光传感器检测三聚氰胺3 4 4 1 前言3 4 4 2 实验部分3 5 4 2 1 试剂与仪器3 5 4 2 2 碱基t 与量子点偶联物的制备3 5 4 2 3 三聚氰胺的检测3 5 4 3 结果和讨论3 5 4 3 1 传感器分析过程的原理。3 5 4 3 2 缓冲液p h 值和反应时间的优化3 6 4 3 3 传感器的分析性能。3 8 4 3 4 奶粉样品中三聚氰胺回收率的测定。3 9 4 4 小结3 9 结论4 0 参考文献4 1 附录攻读硕士学位期间发表及完成的论文目录5 5 致谢。5 6 v n 硕士学位论文 第1 章绪论 随着社会经济的不断发展和人民生活水平的不断提高，人们对食品安全的关 注也越来越多。然而近年以来，一些企业和个人非法出售过期变质食品，并在食 品中添加各种非法添加剂，导致人民的健康受到严重威胁，因此新的食品现场快 速检测方法和手段变得极为迫切。生物传感技术作为检测各种物质的新方法，由 于具有如灵敏度高、选择性好、操作简单、样品需要量少、成本低廉、响应快、 可微型化等众多优点，已在化学、生物学、医学、环境监测、食品工业、医药工 业等领域展现出非常广阔的应用前景。 1 1 几种重要的纳米材料及其在生物传感分析中的应用 著名物理学家、诺贝尔化学奖获得者f e y n m a n 在2 0 世纪中期曾预言：如果控 制物体微小规模上的排列，就能使物体表现出一些奇特的性质，材料的性能也会 产生不同寻常的变化，这种材料就是现在所说的纳米材料。1 9 9 0 在美国巴尔的摩 召开的第一届国际纳米科技会议，标志着纳米技术的正式诞生。纳米技术是一门 多学科交叉的新兴学科，广泛应用于物理学、化学、材料学、生物学、医学等领 域，特别是基于纳米材料发展起来的各种分析检测方法和技术，为解决传统分析 检测方法遇到的难题提供了强有力的手段。目前，纳米技术正以惊人的速度迅猛 发展，成为全球科技研究的一大热点，人类已经实现了在单个原子、分子层次上 对物质进行探索和控制的研究工作。 纳米材料是指处于1 1 0 0 咖尺度范围内的超微颗粒及其致密的聚集体，以及 由纳米微晶所构成的材料统称，包括金属、非金属、有机、无机和生物等多种材 料。由于材料的性能与其颗粒尺寸密切相关，当材料晶粒尺寸减小到纳米级时， 就会表现出许多独特的性质，如表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量 子隧道效应、介电限域效应等等【卜3 1 。 ( 1 ) 表面效应：由于纳米微粒的表面原子数与总原子数之比随粒径的变小而急 剧增大后所引起的物理和化学性质的变化。由于表面原子数增多，原子配位不足 导致其具有较高的表面能，使得这些原子具有高的活性，极不稳定，容易与其它 原子和分子结合。 ( 2 ) 小尺寸效应：当纳米微粒的尺寸与光波的波长、德布罗意波长、超导态的 相干长度或穿透深度等物理尺寸相当时，晶体的周期性边界条件被破坏，非晶态 纳米微粒的表面附近原子密度减小，导致其光、电、磁、热、力学等性质发生显 著变化。如对光的吸收增加，并产生吸收峰的等离子共振频移等等。 基于纳米材料的生物传感技术在食品安全中的应用 ( 3 ) 量子尺寸效应：是指当粒子尺寸下降到某一值时，金属费米面附近的电子 能级由准连续变为离散的现象。如纳米半导体微粒的最高占据分子轨道( h o m o ) 和最低未被占据分子轨道( l u m o ) f l 臣级之间的能隙变宽等现象。 ( 4 ) 宏观量子隧道效应：隧道效应是基本的量子现象之一，是指当微观粒子的 总能量小于势垒高度时，该微观粒子仍能穿越势垒的现象。人们还发现一些宏观 量如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁通量及电荷等也具有隧道效应，它 们可以穿越宏观系统的势垒而产生变化，故称为宏观量子隧道效应。 ( 5 ) 介电限域效应：当纳米微粒分散在异质介质中时，由于界面引起体系介电 增强的现象。通常过渡金属氧化物和半导体纳米微粒都可以产生介电限域效应， 对光化学、光吸收及光学非线性等性质都有重要的影响。 纳米材料的这些特点和性质，使其在物理学、化学、生物学、材料学等领域 具有十分重要的研究意义和广泛的应用价值。许多功能纳米材料对生物化学分析 的发展有着重要的意义。以纳米技术为基础的生物化学分析的发展进程，在很大 程度上取决于纳米材料的发展。用于生物分析的纳米材料种类繁多，如纳米高分 子材料、碳纳米材料以及大量的无机功能纳米材料等，它们在生物样品的超灵敏 检测、各种疾病的早期诊断、靶向药物的输送、生物医学成像等众多方面取得了 显著的成效。 1 1 1 纳米金 纳米金是目前研究较早的一种纳米材料，它是由静电作用而形成的稳定的胶 体状态，故也被称作金纳米粒子和胶体金。纳米金制备流程简单可控、粒径均一、 性能稳定，具有纳米颗粒所特有的小尺寸效应、高电子密度、表面效应、介电特 性、量子效应和宏观量子隧道效应。此外，纳米金的生物相容性非常好，能与多 种生物大分子相结合，且不影响其生物活性，同时还具有独特的光学效应【4 】。随着 纳米金颗粒的粒径减小，价带中的所有电子就会表现出一种集体行为。若纳米金 颗粒的粒径与入射光波长相当，入射光电磁场诱导价带电子发生极化，产生表面 等离子体共振( s p r ) 吸收，从而产生共振吸收入射光能量。s p r 吸收产生的本质是 纳米材料的小尺寸效应。纳米金颗粒的大小、形貌及颗粒的聚集状态都与共振吸 收峰的位置有着密切关系。1 3n m 左右的球形金纳米颗粒的s p r 吸收峰一般位于 5 2 0n m 左右。纳米金的摩尔吸光系数一般高出普通有机分子几个数量级，达到 1 0 8 1 0 1 0l t o o lc m ，从而提供了样品高灵敏检测的可能性。但是，由于纳米材料带 来较高的表面自由能，金纳米颗粒的稳定性以及可加工性相对较低，因此常常需 要用通过无机离子或有机分子层来保护制得的纳米金颗粒，最常用的稳定剂是柠 檬酸根离子。生物分子在金纳米颗粒上能保持良好的生物活性，不影响它与靶分 子结合，因此纳米金已广泛用于标记抗原、抗体、d n a 及其它生物分子。纳米金 探针在生物分析领域的应用已经受到广泛关注，成为一种强有力的高效分析工具。 硕士学位论文 1 1 1 1 纳米金的制备方法 纳米金的制备方法分为物理法和化学法。物理法是利用各种物理方法将块状 固体金分散为金纳米颗粒，如真空蒸镀法、电分散法和激光消融法等。化学法包 括氧化还原法、晶种法、微波法、模板法和微乳液法等，常用的还原法有柠檬酸 还原法( 8 6 0n m ) 、白磷还原法( 5 1 2n m ) 、硼氢化钠还原法( 2 5n m ) 、乙醇超声波还 原法( 6 1 0n m ) t 5 6 】等。其中，柠檬酸钠还原法【7 8 】因其操作简单，原料价格便宜易 得而应用较多。以柠檬酸钠为还原剂，在加热煮沸的条件下柠檬酸三钠将氯金酸 还原为纳米金。在沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸钠后，溶液由淡黄色很快变为 灰色，继而转变为蓝黑色，最后逐渐变为稳定的红色。改变柠檬酸三纳的用量， 可以制备出不同粒径的胶体金。将制得的纳米金置于灭菌容器内4 保存。该法 所制得的纳米金稳定性非常好，可以保存很长时间。 1 1 1 2 纳米金在生物传感分析中的应用 纳米金与蛋白质可以较好地结合，其作用力包括静电吸附作用、疏水作用以 及a u s 共价键合等。纳米金标记核酸则是利用巯基修饰的d n a 序列在金纳米颗粒 上通过a u s 作用进行组装，形成金标d n a 探针。d n a 序列中的四种碱基在纳米金 颗粒表面也有不同程度的吸附作用【9 】，使核酸链包裹在纳米金表面。金标探针在生 物传感及生物检测等方面都有广泛的应用。 ( 1 ) 纳米金在d n a 检测中的应用。d n a 具有储存和传递信息的功能，是一种 重要的生物大分子，测定其特定顺序对于人类了解自身和疾病的诊断非常重要。 m i r k i n 等人【l o 1 3 】开拓性地用纳米金作探针检测寡聚核苷酸后，又进一步研究了影 响纳米金颗粒与d n a 结合的热力学因素，以及金纳米的光学性质和d n a 熔化温度 变化的情况，为纳米金探针检；测d n a 序列提供了理论基础。p a r k 等【1 4 j 发现标记了 纳米金的寡核苷酸发生特异性结合反应后，含有纳米金的微粒薄膜直流导电性能 发生很大的变化，据此原理检测d n a ，检测下限达至u 5 0 0f m o l 。c a i 等l l5 j 发现结合 到修饰了纳米金电极表面的寡核苷酸探针的量是普通电极上的十倍，这有利于与 互补序列发生杂交反应，从而增大了d n a 检测的电化学响应信号，达到降低检出 限的目的。z h o u 等f 1 6 】利用寡核苷酸包覆的金纳米颗粒为信号放大探针，通过靶标 分子与固定在q c m 电极上的探针形成一种探针靶金纳米粒子探针的夹心结构来 进行信号检测。由于金纳米颗粒的质量较大，得到的震荡频率的变化也较大，从 而使检测的灵敏度得到了提高。r o t h b e r g - 等 1 。7 】首先在室温下将双链d n a 解链，此 时突变型靶d n a 在短时间内解离出较多的单链d n a ，而野生型则比较稳定，后调 节合适的离子强度，加入纳米金，发现野生型靶d n a 杂交体系呈蓝紫色，而突变 型呈红色，据此可进行基因突变检测。此方法能在5r a i n 内检测到低至1 0 0f m o l 的 目标d n a 。 基于纳米材料的生物传感技术在食品安全中的应用 ( 2 ) 纳米金在免疫分析中的应用。免疫分析一直是生命科学中的一个重要课 题，利用抗原抗体的特异性结合和纳米金良好的生物相容性，纳米金在开发高灵 敏的免疫分析传感器中有着非常广泛的应用。1 9 7 1 年，f a u l k 等【1 8 】首次将纳米金颗 粒与兔抗沙门氏菌血清结合，用直接免疫细胞化学方法检测沙门氏菌的表面抗原， 开创了纳米金免疫标记技术。c h u 等【l9 】用将抗体标记在纳米金颗粒上，并用标记抗 体的纳米金捕获已固定在聚苯乙烯微井中的抗原。之后加入银染溶液，使银沉积 在纳米金的表面，随后加入酸性介质使沉积的银溶解变成银( i ) ，通过阳极溶出伏 安法检测银离子从而达到检测待测抗原物的目的。用这种方法对人免疫球蛋白，检 测限为ln g m l ，检测信号与抗原浓度在1 6 6n g m l 一2 7 2 5p g m l 之间线性相关。c u i 等【z o j 还在纳米金上同时固定二抗和辣根过氧化物酶分子，二者的摩尔比为1 ：8 ，即 单个目标分子反应即可引入多个酶分子，酶分子进一步催化底物产生电活性物质， 使电信号显著增强，对人i g g 的检测可低达4 0p g m l 。y u a n 等【2 l 】将甲胎蛋白抗体组 装于纳米金电极表面，开发出一种性能非常稳定的无试剂电流型免疫传感器。 ( 3 ) 纳米金探针在单细胞分析中的应用。细胞是生命体结构与生命活动的基 本单位。目前的细胞研究已经从单细胞整体提高到细胞内的分子水平，把细胞看 作是物质、能量、信息、遗传的结合，并从原子和分子水平上深入探索细胞的生 命活动规律。纳米金由于具有良好的稳定性、生物相容性、细胞穿透性以及易与 体内生物大分子偶联等优点，使其在细胞研究中应用十分广泛。k r e u t e r 等【2 2 】发现， 利用纳米金高电子密度的特点，纳米金标记抗体能显著增强显色效果，准确在电 子显微镜下定位抗原在细胞各处的位置分布。h u s s a i n 等【2 3 】将细胞与纳米金标记的 缩氨酸配体一起孵育，使其进入细胞内，再利用显微镜观察细胞内配体与血小板 整合素( x l l b p 3 受体在细胞内的键合作用。这种方法为未来研究正常病理过程蛋白质 受体的相互作用打下了基础。除此之外，k e n i p p 等【2 4 】还将纳米金用于单细胞中高 灵敏拉曼光谱的测定。结合在细胞中的纳米金作为表面增强拉曼散射激活纳米结 构，会使细胞中相应化学组分的拉曼信号显著增强。增强的拉曼信号使得单细胞 的拉曼检测在4 0 0 1 8 0 0c m 以内在较短的收集时间内具有1 m 的横向分辨率。收集 到的拉曼信号可以测定细胞的不同化学组成。此方法提供了一种基于纳米金的拉 曼光谱在活细胞中结构选择性的检测测细胞中化学成分的方法。j a n i n a 等【2 5 1 基于这 一原理，将修饰有靛青绿的纳米金光学探针( i c o g o l d ) 与小鼠的前列腺癌活细胞一 起孵育，使探针进入细胞内部，通过孵育前后i c g g o l d 的s e r s 信号的改变，从而 给出细胞内部的成分组成以及宿主细胞在生物环境中的结构信息。 1 1 2 量子点 量子点( q u a n t u md o t ，q d ) 又可称为半导体纳米微晶体( s e m i c o n d u c t o r n a n o c r y s t a l ) ，是由i i v i 族或者i i i - v 族原子组成的无机纳米级粒子。因其具有量子 尺寸效应和表面效应等特有的优势，量子点在发光纳米材料、光敏传感器等方面 具有广阔的应用前景。量子点纳米颗粒大小在2 8n m 之间，具有独特的性质。由 于量子点纳米颗粒具有量子尺寸效应，所以不同大小或不同材料的量子点可以产 生不同颜色的荧光【2 由2 7 1 。而且多种颜色不同的量子点可以被单一波长的光激发， 因此量子点也常被用于当今生物大分子的高通量分析。与传统的有机荧光染料相 比，量子点荧光产率高，荧光寿命长，具有较强的抗光漂白的性能，吸收光谱范 围宽，发射光谱窄而对称，斯托克斯位移大，能够有效避免由于光谱重叠而产生 的信号干扰，因而近年来被广泛用于生物学标记。 1 1 2 1 量子点的制备方法 目前制各量子点的方法可分为物理方法和化学方法。物理法包括超声粉碎法、 碾磨法、气相沉积法和机械粉碎法等。化学法又可以根据据所采用原料的不同分 为无机合成法与金属有机合成法。无机合成法主要包括溶胶法【2 弘2 9 1 、定域模板法 3 0 - 3 4 1 、反相胶束法【3 5 1 以及微波法【3 6 】等。金属有机法主要是基于有机物与无机有 机金属化合物之间的反应，是量子点合成最常用的方法之一。b a w e n d i 卯。副以 c d ( c h 3 ) 2 、s e 粉、t e 粉为原料，t o p o 为溶剂，采用快速注射法迅速将c d ( c h 3 ) 2 和 t o p e ( e = s 、s e 、t e ) 注射到无氧无水的t o p o 中，在高温( t = 3 0 0 ) 条件下，反应 物的浓度突然达到过饱和，立即发生成核作用，生成c de ( e = s 、s e 、t e ) 系列纳米 晶经过缓慢的熟化过程和退火处理，再进行尺寸选择性沉降和分离，得到表面 被t o p o 修饰的高质量c d e 系列量子点。p e n g 等【3 9 4 2 1 ，报道了用c d o 代替c d ( c h 3 ) 2 ， 采用己基膦酸( h p a ) 或十四烷基膦酸( t d p a ) t o p o ，改进了量子点制备条件，使量 子点的制备安全化、简单化。金属有机法操作简单，成本低，表面电荷和表面性 质可控，可大批量制备，容易引入各种官能团( 如氨基、羧基等常用基团) 。 为了提高量子点的水溶性，引入能与生物分子偶联的功能基团，常常对其表 面进行功能化修饰。一般主要采用硫酚基团及巯基类化合物【4 孓4 6 】对量子点进行修 饰。这些修饰剂通过氢键和粒子表面的阳离子结合，使其从疏水性转变成亲水性， 这样修饰剂分子与阴离子对溶液中阳离子的竞争使得粒子一经形成便被修饰剂分 子保护起来，它们紧密地结合在颗粒表面，防止了胶体粒子间的碰撞，减少了量 子点的团聚。另一端的功能基团( 如羧基、胺基、巯基等) 则可通过不同的方式 与生物分子偶联，使其可直接结合各种生物分子，更好地应用于生物分析以及医 学领域。 1 1 2 2 量子点在