（生物化学与分子生物学专业论文）新型酿酒酵母整合载体的构建及构建方法研究.pdf

中文摘要 本研究主要探讨一种酵母菌染色体定点整合载体的构建方法及其实现染色 体定点整合的可行性。参照s g d 数据库提供的酵母菌全基因组序列信息，选取 4 号染色体上基因h e m l 3 上游7 5 02 1 5 0 b p 处无基因活性的d n a 序列作为基 因定点整合的靶位点。在这14 0 0 b p 的d n a 序列中选取毫不重合的两部分，大 小分别为7 4 4 b p 和6 0 2 b p ，作为整合载体的两个同源臂h o m l 和h o m 2 。 载体p u c l8 - i n t 4 是本研究需要构建的目的载体，它的构建基础是本实验室 已经构建的载体p u c l 8 - r y u r 。p u c l 8 i n t 4 载体的构建是将两段同源臂h o m l 和h o m 2 按照其在染色体上的位置和方向分别取代p u c i8 - r y u r 上的两段r e p e a t 序列。由此，构建成了p u c l 8 i n t 4 载体。 本试验使用酵母菌乙醇脱氢酶l ( a d h l ) 基因作为验证p u c l 8 - i n t 4 载体 实现基因定点整合的验证基因。用p c r 方法扩增得到a d h l 基因序列，利用限 制性内切酶位点，使其连接在p u c l 8 烈t 4 载体上，取代u r a 3 序列，构建成 p u c l8 - i n t 4 - a 载体。 p u c l8 i n t 4 载体实现基因定点整合需要两个步骤，第一步：将p u c i8 - i n t 4 载体转化u r a 3 序列缺失的酵母菌株，涂布于省却尿嘧啶的培养基平板，利用 选择标记基因u r a 3 和p c r 方法筛选出u r a 3 序列正确整合的酵母菌株；第二 步：将p u c l8 - i n t 4 a 载体转化在第一步中实现u r a 3 序列正确整合的酵母菌株， 利用u r a 3 基因编码的酶催化5 氟乳清酸( 5 f o a ) 产生细胞毒害物的特性和p c r 方法筛选出实现a d h i 基因正确整合的酵母菌株。 由结果可知，用此方法构建的基因整合载体p u c l 8 i n t 4 能够成功的实现基 因在酵母菌中的染色体定点整合。 关键词：酿酒酵母基因打靶同源重组载体 a b s t r a c t t h i ss t u d yi su n d e r t a k e nt oe x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo fam e t h o dt oc o n s t r u c ta v e c t o rf o ri n t e g r a t i n gg e n et oas p e c i f i cs i t ei ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg e n o m e a c c o r d i n gt ot h ei n f o r m a t i o no fy e a s tg e n o m ep r o v i d e db ys g d ，w eh a v ec h o s e na s e q u e n c ew h i c hi sa t - - 7 5 0 - - - 2 15 0 b pu p s t r e a mo ft h eg e n eh e m13o nt h en u m b e r4 c h r o m o s o m ea n dh a sn og e n ef u n c t i o na so u rt a r g e ts i t e t h el e n g t ho ft h i ss e q u e n c e i sa b o u t14 0 0 b p w eh a v ec h o s e nt w op a a sw h i c hh a v en or e l a t i o na ta l lf r o mt h i s s e q u e n c e ，o n ei s7 4 4 b pa n dt h eo t h e ri s6 0 2 b p t h e ya r et h et w oh o m o l o g y , h o m 1a n d h o m 2 t h ea i mo ft h i sw o r ki sc o n s t r u c t i n gt h ev e c t o rp u c 18 1 n t 4 t h ef o u n d a t i o no f v e c t o rp u c18 i n t 4i sv e c t o rp u c i8 一r y u rw h i c hh a sb e e nc o n s t r u c t e di no u r l a b o r a t o r y w es h o u l du t i l i z eh o m la n dh o r n 2t or e p l a c et h et w o “r e p e a t i n d i v i d u a l l y a c c o r d i n g t ot h e i rl o c ia n dd i r e c t i o no nt h ec h r o m o s o m e w eh a v eu s e dg e n ea d h1w h i c h c o m e sf r o my e a s tg e n o m et oe x a m i n et h ee f f e c t o fv e c t o rp u c18 一i n t 4 t h ew a yt or e a l i z et h i sa i mi sc o n s t r u c t i n gt h ev e c t o r p u c 18 - i n t 4 - aw h i c hh a sa d h1r e p l a c e du r a 3i nt h ev e c t o rp u c 18 - i n t 4 t h ep r o c e s so fi n t e g r a t i n gg e n ei n t oy e a s tg e n o m ei sl i k et h i s f i r s t l y , v e c t o r p u c i8 i n t 4i n t e g r a t e su r a 3t oau r a 3d e f e c ts t r a i n t h e nw ed e r i v es t r a i nw h i c h h a su r a 3b e e ni n t e g r a t e dt ot h es p e c i f i cs i t es u c c e s s f u l l y s e c o n d l y , v e c t o r p u c 18 - i n t 4 - ah a sa d hir e p l a c e du r a 3i ng e n o m eo fs t r a i no b t a i n e df r o mt h ef i r s t s t e p t oa c c o m p l i s ht h i sp r o c e s sw eh a v eu t i l i z e dt h ec h a r a c t e r i s t i co fu r a 3 ，t h e p r o d u c t i o no fw h i c hc a nc a t a l i z e5 - f o at oat o x i c s u b s t a n c ef o rc e l l w eh a v e e x a m i n e db o t ho ft h et w op r o c e s s e st h r o u g ht h ew a yo fp c r a tt h ee n do ft h i sw o r k ，w ec a ns e et h a tg e n ea d h 1c o u l db ei n t e g r a t e dt ot h e s p e c i f i cs i t eo fg e n o m es u c c e s s f u l l yt h r o u g ht h eu t i l i z a t i o no f v e c t o rp u c 18 i n t 4 s o t h i sm e t h o do fc o n s t r c t i o nv e c t o rf o rg e n et a r g e t i n gi sf e a s i b l e k e yw o r d s ： s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ， g e n et a r g e t i n g ，h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n ， v e c t o r 1 1 日茜 刖吾 对于遗传物质的探索研究是2 0 世纪生命科学研究的核心问题。1 9 5 3 年，d n a 双螺旋模型的提出，标志着人类对于遗传物质的探索进入了分子水平。随着 d n a 复制，转录和翻译机制的阐明，人类对于d n a 这一遗传物质对生物体性状 的控制方式有了深切地了解。破解d n a 所携带的生命信息，成为了2 0 世纪下 半叶生命科学领域一个嗜待解决的问题。在这种情况下“人类基因组计划”应运而 生，并且成功的完成了人类和一些模式生物基因组草图的绘制。从此，生命科学 进入了后基因组( p o s tg e n o m ee r a ) 时代1 2 , 3 ，人类对于生命世界和自身的认识达 到了前所未有的广度和深度【4 j 。 人类基因组草图的绘制完成，只是人类对于自身认识的第一步。随着后基因 组时代的到来，功能基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 研究成为了生命科学研究 的一个热点领域。功能基因组学运用遗传学技术，通过识别基因在一个或多个生 物模型中的作用来认识其功能，并能进一步实现对多个基因和蛋白质系统的功能 的全面了解。 随着功能基因组学的发展，人类对于基因和蛋白质结构和功能的认识不断深 化。这种认识深化的结果，使得人类产生了通过应用各种已知基因的特性为人类 生活服务的想法。 代谢工程是在2 0 世纪9 0 年代开始发展的一门新兴学科，它是在基因组学的 基础上，以实现代谢途径的分析与修改为目标的科学。在实际研究中，对于代谢 途径的修改主要是通过改变途径相关基因表达水平的方法来实现的。基因打靶正 是以改变基因表达水平为目的而产生的实验技术。因此，基因打靶技术在代谢工 程中有着广泛的应用。 本研究所要构建的载体p u c l8 n t 4 是在基因打靶基本原理的指导下，以应 用于代谢工程为目的而构建的。这正是基因打靶技术应用于代谢工程的一个例 子。我们相信将基因打靶技术应用在代谢工程中将会有很好的发展前景。 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：烈斜斜 签字日期：z 即7 ，年月口同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丕鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丕洼盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 嘉j 科斜 签字同期：z 叫年，月，7 同 翩虢增让 签字日期：力嘭晕钿 同 第一章文献综述 1 1 基因打靶研究现状 第一章文献综述 基因打靶( g e n et a r g e t i n g ) 技术是一种定向改变生物体遗传信息的实验手段 1 5 , 6 1 。它是利用宿主细胞本身具有的同源重组( h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ) 特性，将 外源d n a 序列定点整合在宿主细胞基因组( g e n o m e ) q b ，从而改变宿主细胞遗传 性状的实验技术。 2 0 世纪7 0 年代，以酵母s c e r e v 括i a e 为模式系统，建立了基因打靶操作技术 的基础【7 】o1 9 8 1 年，m a r t i n 和e v a n s 等1 8 , 9 1 分别成功分离培养了小鼠胚胎干细胞 ( e m b r y os t e mc e l l s ) ，从此基因打靶与e s 细胞分离培养技术相结合将基因打靶 技术带入了一个新的阶段。1 9 8 5 年，s m i t h i e s 掣1 0 j 首次在人永生细胞系中实现了 外源打靶载体和内源d 球蛋白间的基因重组。1 9 8 7 年，利用e s 细胞技术建立了 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶( h p r t ) 基因敲除的小鼠模型1 1 1 , 1 2 。1 9 8 8 年，c a p e c h i 等【1 3 】设计了“正负筛选”策略，比单纯采用正筛选时正确克隆富集的倍数要高 3 1 0 t 1 4 】倍。1 9 9 4 年，g u 纠1 5 】利用c r e l o x p 系统首次在小鼠上实现了组织特异 性基因敲除，使得对基因敲除进行时间和空间上的双重控制成为可能。从此，基 因打靶技术在哺乳动物基因组中的实现策略已经走向成熟，其成为修饰哺乳动物 基因组遗传信息的常规手段，并广泛应用于生命科学的各个领域。 进入2 1 世纪，基因打靶技术的研究和应用取得了长足的进展。2 0 0 0 年， m c c r e a t h 等【16 】成功的利用基因打靶技术在绵羊胚胎成纤维细胞中将伍抗胰蛋白 酶( a a t ) 基因定位整合到绵羊a 蛋白胶原( c o l i a l ) 基因座，细胞筛选获得 阳性细胞后，通过核移植技术获得一只活的绵羊。2 0 0 2 年，l a i 掣1 7 j 利用基因打 靶技术在猪胚胎成纤维细胞中对半乳糖基转移酶( g g t a l ) 基因进行了成功的 敲除，通过核移植后获得g g t a l 基因敲除猪。同年，p p l 公司的c a r o l 等s j 利 用体细胞二次基因打靶技术获得了g g t a i 双等位基因敲除猪，使基因打靶技术 走向了一个新的阶段。2 0 0 7 年，三位来自美国和英国的科学家c a p e c c h i ，e v a n s 和 s m i t h i e s 因为成功的将基因打靶技术应用于小鼠而获得了诺贝尔生理学和医学 奖，这无疑是对基因打靶技术的价值和应用前景最好的肯定。 第一章文献综述 1 2 基因打靶的基本原理及分子机制 基因打靶技术建立在宿主细胞自发的d n a 片断同源重组事件的基础上。利 用这一特性，宿主细胞能够将外源d n a 序列整合在自身的基因组中，从而实现 对宿主基因组遗传信息的定向改变。 同源重组又称为一般性重组( g e n e r a lr e c o m b i n a t i o n ) ，它是由两条同源区的 d n a 分子，通过配对，链的断裂和再连接，而产生片断交换的过程。同源重组 的最初证据来自于细胞遗传学对减数分裂时染色体行为的研究。真核生物在形成 配子时，细胞染色体进行一次复制，然后进行两次连续的分裂，由此从双倍体体 细胞变成了单倍体生殖细胞，称为减数分裂。在减数分裂的前期，参与联会 ( s y n a p s i s ) 的同源染色体已经完成复制，分别形成了两条姐妹染色单体，四条 染色单体构成了四连体( t e t r a d ) 。在四连体的某些位置，非姐妹染色单体间可以 进行同源片段的交换。在光学显微镜下，可以看到联会复合体间存在的染色体交 叉( c h i a s m a ) 现象。 同源重组不仅在细胞核中进行，在线粒体d n a 和叶绿体d n a 中也发生； 除了在d n a 之间发生也可能发生在r n a 分子与r n a 分子问，r n a 分子与d n a 分子之间。逆转录病毒在逆转录过程中就会发生高频的同源重组。 同源重组的分子机制目前尚未完全的阐明，但是已经有众多的科学家根据观 察到的现象和大量的实验证据，相继提出了多种解释同源重组分子机制的模型， 主要有以下两种： 1 2 1 h o l l i d a y 模型 h o l l i d a y 模型是由r o b i nh o l l i d a y 于1 9 6 4 年l l9 j 提出的，对于认识同源重组具 有十分重要的作用。 h o l l i d a y 模型阐明的同源重组过程主要有如下几个步骤： 1 在减数分裂的过程中，同源染色体彼此靠近发生联会，四条染色单体构 成四连体； 2 同源染色体的非姐妹染色单体之间，在d n a 内切酶的作用下，在相同位 置上同时切开，各形成一条断开的单练d n a 片断； 3 两条切开的单链d n a 片断互相交换位置，依照碱基互补配对原则与对应 染色单体相结合： 4 相互交叉的两条同源染色单体形成交联桥结构( c r o s s b r i d g e ds t r u c t u r e ) ； 5 交联桥结构可以依靠拉练式活动沿着配对d n a 分子“移动”。其中互补碱 第一章文献综述 基间形成的氢键从一条亲本链转移到另一条亲本链，于是两个亲本d n a 分子间 造成一大段异源双链d n a ，这种结构称为h o i l i d a y 结构； 6 绕交联桥旋转18 0 度，形成h o l l i d a y 结构的异构体； 7 根据两种切割方式的不同，形成不同的染色体d n a 分子的组成。 如果第二次切口形成在两条原来未被切开过的单链d n a 分子上，那么最终 的结果是四条单链都被切开了，这样就释放出了剪接重组的d n a 分子。双链体 中的一条d n a 亲链与这个双链中的另一条d n a 亲链以异源双链体的形式共价 连接。通过在异源双链体两端做好分子标记，我们在实验中能够看到这一传统的 重组现象。 如果第二次切口形成在原来被切开过的两条单链d n a 分子上，则另外两条 单链完好无损。这样的切口释放出亲本双链体，仅仅只留下一段异源双链d n a ， 所得的重组体称为补丁重组体( p a t c hr e c o m b i n a n t ) 。 从以上结果我们能够看出，双链体d n a 间的链交换会产生一段异源双链体 d n a ，但是，重组的结果并不一定伴有两侧d n a 片断地交换。 1 2 2m e s e i s o n r a d d i n g 模型 m e s e l s o n r a d d i n g 模型【2 0 】是m e s e l s o n 和r a d d i n g 在h o l l i d a y 模型的基础上 进行改进所构建的模型。 该模型认为，d n a 单链的形成及其向相邻d n a 双链的侵入为非对称产生。 d n a 单链可在一条d n a 双链中首先产生，随着缺口处d n a 链的修复合成，游 离出的单链末端侵入到同源d n a 双链中，与同源片断配对结合，被替换的d n a 链形成一个逐渐增大的d 环( dl o o p ) ，d 环断开后，产生的单链末端交叉侵入 到同源的d n a 双链中，d n a 自由末端共价连接形成h o l l i d a y 结构。 1 2 3 双链断裂修复模型( d s b r ) 双链断裂修复模型是s z o s t a k 在1 9 8 3 年提出【2 l 】的。它的重点在于大胆的假 设了双链断裂这一事件的发生。 d s b r 阐明的同源重组过程主要有以下几个步骤： 1 一条双链d n a 分子在特定核酸内切酶的作用下在特定位点被切断，形 成一条断裂的双链d n a 分子； 2 在核酸外切酶的作用下，断裂形成的两条d n a 双链分子从切口处沿d n a 链不断被降解，使得原来的切口形成了一个大的空隙，并且形成了两个3 单链末 第一章文献综述 端； 3 其中的一个自由3 末端侵入到同源染色体的同源区域，这是一个单链 侵入( s i n g l e s t r a n di n v a s i o n ) 的过程； 4 单链d n a 分子侵入双链分子后，取代了其中的一条链a ，依照碱基互 补配对原则与另一条链b 相结合，形成了一个d 环结构( dl o o p ) ，d 环结构以 侵入链的3 末端作为引物，通过双链修复合成系统，以b 链作为模板实现延伸； 5 d 环结构不断向前延伸，当其长度大于断开双链的空隙时，被取代的单 链a 与另一条断开双链的同源区域退火，以其3 端自由片断为引物，以链a 为 模板，通过双链修复合成系统实现新双链的构建； 6 在双链构件的最后，形成两个h o l l i d a y 结构，依照h o l l i d a y 模型的提供 的剪接方案，最终可形成不同的重组d n a 分子。 各种同源重组模型在解释同源重组现象的时候，均提出了自己独到的见解， 但是也都存在着不足之处。 h o l l i d a y 模型认为进行重组的两个d n a 分子在开始时需要在对应链的相同 位置上发生断裂。d n a 分子发生单链断裂是比较常见的事件，但是很难想象两 个分子能够在精确的相同点发生断裂。m e s e l o n 和r a d d i n g 对此提出了修正意见， 他们认为同源d n a 分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一d n a 分子的同源区，造成链的置换，被置换的链再切断并与最初断链连接，形成 h o l l i d a y 中间体。但是更多的事实表明，重组是由双链断裂启动。双链断裂模型 中假设了双链d n a 断裂的发生，这是一个不可逆转的过程。由于后续过程的修 复，使得最终产生的d n a 分子不存在任何遗传信息的丢失，但是，如果修复过 程存在任何的差错，都可能造成细胞遗传信息的丢失，而使细胞无法继续生存下 去。 现在一般认为，同源重组是同源染色体联会的原因，而不是联会的结果。 d n a 分子只有发生双链断裂才能与同源染色体发生链的交换，启动重组过程。 在不同的生物体内同源重组的具体过程可以有许多变化，但是基本步骤是相同 的。同源性并不意味着序列完全相同。两d n a 分子只要含有一段碱基序列大体 类似的同源区，即使相互间略有差异，仍然可以发生重组。同源重组是最基本的 重组方式，他参与各种重要的生物过程。复制，重组和修复三个过程是密切相关 的，这些过程中许多相关的酶和辅助因子也都是公用的。同源重组在基因的加工， 整合和转化中起着重要的作用。 1 3 基因打靶策略 第一章文献综述 在目前的基因打靶应用中，通过构建基因打靶载体，利用载体与染色体d n a 间的同源重组实现基因打靶是最常见和可行的策略。 打靶载体的作用是通过进行其与打靶位点的同源重组，将突变带入靶位点， 从而实现基因打靶目的。由于在真核细胞中非同源重组事件的发生，因此要在打 靶载体上添加一些选择标记基因，用来筛选基因打靶成功的转化子，比较常用的 是正负选择标记基因系统。作为选择标记从转化细胞中分离整合了外源基因的细 胞和作为突变源插入或者置换靶基因的外显子，使靶基因产生突变从而失活是基 因打靶载体中正选择标记基因的两个功能。负选择基因用来排除打靶过程中的非 同源重组，起富集中靶克隆的作用【2 引。 筛选中靶细胞的方法对的发展经历的一个漫长的过程。19 8 8 年，m a n s o u r l 2 j j 设计了一种称为正负选择系统( p o s i t i v e n e g a t i v es e l e c t i o n ，p n s ) 的载体。就是 p n s 载体。这种载体的特点是包括了一套正选择标记基因和负选择标记基因系 统。正选择标记基因n e o 通常被插入到靶基因功能最关键的外显子中1 2 4 j ，或者通 过同源重组删除靶基因最重要的功能域1 2 5 1 ，使靶基因彻底失活。用筛选培养基检 测时是否存在选择标记可以基因，可以判断打靶载体是否整合到宿主细胞的基因 组中，但是这其中也包括随机整合的情况。为了最大程度获得同源重组的克隆， 研究者将从单纯疱疹病毒中获得胸苷激酶( h s v t k ) 基因作为负选择标记基因插 入到同源片段的一侧。h s v t k 基因以核苷酸类似物为底物，如f i a u ，g a n c 等， 将其代谢为对细胞有毒性的物质，杀死细胞，而一般细胞的t k 基因不能代谢f i a u 和g a n c 。当打靶载体随机整合到细胞的基因组时，h s v t k 基因也被整合到基因 组上，这样，在含有f i a u 和g a n c 等物质的培养基中，宿主细胞无法存活。 当打靶载体通过同源重组整合到细胞的基因组上时，由于h s v t k 基因位于同源 片段的外侧，这样，它无法整合到宿主细胞的基因组中，而得以在含有f i a u 和 g a n c 等物质的培养基中存活下来从而得到富集。 表1 1 常用正选择标记基因 t a b l e1 1p o s i t i v es e l e c t i v eg e n e su s e df r e q u e n t l y 选择标记基因来源筛选药品 第一章文献综述 表1 2 常用负选择标记基因 ! ! ! ! 里! ：兰翌兰g 曼! i 呈：宝! ! ! ! g 兰翌! ! 坚兰宝! ! ! 曼g 坚曼翌! ! z 选择标记基因 来源筛选药物宿主基因型 p n s 载体虽然提供了完善的筛选中靶细胞的方案，但是，用这种方法获得的 筛选子仍然存在很多随机整合的情况。m a n s o u r l 2 6 1 在随后的研究工作中又对这种 方法进行了改进。在研究i n t 2 基因打靶的过程中，他发现在同源片段的一端加 入h s v t k 基因，获得的筛选子中同源重组与非同源重组的比例是2 0 0 0 ：1 。如果， 在同源片断的一端各加入一个h s v t k 基因，获得的筛选子中同源重组与非同源 重组的比例为4 x 1 0 6 ：l 。在后续的实验中，发现这是因为h s v t k 基因在载体转 化和整合的过程中由于很多原因可能被破坏而丧失活性，当载体的两端各加入一 个h s v t k 基因时j 其被同时破坏的可能性大大减小，从而增加了负选择标记基 因发挥作用的几率，使获得同源重组转化子的可能性增加，这被后来的试验证实 【2 7 1 。其他的研究也表明，这种载体的改进能够显著增加基因打靶成功的比例1 2 引。 1 3 1 利用置换型载体的完全基因敲除 完全基因敲除是指利用同源重组载体直接将靶基因在细胞中的活性完全消 除1 2 明。进行完全基因敲除需要在体外构建携带目标基因突变型的打靶载体，然后 利用载体转化方法，将载体导入到宿主细胞中，通过同源重组将细胞中的野生型 目的基因替换成无活性的突变型。实现目标基因的完全失活。完全基因敲除的关 键是构建各种同源重组载体，目前常用的载体有置换型载体和插入型载体。 置换型载体又称为q 型载体，其基本元件包括与靶位点两侧同源的同源序列 臂，正选择标记基因，细菌质粒序列和载体上同源臂外侧的线性化位点。在许多 情况下，还要在载体上增加一个负选择标记基因以富集发生同源重组的细胞。置 换型载体发生同源重组的机制目前还没有定论。基因打靶的结果是，载体中同源 序列与靶基因间发生两次d n a 片断交换，把基因序列被打靶载体上的同源臂及 同源臂间的序列所代替，同源臂两端的非同源序列被切除p 。 第一章文献综述 置换型载体的结构 基因组中打靶位点的结构 基因打靶成功后基因组中打靶位点的结构 图1 3 置换型载体结构和基因打靶结果示意图 f i g u r e1 3t h es t r u c t u r ea n dg e n et a r g e t i n gr e s u l to fr e p l a c e m e n tv e c t o r 设计置换型载体的需要考虑两个问题。一个是产生突变的类型，另一个是筛 选富集方法的选择。使用置换型载体进行基因缺失不是用将整个靶基因完全去除 的方法使靶基因失去功能，而是在靶基因外显子处插入一个正选择基因，使基因 产生移码突变或者缺失突变从而失去功能。 由于外显子的长度能影响r n a 的剪接1 3 ，所以带有正选择标记基因的外显 子常常不能被r n a 修饰系统所识别而被当作内含子而剪切掉。如果被剪切掉的 外显子是编码序列，但是其长度不是密码子的整数倍，就会造成把基因的移码突 变，而使靶基因丧失功能；如果被剪切掉的外显子是密码子的整数倍，则会产生 一个确实部分序列的蛋白质，这种蛋白质可能保持基因的部分或全部功能而使基 因打靶的效果大打折扣。 为了使目标宿主细胞的遗传背景清晰，一般情况下用正选择标记基因置换全 部或者部分基因。 打靶载体同源臂的长度对打靶效率的影响很大【3 2 1 。置换型载体同源臂的长度 一般在5 - 8 k b 之间。为了进一步确定打靶成功，通常使用p c r 的方法进行检验。 用p c r 方法进行检验的关键是p c r 引物的设计。其引物设计的一般原则是：一 个引物同正选择标记基因中的序列互补配对，另一个引物与染色体上同源臂外侧 的一段d n a 序列互补配对。p c r 产物的长度对p c r 扩增的效率有很大的影响， 第一章文献综述 所以设计引物时应该注意使预期产物的长度保持在o 5 2 k b 之间，这样可以保证 检测的准确性。由前面同源臂的长度可知，为了保证p c r 检测的效率，同源臂 是不对称的，有长臂和短臂之分。短臂的长度在0 5 2 k b 之间，便于p c r 检测。 同时，长臂要足够长，以保证同源重组的效率。 另一种检测中靶转化子的方法是利用s o u t h e r n 的方法。这种方法对于载体设 计的要求主要是选择合适的限制性酶切位点和正确的探针。这对于正确的监测结 果具有很重要的意义。 在置换型载体进行转化前，通常使用限制性内切酶使其线性化。这是因为经 过线性化处理的置换型载体发生同源重组的比例要高于保持环状的载体。由此要 求置换载体在同源片断的外侧具有合适的限制性酶切位点，从而有效的增加置换 型载体发生同源重组的几率。 对置换载体进行单位点酶切之后转化细胞，由于其酶切末端相互连接从而重 新构成环状片段的几率较高，致使转化子在筛选的过程中产生许多假阳性的结 果，虽然在后期p c r 的检测中能够识别这种假阳性的转化子，但是这无疑增加 了筛选的工作量。在实际工作中常通过在同源片断两侧分别增加酶切位点的办法 来解决这种问题。这样，待整合的区域与载体片但彻底分离，其相互连接构成环 状片段的可能性减小，从而减小了假阳性出现的几率，方便了后期的筛选工作。 综上所述，为了实现载体高效的打靶和后期准确的检测，置换型载体的构成 一般具有如下几个特点。 1 为了高效的实现同源重组，同源臂的长度一般在5 - 8 k b 之间。同时，为了兼 顾后期的p c r 检测，同源臂分为长臂和短臂，短臂的长度要在o 5 2 k b 之，长臂 的长度一般在5 8 k b 之间； 2 为了提高目标基因突变失活的概率，正选择标记基因的插入位点一般选在 目标基因中位于上游的外显子中，同时应尽量避免插入到两个密码子之间； 3 如果靶基因太小或者5 端的外显子太大，应删除整个基因； 4 为了方便同源重组片段的线性化，位于同源片断外侧的载体d n a 序列应该 具备尽量多的内切酶位点，方便整合片段的线性化，以提高基因打靶的效率。 1 3 2 利用插入型载体的完全基因敲除 插入型载体又称为。型载体，在基因打靶的过程中，将整个载体片断通过同 源重组插入到目标基因的序列中，使靶基因产生突变。插入型载体与整合型载体 具有相类似的基本结构元件，二者的主要差别在于线性化位点位置的差异。置换 型载体的线性化位点位于同源片断的外侧，插入型载体的线性化位点位于同源片 第一章文献综述 断的内部。线性化的载体经过同源重组整合到染色体上使靶基因的同源序列增加 了一个拷贝。对于相同的打靶序列，插入型载体的打靶效率比置换型载体高5 1 0 倍【3 3 】。但是，插入型载体插入把基因序列后产生较多的整合情况，不利于控制， 因而在实际基因打靶过程中人么更倾向于使用置换型载体。 插入型载体的结构 - 豳函豳往灞幽 一 i 染色体上打靶位点的结构 插入型载体打靶成功后染色体上打靶位点的结构 图1 - 4 插入型载体结构和基因打靶示意图 f i g u r e1 - 4t h es t r u c t u r ea n dg e n et a r g e t i n gr e s u l to fi n s e r t i o nv e c t o r 插入型载体的主要组成部分包括：至少含有一个单一的限制性内切酶位点， 正选择标记基因和d n a 载体的基本骨架。使用插入型载体需要仔细考虑重组后 基因剪接和翻译的可能形式。一般情况下，插入的载体足以使靶位上的外显子失 去活性，但是，由于插入载体的整合使得染色体上增加了一个同源片断的拷贝。 在这种情况下，可能在r n a 剪接加工过程中形成正确的组合最终翻译产生野生 型的功能蛋白。为了保证在蛋白质水平上形成突变，一般在打靶载体上引入一个 中止密码子，从而提高基因敲除成功的可能性。 与置换型载体相比，插入型载体的整合类型更复杂。在设计载体时一般有两 种使载体线性化的方法，一种是形成双链断裂点，一种是形成双链断裂区。采用 这两种方法获得筛选子都可以用p c r 的方法鉴别。由众多的实验显示，双链断 裂区的方法可靠性要高一些。这是因为通过这种方法可以较合理的设计p c r 引 第一章文献综述 物，一条引物和双链断裂区互补配对，另一条引物和载体上的异源序列互补配对。 一旦杂体插入到打靶位点，双链断裂区就以染色体为模板得以修复，可以通过 p c r 扩增出来。如果发生随机重组，双链断裂区无法得到修复，其上的引物由 于缺少互补位点而无法扩增。 用s o u t h e r n 的方法进行检测，比较有效的设计方法是，探针不在打靶位点的 同源序列上，限制性内切酶位点不在打靶载体上。插入一个拷贝的阳性克隆酶切 片断应增大，增加的大小正好等于打靶载体的大小。同样，链状聚合体的插入也 可用类似的方法来验证。 综上所述，为了实现插入型载体高效准确的基因打靶，插入型载体的构成一 般具有以下几个特点： 1 为了实现同院从组时间高效的发生，同源臂的长度一般在5 - 8 k b 之间； 2 同源臂上应该至少含有一个单一的限制性酶切位点，以便线性化载体的实 现； 3 如果同源序列仅含有一个外显子，正选择标记基因不要插入到外显子内。 如果存在多个外显子，不要选择第一个和最后一个外显子作为插入位点； 4 为了便于s o u t h e r n 杂交分析，应尽量破坏一些酶切位点。 1 4 基因打靶的影响因素 提高打靶效率是基因打靶技术在应用中要解决的核心问题，在众多的相关研 究中，我们可以得知提高基因打靶效率的主要影响因素有以下几点： 1 双链断裂 在基因打靶的过程中，打靶载体与靶位点之间的同源重组机制至今尚没有一 个确定的解释。在哺乳动物中，随机重组的概率要远高于同源重组发生的频率， 为同源重组的3 0 4 0 0 0 0 倍。如何提高打靶载体与染色体之间同源重组的机会一 直是基因打靶技术研究的重点。关于同源重组分子机制的研究，已经有很多数据 显示，染色体双链的断裂是同源重组发生的先决条件，在许多的体外试验中也发 现，双链断裂后的d n a 片断发生同源重组的几率比没有双肩断裂的片断要高很 多【3 4 - 3 7 。同源重组的双链断裂修复模型正是在这样的情况下产生的。d s b r 模型 同样以h o l l i d a y 模型为原型，对同源重组的起始作了改进，由原来的两同源染色 体的相应位置同时发生单链断裂演变成了一条同源染色体发生随机的双链断裂。 此模型同样以形成h o l l i d a y 中间体作为结束。双链断裂模型很好的解释了学多科 学实验的现象，成为目前比较普遍接受的一个解释同源重组事件机制的模型。 第一章文献综述 2 打靶载体的类型 插入型载体和置换型载体获得正确筛选子的几率存在着很大的差异。h a s t y 在用h p r t 基因研究插入型载体和置换型载体的重组效率时发现，用同样的同源 臂进行打靶，插入型载体的成功率为置换型载体的9 倍。导致如此差异的因素主 要有以下几点【3 8 j ： ( 1 ) 十字交叉点：插入型载体只有一个十字交叉点，只用经过一次染色体 互换就能实现重组，而置换型载体有两个十字交叉点，需要进行两次染色体互换 才能完成重组； ( 2 ) 游离端：游离端在基因打靶的过程中对于打靶效率有很大的影响【3 9 】。 插入型载体在同源区线性化，产生的两个游离端相互临近。置换型载体在同源区 外侧各产生一个游离端，相距较远。相比之下，两个邻近的游离端更有利于染色 体互换。这个结论在酵母细胞中的实验已经验证【4 0 1 。 ( 3 ) 同源序列的打断：置换型载体在同源序列之间需要插入一个正选择标 记基因，但是插入型载体可以将正选择标记基因放在同源序列的外侧。置换型载 体基因整合的效率下降是因为被异源序列打断的同源序列的同源重组效率会下 降。 3 同源臂的长度 同源臂的长度对基因打靶的效率也有比较大的影响。一般来说，同源臂的长 度越长，中靶的效率也越高1 4 1 , 4 2 。理想的同源臂长度在5 1 0 k b 之间，同源臂的 长度如果大于1 0 k b 虽然会提高同源重组的效率，但是会造成打靶载体过大，操 作不方便：单一性限制酶切位点难找，无法线性化；以及中靶克隆筛选困难等一 系列的不便。 4 打靶位点 在酵母的减数分裂过程中发现，染色体的断裂总是出现在某些特定的位点， 如果将同源臂选在这些位点，打靶效率比其他位点将会明显增力1 ：i 1 4 3 , 4 4 。这就表示， 染色体的结构或者某些特定的d n a 序列影响同源重组的频率。 1 5 基于c r e l o x p 重组酶系统的条件基因打靶 1 5 1c r e l o x p 重组酶系统实现基因重组的原理 c r e 重组酶由s t e n b e r g 等f 4 5 】于1 9 8 2 年从p i 时菌体中发现，属于九i n t 酶超 基因家族( i n t e g r e a s es u p e r f a m i l y ) 。c r e 重组酶基因编码区序列全长1 0 2 9 b p ， 第一章文献综述 编码3 8 k d a 蛋白质。c r e 重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个3 4 b p 的 l o x p 位点之间的特异性重组，使l o x p 位点之间的序列或者基因被删除1 4 6 1 。通 过d n a 足迹法( d n af o o t p r i n t i n g ) 重组酶的作用特点发现了l o x p 序列。l o x p 序列是由两个1 3 b p 的反向重复序列和中间间隔的一个8 b p 序列共同组成，8 b p 的间隔序列同时也确定了l o x p 的方向。c r e 在催化d n a 链交换的过程中与 d n a 共价结合【4 7 】，1 3 b p 反向重复序列是c r e 的结合域。c r e 两个l o x p 介导位 点间的重组是一个动态可逆的过程，可以分成三种情况：如果两个l o x p 位点在 同一条d n a 链上，并且方向相同，c r e 酶能有效切除两个l o x p 位点之间的d n a 序列；如果两个l o x p 位点分别位于两个不同的d n a 链或者染色体上，c r e 酶 能介导两个d n a 链之间的交换或者染色体易位；如果两个l o x p 位点位于一条 d n a 链上，但是方向相反，c r e 酶能介导两个l o x p 位点间序列的倒位。 5 - a t a a c t r c g t a t a a t g t a t g c t a t a c g a a g t i a t - 3 i y - t a t t g a a g c a t a t t a c a t a c g a t a t g c t t c a a t a 5 1 3 b p 反向重复序列 8 b p 中间序列1 3 b p 反向重复序列 图1 5l o x p 位点d n a 序列结构 f i g u r e1 - 5t h ed n as e q u e n c ea n ds t r u c t u r eo fl o x p 目前c r e 重组酶的作用机制还不完全清楚【4 8 1 ，已经存在的作用模型包括随机 卷曲模型，拓扑异构酶模型，核小体模型和足迹模型等。c r e 重组酶催化的是一 个可逆的重组事件，重组结果代表着正负反应的平衡。由于每1 3 b p 的反向重复 序列结合一个c r e 分子，因此每次重组的发生需要4 个c r e 分子，这表明重组 效率在一定程度上与重组酶的表达水平有关【4 9 1 。h o e s s 等【4 9 】的体外实验表明， 用含l o x p 的超螺旋d n a 作底物，c r e 酶作用后有5 0 产物不含超螺旋d n a ， 也可是线性d n a 。2 0 世纪8 0 年代中期，分子生物学家s a u e r 等首先注意到这种 酶并把它应用到高等生物中。他把一段两侧带有l o x p 位点的基因导入培养细胞 的基因组中，同时转入c r e 基因从而表达产生c r e 蛋白，结果证明l o x p 位点 间的d n a 序列被切除【5 0 】。c r e 在体内介导产生充足的唯一条件是c r e 蛋白的存 在，不需要其他辅助因子协同，该特性使得c r e