（分析化学专业论文）基于竞争机制触发信号放大的核酸适体传感器研究.pdf

硕j j 学位论文 摘要 生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系 中进行在线连续监测等优点，在化学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事 等领域有重要的应用价值。核酸适体由于具有与目标结合的高特异性和强亲和力， 以及生物活性稳定，易于合成和保存等优点而成为一种极富应用潜力的识别探针， 为生物传感器的研究提供了一个新的平台。本论文针对目前构建检测蛋白质传感 器界面的焦点和难点问题，结合本实验室的优势，利用目标蛋白质引起两种竞争 机制的改变触发信号放大，发展了几种用于蛋白质检测的特异性好且灵敏度高的 核酸适体传感器构建方法。主要工作如下： 在第二章中，我们利用适体探针、互补序列和挂锁探针三者之间的竞争反应 提出了一种基于核酸适体特异性识别目标物导致滚环扩增放大反应，用以电化学 检测p d g f b b 的可再生适体识别系统。当新设计的适体序列与目标蛋白质发生 特异性结合时，促发了由一互补d n a 序列、线形挂锁探针、和引物探针引发的 滚环扩增反应。本适体识别系统巧妙地把多个功能元件整合为一个信号检测系统： 独特的电化学检测技术、引人注目的滚环扩增放大反应、电极表面可逆的d n a 杂交以及理想的适体目标物的识别体系。基于滚环扩增的适体识别系统不仅展现 了优越的分析性能，而且克服了传统适体传感器的局限性( 例如：对信号目标物与 适体特异性结合力的依赖，或对拥有两个或更多识别位点的目标序列夹心分析的 要求) 。回收实验证实了本实验方案的可行性。据此，本适体识别体系在蛋白质或 其它分析物的研究中展现了良好的应用前景。 第三章，我们在第二章的基础上将连接滚环信号放大与分子信标降低背景相 结合发展了一种应用于蛋白质均相检测的新方法。连接滚环信号放大同样由竞争 反应触发。有目标蛋白存在时，适体探针与目标蛋白特异性结合形成适体探针分 析物复合物，使得适体探针发生末端链置换。原先与适体探针相结合的互补序列 被释放，从而与挂锁探针杂交。在d n a 连接酶的作用下，挂锁探针被进一步环化 并在p h i2 9d n a 聚合酶的作用下通过滚环放大反应进行扩增。其产物包含成千上 万个可以和分子信标检测探针互补杂交的重复序列。在不含目标蛋白时，适体探 针与互补序列杂交形成适体探针互补序列的二元复合物，这样互补序列就不能与 挂锁探针杂交从而不能进行连接滚环放大反应。以p d g f b b 为模型分析物，可以 检测到1 3 6 a m o l 的蛋白质分子。而且，该方法只需根据目标蛋白和其适体序列的不 同设计不同的互补序列和挂锁探针就可以实现对其他蛋白质的检测。 在第四章中，我们提出一种新的纳米金团聚机理，即发夹型核酸适体粘性末 l i 基于竞争机制触发信号放大的核睃适体传感器研究 端匹配修饰诱导纳米金组装，从而降低胶体稳定性，加入较高浓度的盐引起团聚。 当溶液中存在目标分子i g e 时，适体稳定的发夹构型显著抑制纳米金组装。鉴于此， 我们开发了一种以i g e 为分析模型的基于纳米金稳定性增强的均相比色分析方法。 与目标l g 亡结合后，核酸适体构象发生变化，空间位阻增大，修饰到纳米金表面使 颗粒稳定性增强，呈分散状态，据此可用于i g e 的分析测定。与现有i g e 检测方法 相比较，该方法灵敏度高，所需仪器设备简便，可通过目视观察颜色变化或紫外 可见分光光度计监测吸光度的变化。这种发夹型核酸适体衍生纳米金的组装行为 在生物传感技术中的成功应用有助于加深理解核酸构象变换对纳米金性能的影 响，同时也为设计新颖的信号探针以及开发性能优良的比色检测技术提供新思路。 关键词：竞争机制；构型转换；滚环放大；纳米金团聚；核酸适体传感器 i i i 硕上学位论文 a b s t r a c t b i o s e n s o r sh a v ev a l u a b l ea p p l i c a t i o n si nc h e m i s t r y , b i o m e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a l p r o t e c t i o n ，f o o di n d u s t r y , m e d i c i n ea n dm i l i t a r ya f f a i r sb e c a u s eo fi t sg o o ds e l e c t i v i t y , h i g hs e n s i t i v i t y , f a s tr e s p o n s e ，l o wc o s ta n dc o n t i n u o u so n - l i n ed e t e c t i o ni nc o m p l e x s y s t e m a p t a m e r sh a v eb e c o m eh i g h l yp r o m i s i n gr e c o g n i t i o np r o b e sd u et ot h eh i g h s p e c i f i c i t y , h i g hb i n d i n ga f f i n i t y , t h es t a b l eb i o a c t i v i t y , a n dt h ee a s ys y s t h e s i sa n d s t o r a g e a p t a m e r sh a v ep r o v i d e da l li n t e r e s t i n ga l t e r n a t i v et ob i o c h e m i c a la n a l y s i s a n db i o s e n s o r s i nt h i sp a p e r , i no r d e rt os o l v et h ef o c u sa n dd i f f i c u l tp r o b l e m si n b u i l d i n gi n t e r f a c e so fs e n s o r sf o rc u r r e n td e t e c t i o no fp r o t e i n s ，w ec o m b i n e dw i t ht h e a d v a n t a g e so fo u rl a b o r a t o r ya n dm a d eu s eo ft h ec o m p e t i t i o nr e a c t i o na l o n et a r g e t p r o t e i n sc o m p l e m e n td n a a n da p t a m e r ，w h i c hc a nt r i g g e rs i g n a la m p l i f i c a t i o n ( e g r c a ) w ed e v e l o p e ds e v e r a lh i g hs p e c i f i t ya n ds e n s i t i v i t y b i o s e n s o r sc o n s t r u c t i o n m e t h o d sf o rt h ed e t e c t i o no fp r o t e i n sa n ds m a l lm o l e c u l e s m a i nw o r k sa r ea sf o l l o w s ： i nc h a p t e rt w o ，ar e u s a b l ea p t a m e r i cr e c o g n i t i o ns y s t e mw a sd e s c r i b e df o rt h e e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no fp r o t e i np d g f b bb a s e do nt h et a r g e tb i n d i n g - i n d u c e d r o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n ( r c a ) ac o m p l e m e n t a r yd n a ( c d n a ) ，l i n e a rp a d l o c k p r o b e a n dp r i m e r p r o b ew e r eu t i l i z e dt oi n t r o d u c ear c ap r o c e s si n t ot h e a p t a m e r - t a r g e tb i n d i n g e v e n tw h i l ean e w l yd e s i g n e da p t a m e rp r o b ew a su s e dt o r e c o g n i z et h et a r g e tp r o t e i n t o w a r d st h i sg o a l ，t h i sa d a p t e da p t a m e rp r o b ew a s d e s i g n e dv i al e n g t h e n i n ga no r i g i n a la p t a m e rs e q u e n c eb yt h ec o m p l e m e n t t oc d n a a n de x t e n d i n gt h eo u t e rh e l i xo ft h r e e - w a yju n c t i o n t h ea p t a m e r i cs e n s i n gs y s t e m f a c i l i t a t e st h ei n t e g r a t i o no fm u l t i p l ef u n c t i o n a le l e m e n t si n t oas i g n a l i n gs c h e m e ：t h e u n i q u e e l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e ，a t t r a c t i v e r c ap r o c e s s ，r e v e r s i b l ed n a h y b r i d i z a t i o no na ne l e c t r o d es u r f a c ea n dd e s i r a b l ea p t a m e r i ct a r g e tr e c o g n i t i o n t h i s r c a b a s e de l e c t r o c h e m i c a lr e c o g n i t i o ns y s t e mn o to n l ye x h i b i t st h ee x c e l l e n t p e r f o r m a n c e ，b u t a l s oo v e r c o m e st h el i m i t a t i o n sa s s o c i a t e dw i t h c o n v e n t i o n a l a p t a m e r i cb i o s e n s o r s ( e g d e p e n d e n c eo fs i g n a l i n gt a r g e tb i n d i n go ns p e c i f i ca p t a m e r s e q u e n c ea n dr e q u i r e m e n to fs a n d w i c ha s s a y sf o rt w oo rm o r eb i n d i n gs i t e sp e rt a r g e t m o l e c u l e ) t h er e c o v e r yt e s td e m o n s t r a t e dt h ef e a s i b i l i t yo ft h ed e s i g n e ds e n s i n g s c h e m ef o rt a r g e t p r o t e i na s s a y g i v e n a t t r a c t i v e c h a r a c t e r i s t i c s ，t h i sa p t a m e r i e r e c o g n i t i o np l a t f o r mi se x p e c t e dt ob eac a n d i d a t ef o rt h ed e t e c t i o no fp r o t e i n sa n d o t h e rl i g a n d so fi n t e r e s ti nb o t hf u n d a m e n t a la n da p p l i e dr e s e a r c h b a s e do nc h a p t e rt w o ，w ee x p l o r ean e wm e t h o df o rp r o t e i nd e t e c t i o ni nc h a p t e r t h r e e ，w h i c hc o m b i n e ds i g n a la m p l if i c a t i o no ft h el - r c as y s t e ma n db a c k g r o u n d i v 基于竞争机制触发信号放人的核酸适体传感器研究 e l i m i n a t i o no fm o l e c u l a r b e a c o n t h es t r a t e g yi sd e p e n d e do nt h ec o m p e t i t i o nr e a c t i o n b e t w e e nt a r g e tp r o t e i n ，a p t a m e rp r o b ea n dac o m p l e m e n t a r ys i n g l e - s t r a n dd n a ( t h e c d n a ) p e r f e c t l ym a t c h e dw i t ht h ea p t a m e rp r o b e t h ep r e s e n c e so ft a r g e tp r o t e i ni n t h ea s s a ys y s t e mm a d et h ea p t a m e rp r o b eb i n ds p e c i f i c a l l yw i t ht h et a r g e tp r o t e i nt o f o r ma p t a m e rp r o b e a n a l y t ec o m p l e xa n dt r i g g e r e dt h ee n do fa p t a m e rs t r a n dd i s p l a c e w i t hi t s e l f , t h a tm a d et h ec d n ar e l e a s e df r o ma p t a m e ra n da l l o w e dt h ec d n at o h y b r i d i z ew i t ht h ep a d l o c kp r o b e w i t ht h ea s s i s t a n c eo fd n al i g a s e ，t h ep a d l o c k p r o b ec o u l db ec i r c u l a r i s e da n ds u b s e q u e n t l yb ea m p l i f i e db yr c ar e a c t i o nw i t hp h i 2 9d n a p o l y m e r a s e t h er c ap r o d u c t sc o n t a i n e dt h o u s a n d so fr e p e a t e ds e q u e n c e s w h i c hc o u l dh y b r i d i z ew i t ht h em o l e c u l a rb e a c o n ( t h ed e t e c t i o np r o b e ) b yc o n t r a r i e s ， i nt h ea b s e n c eo ft a r g e tp r o t e i n ，t h ea p t a m e rp r o b eh y b r i d i z e dw i t ht h ec d n at of o r m a p t a m e rp r o b e c d n ad u p l e x ，w h i c hh i n d e r e dt h eb i n d i n go fc d n aa n dt h ep a d l o c k p r o b ea n dr e s u l t e di nt h ef a i l u r eo fl r c ar e a c t i o n u s i n gp l a t e l e t d e r i v e dg r o w t h f a c t o rb b ( p d g f - b b ) a st h em o d e la n a l y t e ，a sl o wa s1 3 6a m o lo fp r o t e i nm o l e c u l e s c o u l db ed e t e c t e d t h ep r o p o s e ds t r a t e g yi su n i v e r s a ls i n c et h es e q u e n c e so fa p t a m e r p r o b e ，c d n a ，a n dt h ep a d l o c kp r o b ec o u l db ee a s i l yd e s i g n e dt oa d a p tf o rt h e a p t a m e r b a s e dd e t e c t i o no f o t h e rp r o t e i n sw i t h o u to t h e rs t r i c tc o n d i t i o n s i nc h a p t e rf o u r , an e ww o r k i n gm e c h a n i s m ，h a i r p i ns t i c k y e n dp a i r i n g i n d u c e d g n pa s s e m b l y , i si n t r o d u c e do nt h eb a s i so ft h eu n i q u ei n s t a b i l i t yo fa p t a m e r - m o d i f i e d n a n o p a r t i c l e s t h es a l t - i n d u c e da g g r e g a t i o no fo l i g o n u c l e o t i d e - m o d i f i e dg n p sc a n r e a d i l yo c c u rw h i l ea d d i t i o no ft a r g e tm o l e c u l e sf a v o r st h ef o r m a t i o no fh a i r p i n s t r u c t u r ea n di n h i b i t ss u b s t a n t i a l l yt h en a n o p a r t i c l ea s s e m b l y a l o n gt h i sl i n e ，w e d e v e l o p e dap r o o f - o f - c o n c e p tc o l o r i m e t r i ch o m o g e n e o u sa s s a yu s i n gi m m u n o g l o b u l i n e ( i g e ) 嬲a n a l y t em o d e l v i a t r a n s f o r m i n gc o m m o n l yd e s i g n e d “l i g h t - d o w n c o l o r i m e t r i cb i o s e n s o r i n t 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c t u r e s w i t c h i n ga n do p e nan e ww a yt od e s i g ns i g n a l i n gp r o b e sa n dd e v e l o pc o l o r i m e t r i c a s s a ys c h e m e s k e yw o r d s ：c o m p e t i t i v em e c h a n i s m ；t r u c t u r e s w i t c h i n g ；r o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n ； a g g r e g a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e s ；a p t a s e n s o r s v 硕i j 学位论文 第1 章绪论 化学作为一门社会迫切需要的实用基础学科，已日益渗透到人们生活的各 个方面。分析化学是化学学科的一个重要分支。随着生命科学的发展，人们对生 命现象的探讨与认识不只是停留在整体、组织、器官或细胞水平上，而且要探讨 生命物质的结构与功能，因此，生命科学在生命过程化学、生物工程、生物医学 等领域对分析化学提出了新的挑战和要求。生命化学分析已经成为分析化学中最 活跃的研究领域。目前主要集中在核酸、蛋白质、多肽等生物大分子、生物药物、 超微量、超痕量生物活性物质、活体分析及其在信号传导中的作用等各方面的分 析研究。近年来，新的分析手段和仪器不断涌现，推动了生命分析的发展，生 物传感器便是一个很好的例子。 1 1 生物传感器概述 生物传感器是一种将生物敏化物质与各种基础传感器件相结合而构成的检测 装置。由于其具有灵敏度高、选择性和稳定性好、价格低廉、能在复杂的体系中 进行快速在线连续监测等特点，因此它能推广用于基础研究、生物、临床医学、 农业和畜牧兽医、材料与化学、军事、过程控制和环保等领域1 2 击】。 生物传感器的应用领域广阔，品种也十分繁多。但生物传感器一般都包括两 个主要组成部分：一部分是生物分子识别元件或称感受器，是具有分子识别能力 的生物活性物质( 如酶、抗体、核酸、细胞、细胞器、组织切片、微生物等) ：另 一部分是信号转换器，称基础电极或内敏感器，主要有电化学电极( 电位、电流 的洲量) 、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电右英晶体皮表面等离子 共振器件等。生物传感器的工作原理主要取决于待测物与分子识别元件之间的相 互作用，当待测物与通过特殊技术固定在换能器内( 或表面) 的具有分子识别作用 的生物活性因子作用时，产生电化学、光学、热学、压电学等响应信号被换能器 捕捉，其大小与分析物含量或浓度存在定量关系，从而实现对待测物质的定量检 测( 见图1 1 ) 。分子识别元件是生物传感器的关键部件。随着新的识别元件的开 发与发展，从2 0 世纪6 0 年代，c l a r k 等最初提出酶电极的设想【7j ，先后经历了固 定生物成分的非活性基质膜( 透析膜或反应膜) 的第一代生物传感器，以及将生 物成分直接吸附或共价结合到换能器的表面，不需要非活性的基质膜的第二代生 物传感器，最后发展到将生物组分固定在电子元件上，直接敏感和放大界面物质 的变化，从而把生物识别元件和信号的转换处理结合在一起的第三代生物传感器。 当今的生物传感技术已日新月异。近年来发展的核酸适体作为新的生物识别元件， 又为生物传感技术的发展提供了新的契机。 基于竞争机制触发信n 放人的核酸适体传感器研究 图1 1 生物传感器工作原理示意图 1 2 核酸适体在生物传感器中的应用 核酸适体( 适配子，又名适体，a p t a m e r ) 源于拉丁语a p t u s ，且 j t of i t ，意为“适 合”。它本质上是可与靶物质分子高特异性、高亲合力结合的单链寡核苷酸片段， 可以是r n a ，也可以是d n a 序列。s z o s t a k 8 】与g o l d t 9 j 两个课题研究组于19 9 0 年首 次利用“指数富集的配体系统进化”( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f l i g a n d sb ye x p o n e n t i a l e n r i c h m e n t ，s e l e x ) 技术成功筛选到噬菌体t 4d n a 聚合酶的r n a 型适体。经过近 三十年的发展，s e l e x 技术不断完善，已经筛选出对小分子、无机离子、多肽、 蛋白质，药物甚至对整个细胞均有良好识别能力的众多适体。这些适体不仅具有 对靶物质分子的高亲和力和高特异性识别能力，而且具有分子量小、结构简单、 易合成、可进行连接性修饰、反应速度快、可反复使用和长期保存等优点。它们 的出现及其相关研究的迅速发展【1 0 - 1 3 1 ，使得以核酸适体为识别元件的生物传感器 发挥着越来越重要的作用。 1 2 1 核酸适体结合靶物质的构型变化 核酸适体是一段通过s e l e x 技术筛选出来的核酸单链。核酸适体一级结构常 具有以下共同特点：多数核酸适体均含有小段能自身互补的序列，可以在中段， 可以在末端；核酸适体上常带有富含嘌呤的环，常为嘌呤嘌呤排列( 包括碱基错 配、碱基三聚体和碱基平台，这些常作为外来靶序列的结合位点；大多数核酸适 体上都可观察到g g 错配或g a 错配。这些错配的环与正常的双螺旋碱基对之间 的堆积处产生一个转折点，通常与靶物质结合后导致环的关闭，引起构型的变化。 核酸适体与靶物质结合自身通常会发生适应性折叠形成一些稳定的二级结 构，如茎环( s t e m 1 0 0 p ) 、假结( p s e u d ok n o t ) 、凸环( b u l g e ) 、g 一四联体( g q u a r t e t ) 、 口袋( p o c k e t ) 、鼓包( b u l g e ) 等结构。这些结构通过范德华力、氢键作用、静电 作用、形状匹配和“假碱基对 的堆积作用等相互作用l l4 1 ，实现对靶物质的高特 异性识别与结合。在多数的核酸适体靶物质复合物中，堆积作用扮演一个关键角 色，其次是氢键作用。如分子的侧链进入核酸分子折叠部位的深处，与核酸的碱 基形成较强的氢键是核酸适体识别精氨酸的重要原因【l 引。形状匹配和静电作用是 硕士学位论文 核酸适体能特异识别氨基葡糖苷的主要原因【l6 1 。又如凝血酶的核酸适体通过四元 g 一平面与凝血酶侧链上带正电荷的a r 9 1 2 6 、l y s 2 3 6 、l y s 2 4 0 和a r 9 9 3 之间的静电作 用力，实现对凝血酶分子的特异性识别。靶物质的芳香环部位与核酸分子的碱基 平面平行，并有重叠形成“假碱基对”的堆积。如茶碱分子中的芳香环能与其核 酸适体分子里的碱基重叠，但茶碱分子7 n 上的h 被甲基取代后，这种平行关系被 破坏。核酸适体对茶碱的亲和力比其他黄嘌呤类似物咖啡因与可可碱高一万倍【1 7 j 。 而常规的茶碱单克隆抗体检测茶碱与咖啡因时有明显的交叉反应。 j ，o o 、 龟a p t a m e r w s m a l lm o l e c u l et a r g e t 害 m a c r o m o l e c u l et a r g e t a n t i b o d y abcd 图i 2 核酸适体与靶物质的结合模式a 小分子靶物质结合到核酸适体的立体构象袋中；b 单个活性位点的结合模式( 双分子复合物) ；c 两个活性位点结合两条核酸适体的结合模式 ( 夹心型复合物) ；d 两个活性位点结合一条核酸适体和一个抗体的结合模式( 夹心型复合物) 靶物质分子中一个识别位点常常只对应一条特定序列的核酸适体，当靶物质 分子具有不同的识别位点时，则对应多个核酸适体。因而，核酸适体与靶物质的 结合方式通常可分为双分子复合物与夹心型复合物两种形式( 图1 2 ) 。对于小分 子靶物质，核酸适体常通过范德华力、氢键作用、静电作用等能将其包埋于特定 的立体构象袋中，形成稳定的双分子复合物( 图1 2 a ) 。例如，可卡因核酸适体 通过三路交叉绑定袋与可卡因发生特异性作用，完成对可卡因的特异性识别【l 引。 对于结构复杂的大分子靶物质，由于存在着堆垛效应、形态互补、静电作用与氢 键连接等各种作用力，靶物质分子含有一个连接适体的活性位点时易形成双分子 复合物( 图1 2 b ) ，含有两个连接活性位点时易形成夹心型复合物( 图1 2 cd ) 。 如果靶物质分子是双分子聚合体，两个识别位点性质相同，那么该靶物质分子可 以特异性地结合两个相同序列的核酸适体，例如，血小板生长因子p d g f b b ；当 靶物质分子两个识别位点性质不同时，可以特异性地结合两个不同序列的核酸适 基于竞争机制触发信号放大的核酸适体传感器研究 体，例如凝血酶。另外，当只有一条适体与靶物质分子结合时，使用相应的抗体 也可能获得含三元不同分子的夹心型结构复合物【1 3 】( 图1 3 d ) 。尽管靶物质种类 繁多，核酸适体与靶物质均采用以上几种结合模式。 基于核酸适体的生物传感器的研究，实验方案设计常常是基于核酸适体特殊 的一级结构，二级结构，与靶物质的结合模型以及结合前后构型的变化，并将这 种变化转化为可识别的信号，从而实现对靶物质的检测分析。 1 2 2 核酸适体电化学传感器的研究现状 电化学传感器以电化学电极作为换能器，将检测到的生物反应信号转化为电 信号。相对于光化学传感器，电化学传感器的换能设备比较简单，不需要大型仪 器，因而利于设计成轻便易携带的小器件。电化学传感器研究起步早，技术相对 成熟，现已在医疗保健、食品工业、农业、环境等多个领域研制出商品化的电化 学传感器l l9 j ( 图1 3 ) 。 c y r a n o s e3 2 0 “电子鼻” 小型血糖测试仪 图1 3 商品化的电化学传感器。图片来源h t t p ：w w w i m p o r t n e t c n p r o d u c t 7 a 2 0 8 b 8 9 4 h t m l ； h t t p ：w w w y i j i a w a n g n e t c 2 c t a 0 5 0 0 0 2 7 6 8 4 9 2 7 d d f s 0 3 a s c 5 d a d 8 5 0 2 9 b g c l 6 3 a b 0 4 h t m l 核酸适体由于具有靶目标分子范围广，易于体外合成及修饰，分子量小，特 别是其对靶物质具有高特异性和高亲和力识别作用等优点，随着s e l e x 技术成熟 与发展以及现代分析技术和新的分析试剂的应用，核酸适体越来越受到研究工作 者的关注。将核酸适体应用于构建电化学传感器，通常称之为e a bs e n s o r ( e l e c t r o c h e m i c a la p t a m e r b a s e ds e n s o r ，基于核酸适体的电化学传感器) 。核酸适体具 有特殊的一级结构和二级结构，与靶分子特异高效结合构型会变化，以不同的结 合模式与靶分子形成稳定的双分子或夹心型复合物。下面对基于核酸适体构型转 换设计的核酸适体电化学传感器的研究现状作简单概述。 1 2 2 1 单一探针构型变化的电化学适体传感器 对于e a b 传感器，最简单的是将核酸适体一端固定于传感界面，另一端修饰 电活性物质( 二茂铁，亚甲基蓝等) ，利用核酸适体结合靶物质前后构型变化导致 硕士学位论文 电活性物质靠近电极表面的程度不同设计的传感器。l a i 等【2 0 】设计的传感器在没 有靶物质存在时，核酸适体末端修饰的亚甲基蓝离电极表面较远，当与靶物质结 合后，核酸适体发生了构象转变，形成如图1 6 a 所示结构，使得亚甲基蓝靠近电 极表面，从而检测到较强的峰电流，实现血清中的p d g f 的直接检测。x i a o 等【2 1 l 用相反的原理设计了一种e a b 传感器用于检测血清中的凝血酶( 图1 4 b ) 。这种 基于单一探针构型变化的传感器是根据所检测目标物相应的核酸适体刚性结构特 征来进行设计，该检测方法只采用了适体探针一条d n a 链，设计非常简单易行， 但电化学活性物质被修饰在适体末端，往往易产生较高的背景。 图1 4 几种基于单一探针构型变化的电化学核酸适体传感器 另外有一类单一探针构型变化的电化学适体传感器。固定于传感界面上的核 酸适体末端并未修饰电活性物，而是利用其靶物质结合，引起传感界面理化性质 ( 阻抗，电荷) 发生变化。基于这种原理，r a d i t l 2 】构建出用于凝血酶检测的可 再生阻抗型适体传感器( a p t a s e n s o r ) 。m a r e e l a t 2 2 l 等利用目标蛋白与核酸适体结合 前后引起的电荷差异设计了传感器( 图1 4 c ) 。w u 等【2 3 】通过向标准的核酸适体序 列引入一段茎状片段及空间结构片段，目标物质的结合不但形成了介电生物层， 基于竞争机制触发信号放大的核酸适体传感器研究 而且电子传递的距离发生极大的变化，不用任何放大试剂就可实现对目标蛋白质 的高灵敏检测( 图1 4 d ) 。虽然这类传感器设计方案简单，检测操作方便，然而， 靶物质小分子的结合并不能使传感界面电化学性质发生足够的变化，即使靶物质 是大分子，界面性质的变化程度也与靶物质本身的荷电性质以及靶物质对溶液中 电化学活性指示剂有无明显的排斥作用相关。因而，这种核酸适体传感器的报道 不多。 图1 5 几种基于多条探针的电化学核酸适体传感器 1 2 2 2 多条探针的电化学适体传感器 为降低背景电流，可以通过引入额外的互补序列来设计传感器。如w u 等1 2 4 j 将修饰了二茂铁的腺苷适体探针与固定在金电极表面的捕获探针互补杂交。引入 靶物质腺苷后，腺苷与互补序列竞争适体探针，适体探针与腺苷特异性结合而整 个脱离电极表面而导致可检测的电流变小( 图1 5 a ) 。z h a n g 等【25 j 在两条适配子 末端( 序列相同) 均标记上电化学活性分子，二茂铁，利用邻位效应机理，只有 靶物质同时结合两条适配子时才有响应电流，构建了一种用于p d g f b b 的定量 检测传感器( 图1 5 b ) 。这些设计方案中的额外互补序列将信号探针引入到界面， 有效地降低了背景。为了进一步改善检测系统的性能，不少研究人员将信号放大 体系运用到传感器设计当中。常见的信号放大技术有p c r 技术【2 6 1 与r c a 技术【2 7 l ( 如图1 5 c 所示) ，标记酶催化底物放大( 如h r p 、g o d 、p a l ) t 2 黏3 0 】，衍生无机 硕 ：学位论文 纳米粒子( 纳米金、纳米银、铂纳米粒子、量子点、磁性纳米颗粒等) 【3 卜33 1 ，金属 纳米颗粒催化放大【3 4 j 以及各种放大技术联用等。这种传感界面的构建常以夹心型 模型构建，将第一条核酸适配子固定在电极界面上，信号放大物质往往修饰在第 二条适配子上。n u m n u a m 等1 35 j 利用这种方案，构建了电位型传感界面( 如图1 5 d 所示) 。通过引入信号放大技术，大大提高了传感器的灵敏度，降低了检测下限。 如p o l s k y 等1 3 4 1 提出了一种酶标记与铂纳米粒子标记核酸适体的技术，对进行凝血 酶的检测，检出限为lxl0 一m ，然而，灵敏度相对提高了近8 0 倍。由此可见， 虽然核酸适配子在电化学生物检测中的应用研究历史较短，但是十多年来在传感 器的设计、特性、灵敏度、稳定性以及实际应用方面已经取得了显著的发展，充 分显示了核酸适配子在基础研究中的优势与疾病诊断应用中的潜力，开辟了电化 学与分子生物学的新领域，为生命科学的研究提供了一种全新的方法，对临床医 学诊断和药物筛选工作的进行具有深远的影响。 1 3 金纳米颗粒聚集的光度技术 纳米科技的产生和发展为纳米材料在生物分析中的应用开辟了新的领域。其 中，纳米金由于具有独特的物化性质，如表面化学惰性、易于修饰、高的消光系 数( 比普通有机染料的要高3 5 个数量级) 、良好的生物相容性等【3 6 。8 1 ，更是引起 广大科研工作者的强烈兴趣。金纳米颗粒( g n p s ) 除一般纳米粒子的特性外，还 具有特殊的氧化还原能力，在上一节中我们介绍了g n p s 作为信号放大载体的相关 研究；g n p s 可与氨基发生非共价的静电吸附，或与巯基形成强的a u s 共价键，从 而使得金纳米粒子易于修饰上生物活性分子，以形成生物体系检测的探针；g n p s 具有特殊的光化学性质，其水溶液对应的特异性吸光系数值比普通的有机发色基 团高出3 一。5 个数量级，因此极低浓度的g n p s 溶液( 1o 母m ) 可以用肉眼直接观测； 同时，g n p s 还具有独特的生物兼容性，一般酶在g n p s 上可保留一定的生物活性。 g n p s 按粒子尺寸和聚集情况，可显示不同的颜色。单个纳米颗粒尺寸和颗 粒间组装形式的变化，使金纳米颗粒溶液表现出不同的整体特征。当特定波长的 可见光照射金溶胶时，纳米金表面电子偶合振动，引起表面等离子体共振吸收而 呈现出与颗粒距离相关的光学性质【3 吼4 0 1 。分散的纳米金颗粒相距较远，溶液呈现 红色。当颗粒间距离小于纳米金本身的尺寸时，由于相邻颗粒的电子偶合及偶极 矩作用，溶液由红色变为蓝色【4 1 1 。生物分子可参与到g n p s 的聚集和组装过程中， 从而干扰g n p s 的原始组装方式。通过g n p s 溶液最终的物理状态( 如颜色、吸 光度等) 可得到参与组装的生物分子的“质、量 特征，达到检测的目的，由此， 基于g n p s 聚集的光度技术得到迅速发展。 在基于g n p s 聚集的光度技术中，以在d n a 识别与检测中的应用最为广泛。 一般检测多核苷酸序列的方法是通过人工设计的含有信息片段的核苷酸序列与靶 基于竞争机制触发信号放大的核酸适体传感器研究 d n a 的杂交情况来读取的。根据设计的核苷酸序列能否与靶核苷酸相匹配，即杂 交后引起信息片段的变化来检出靶序列，变色过程见图1 6 。因此，可以运用基于 g n p s 聚集的紫外分光光度技术来进行d n a 的检测和识别。m i r k i n 等人【4 2 , 4 3 报导 了目标链与金标探针杂交引起纳米金交联团聚的比色法检测d n a ，开创了g n p s 用于生物检测的新领域。g n p s 经巯基修饰的短链d n a 修饰成为编码探针，溶液 中加入目标互补d n a 后，纳米颗粒发生有序、可逆的聚集反应。系统在没有优化 的情况下能检测1 0f m