（分析化学专业论文）含亲电基团的荧光探针的合成及其在生物分析中的应用研究.pdf

含亲电基团的荧光探针的合成及其在生物分析中 的应用研究 摘要 大多数生物分子本身没有荧光或荧光较弱，直接检测灵敏度较低，为使之高灵敏的 检出，人们常用荧光染料或荧光探针与待测物进行标记或反应，生成具有强荧光的共价 或非共价结合的物质，使检出限大大降低。荧光探针技术在分析化学，特别是生物分析中 有较广泛的应用。利用荧光分析法对生物体系中蛋白质、核酸、金属离子及自由基的分 析测定已引起人们的广泛重视。 生物体中的巯基化合物( 包括半胱氨酸、高半胱氨酸和还原型谷胱甘肽等) 在调节 体内氧化还原动态平衡上起了非常重要的作用。血液中巯基化合物的缺乏可引发多种疾 病，例如：艾滋病、心脏病、阿尔茨海默氏症和心血管疾病等。谷胱甘肽硫转移酶 ( g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ，g s t ) 作为i i 相解毒代谢酶，其主要功能是催化某些内源性或 外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合，增加其疏水性使其易于排出 体外，从而达到解毒的目的。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好及可用于原位分析等 优点而在分子检测中受到人们的广泛关注。因此设计合成具有选择性好、灵敏度高、可 用于实时检测巯基化合物和g s t 活性的荧光探针具有非常重要的意义。本文分别以香豆 素、荧光素为母体设计合成对巯基化合物和g s t 具有有专一响应的荧光探针。论文分五 章，分别包括以下内容： 第一章绪论。主要介绍了含亲电基团的荧光探针检测生物体系中巯基化合物及还 原型谷胱甘肽硫转移酶活性的研究进展，并提出本论文的研究设想。 第二章4 甲基伞形酮类荧光探针检测巯基化合物的应用研究。本文设计合成了一 种检测巯基化合物的新型荧光探针l ，该探针是由4 一甲基伞形酮与2 ，4 ，6 三硝基氯苯 一步反应完成。化合物1 是一种无荧光的物质，在p h = 7 4 的水溶液反应体系中，其与 巯基分子发生亲核取代反应，使化合物1 中硝基苯环上的c o 键断裂释放出强荧光物质 4 甲基伞形酮，导致反应体系荧光强度显著增强。基于上述原理，本章建立了一种检测 人血清中生物巯基的荧光分析法。 第三章测定巯基化合物的荧光素类荧光探针的研究。本文分别以2 ，4 ，6 三硝基 氯苯、2 ，4 二硝基氯苯和对硝基氯苯作为羟基的保护基团合成了化合物3 、化合物4 和 化合物5 三种弱荧光的物质。在生理p h 条件下，化合物3 可与巯基分子发生亲核取代 反应，使化合物3 中硝基苯环上的c o 键断裂释放出强荧光物质荧光素，导致反应体系 荧光强度显著增强。与化合物3 相比，化合物4 与巯基分子发生亲核取代反应的活性显 著降低，而化合物5 不能与巯基分子发生亲核取代反应。我们以化合物3 作为检测巯基 化合物的荧光探针，其最大发射波长5 1 3 眦( 可见区) 。基于上述原理，本章建立了一 种测定生物巯基的荧光分析法。实验结果表明，该方法选择性好，灵敏度高。 第四章一种检测谷胱甘肽硫转移酶活性的荧光素类荧光探针。文献报道，还原型 谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 可有效增强还原型谷胱甘肽( g s h ) 的反应活性。由于第三 章所合成的化合物4 与巯基分子发生亲核取代反应的活性较低，但在g s t 的催化下， g s h 可有效进攻化合物4 中与硝基苯环相连的醚键的碳位，释放出强荧光物质荧光素， 导致体系荧光强度增加。在相同的实验条件下，g s h 不能与化合物5 发生亲核取代反应。 因此我们以第三章合成的化合物4 作为检测g s t 活性的荧光探针，建立了一种测定谷 胱甘肽硫转移酶活性的新型荧光分析法。 除了以上工作外，我们还开发了一种检测水溶液中锌离子的荧光传感器，具体内容 如下： 第五章以香豆素为母体的z i l 2 + 荧光传感器的合成及应用研究。本文以香豆素为母 体设计合成一种检测z n 2 + 的化学传感器6 。化合物6 本身是一种弱荧光物质，在3 0 的 乙醇水溶液中，其与z n 2 + 形成l ：1 的配合物。由于z n 2 + 与化合物6 之间的配合作用，束 缚了化合物6 分子中n 原子上的孤对电子，从而抑制了化合物6 中的光诱导电子转移过 程，导致反应体系荧光信号增强。基于上述原理，本章设计合成了一种测定水中z n 2 + 的荧光传感器，该传感器检测z n 2 + 灵敏度高，选择性好。 关键词：荧光探针，香豆素，荧光素，巯基化合物，g s t s t u d yo f t h es y n t h e s i so fe l e c t r o p h i l i cs u b s t i t u t e df l u o r o g e n i c p r o b e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n si nb i o a n a l y s i s a b s t r a c t m o s to ft h eb i o l o g i c a lm o l e c u l e sa r en o n f l u o r e s c e n to rw e a k l yf l u o r e s c e n tc o m p o u n d s ， a n a l y t e s a r et a g g e d 、析t l lf l u o r e s c e n tt a g g i n gr e a g e n t sa n dg e n e r a t e dw i t hc o v a l e n to r n o n c o v a l e n tb i n d i n gm a t e r i a lw h i c hh a v eh i 曲f l u o r e s c e n c e t h ed e t e c t i o nl i m i ti sl o w e r e d t h ef l u o r e s c e n tm e t h o di sw i d e l yu s e di na n a l y t i c a lc h e m i s t r y , e s p e c i a l l yi nb i o l o g i c a l a n a l y s i s s om u c ha t t e n t i o nh a sb e e na t t r a c t e dt os t u d yp r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d s ，m e t a li o n sa n d f r e e r a d i c a l si nb i o l o g i c a ls y s t e m s i n t r a c e l l u l a rt h i o l ss u c ha sg l u t a t h i o n e ( g s h ) ，c y s t e i n e ( c y s ) a n dh o m o c y s t e i n e ( h c y ) p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nm a i n t a i n i n gb a l a n c eb e t w e e nt h e i ro x i d i z i n ga n dr e d u c i n gf u n c t i o n s t h i o l sd e f i c i e n c yi nb l o o da r ea s s o c i a t e d 谢t 1 1a i d s ，h e a r td i s e a s e ，a i z h e i m e r sa n d c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e t h eg l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e s ( g s t s ) a r ep h a s ei id e t o x i f i c a t i o n e n z y m e st h a tc a t a l y z et h en u c l e o p h i l i ca t t a c ko fg l u t a t h i o n e ( g s h ) t oaw i d er a n g eo f h y d r o p h o b i ce l e c t r o p h i l i cc o m p o u n d s ，s oa st oa c h i e v ed e t o x i f i c a t i o np u r p o s e f l u o r i m e t r i c a n a l y s i sh a v em a n ya d v a n t a g e ss u c ha sh i 曲s e n s i t i v i t y ，h i 曲s e l e c t i v i t y ，r e a l t i m ed e t e c t i o n i nr e c e n ty e a r s ，t h ed e t e c t i o no fb i o l o g i c a lt h i o l sb a s e do nf l u o r e s c e n c et e c h n i q u e sh a s r e c e i v e dm u c ha t t e n t i o n i nt h i sp a p e r ，c o u m a r i na n df l u o r e s c e i n - b a s e df l u o r e s c e n tp r o b e s w h i c hh a v eh i 曲s e l e c t i v i t yf o rt h i o l sa n dg s tw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h i s d i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ff i v ec h a p t e r ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： i nc h a p t e r1 ，t h er e s e a r c hp r o g r e s so nf l u o r e s c e n tp r o b e sc o n t a i n i n ge l e c t r o p h i l i cm o i e t y f o rt h i o l sa n dg s tw e r es u m m a r i z e d b a s e do nt h el i t e r a t u r e sr e p o r t e d ，t h eo b j e c t i v eo ft h i s d i s s e r t a t i o nw a sp r o p o s e d i nc h a p t e r2 ，a4 - m e t h y l u m b e l l i f e r y l b a s e dt h i o l s - s e l e c t i v ef l u o r e s c e n t p r o b ew a s d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h ef l u o r e s c e n tp r o b ei san o n f l u o r e s c e n tc o m p o u n da n dw a s s y n t h e s i z e dv i at h eo n e s t e pr e a c t i o no f4 - m e t h y l u m b e l l i f e r o n e ( 4 - m u ) w i t h1 - c h l o r i n e - 2 ，4 ， 6 - t r i n i t r o b e n z e n e u p o nm i x i n g 晰也b i o t h i o l su n d e rn e u t r a la q u e o u sc o n d i t i o n s ，t h e2 ，4 ， 6 - t r i n i t r o p h e n y lg r o u po fc o m p o u n d1i se f f i c i e n t l yr e m o v e da n dt h ee m i s s i v ef r e ed y e4 - m u i i i w a sr e l e a s e d ，h e n c el e a d i n gt oad r a m a t i ci n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ee m i s s i o no ft h er e a c t i o n m i x t u r e b a s e do nt h ea b o v em e c h a n i s m ，af l u o r o g e n i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f b i o t h i o l si nh u m a ns e r u ms a m p l e sw a sd e v e l o p e d i nc h a p t e r3 ，af l u o r e s c e i n - b a s e df l u o r e s c e n tp r o b e3f o rt h i o l sw a sd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d i nt h i sp a r t , c o m p o u n d3 ，c o m p o u n d4o rc o m p o u n d5a r ew e a k l yf l u o r e s c e n t c o m p o u n d sa n dw e r es y n t h e s i z e dv i at h er e a c t i o no ff l u o r e s c e i n 诵m1 - c h l o r i n e - 2 ，4 ， 6 - t r i n i t r o b e n z e n e ，1 - c h l o r i n e 一2 ，4 ，d i n i t r o b e n z e n ea n d1 - c h l o r i n e 一4 一n i t r o b e n z e n e ，r e s p e c t i v e l y u p o nm i x i n g 谢t hb i o t h i o l su n d e r n e u t r a la q u e o u sc o n d i t i o n s ，t h e2 ，4 ，6 - t r i n i t r o p h e n y lg r o u p o f p r o b e 3w a se f f i c i e n t l yr e m o v e da n dr e s u l t si nt h er e l e a s eo ff l u o r e s c e i n ，h e n c el e a d i n gt oa d r a m a t i ci n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ee m i s s i o no ft h er e a c t i o nm i x t u r e b a s e do nt h ea b o v e m e c h a n i s m ，af l u o r o g e n i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fb i o t h i o l sw a sd e v e l o p e d i n a d d i t i o n , t h er e a c t i v i t yo fc o m p o u n d3a n d4t o w a r dt h i o l sw e r et e s t e d ，a n di tw a so b s e r v e d t h a tc o m p o u n d4 r e a c t i v i t yt o w a r dt h i o l sw a sm u c hl o w e rt h a nt h a to f3 ，w h e r e a sf o r c o m p o u n d5 ，i te x h i b i t sn or e s p o n s et o w a r dt h i o l s t h ea b o v er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e r e a c t i v i t yo f t h ef l u o r e s c e n tp r o b ec a l lb er a t i o n a l l ym o d u l a t e d i nc h a p t e r4 ，af l u o r e s c e i n - b a s e df l u o r e s c e n tp r o b e4f o rg l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e ( g s t ) w a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d i nc h a p t e r3c o m p o u n d4 r e a c t i v i t yt o w a r dt h i o l sw a ss t u d i e d a n di t ss h o w sl o w e rr e a c t i v i t yt o w a r dt h i o l s h o w e v e r , u n d e rt h ec a t a l y s i so ft h eg s t , t h e n u c l e o p h i l i cc a p a b i l i t i e so fr e d u c e dg l u t a t h l o n ew a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e d u p o ni n t r o d u c i n g g s tt ot h em i x t u r eo fg s ha n d4u n d e rn e u t r a la q u e o u sc o n d i t i o n s ，t h e2 ，4 - d i n i t r o p h e n y l g r o u po fp r o b e4w a se f f i c i e n t l yr e m o v e da n df l u o r e s c e i nw a sr e l e a s e d ，h e n c el e a d i n gt oa d r a m a t i ci n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ee m i s s i o no ft h er e a c t i o nm i x t u r e b a s e do nt h ea b o v e m e c h a n i s m ，af l u o r o g e n i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fg s t w a sd e v e l o p e d a p a r tf r o mt h ea b o v ew o r k ，an e wo p t i c a lc h e m o s e n s o rf o rz n 2 + w a sd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d ，d e t a i l sa sf o l l o w s ： i nc h a p t e r5 ，ac o u m a r i n b a s e df l u o r e s c e n tc h e m o s e n s o r6f o rz n 2 + w a sd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d c o m p o u n d6e x h i b i t sl o w e rb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c ed u et oi n t r a m o l e c u l a r p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r h o w e v e r ，u p o nm i x i n gw i t hz n 2 + i n3 0 ( v v ) a q u e o u s e t h a n o l ，a t u r n o n f l u o r e s c e n c ee m i s s i o ni so b s e r v e dd u et ot h ef o r m a t i o no fa1 ：lc o m p l e x 6 - z n 肘，a n dh e n c et h ei n t r a m o l e c u l a rp h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e ro fc o m p o u n d6i s i v a l l e v i a t e d b a s e do nt h ea b o v em e c h a n i s m ，af l u o r o g e n i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f z n 2 + w a sd e v e l o p e d t h i sp r o b ei sh i g h l ys e l e c t i v ef o rz n 2 + o v e ro t h e rm e t a li o n s k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n tp r o b e s ，c o u m a r i n ，f l u o r e s c e i n ，b i o t h i o l s ，g s t v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：嚣煎 指导教师签名： 2 01 0 年月i 日 2 奄f 。年乡月f 了日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：瓤蟹 2 0 o 年石月77 日 西北人学硕一l - 学位论文 1 1 研究背景 第一章绪论弟一早 三百v 匕 荧光探针法是利用荧光传感技术，通过测量待检测分子的出现或浓度的改变所引起 荧光强度、寿命、光谱等参数的变化量实现测量。性能优良的光学探针，应同时考虑其 选择性、灵敏度和实用性。理想的光学探针是其本身无光学信号，与待测分子作用后光 学信号增强。近几十年来，荧光分析法广泛应用于工业、农业、生命科学、环境科学、 材料科学、食品科学和公安情报等诸多领域。这些领域为新型荧光探针的开发提供了大 量课题。目前荧光分析法主要集中在蛋白质、多肽和核酸等生物大分子分析，生物药物 分析，超痕量和超微量生物活性物质分析等。 由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏度低，人们用强荧光的标记 试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结 合的物质，使检出限大大降低，从而达到对生物活性氧和某些具有重要功能的生物分子 的原位、适时和动态的表征。随着生物技术的不断发展，对蛋白质、核酸及细胞标记的 要求越来越高，传统的放射性标记方法已不能适应当今的发展需求。而发展起来的荧光 探针技术已经在蛋白质、核酸、免疫分析及细胞检测等方面显现出巨大的潜能。 生命体系中的巯基小分子在生命代谢过程中起到了非常重要的作用。他们的分离检 测受到人们的广泛关注。目前，检测巯基化合物的方法有高效液相色谱法( h p l c ) 1 1 - 4 j 、 电化学法 5 - 9 】、紫外分光光度法【1 0 。1 2 1 及荧光光谱法。其中荧光分析法具有灵敏度高、选 择性好、检测方便等优点。因此，设计开发开发具有高灵敏度的检测巯基化合物的荧光 分子探针具有十分重要的意义。 1 2 含巯基化合物在生命体中的作用 巯基化合物( 包括半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽等) 在维持生命体系中的氧化 还原动态平衡方面起着重要的作用。巯基化合物是与酶活性相关的最具反应性的官能 团，在酶的代谢过程中起着非常重要的作用。体内巯基化合物水平的高低与许多疾病密 切相关，如，t 3 脑血管病、糖尿病和肿瘤等1 1 3 。1 4 】。 1 2 1 高半胱氨酸 高半胱氨酸是一种含硫氨基酸，主要来源于蛋氨酸脱甲基后的产物，肝脏和肾脏为 第一章绪论 其主要代谢器官。高半胱氨酸在血浆中以蛋白结合型、高半胱氨酸一半胱氨酸混合型、 二硫化物等形式存在。体内高半胱氨酸含量的大小与许多疾病密切相关，其含量过高可 引起肾功能衰竭【侉17 1 、动脉硬化1 8 - 1 卅等病症。 1 2 2 还原型谷胱甘肽 谷胱甘肽可分为还原型( g s h ) 和氧化型( g s s h ) 两种基本形态( 见图1 1 1 ) ， 其中游离态谷胱甘肽主要以还原型存在。还原型谷胱甘肽( g s h ) 是哺乳动物细胞内最 主要、含量最丰富的巯基化合物，其主要分布在眼球、肝脏、肾和脾等部位。它在氨基 酸的运输、蛋白质的合成等方面起着非常重要的作用。因此保持细胞中还原型谷胱甘肽 与氧化型谷胱甘肽的平衡是维持细胞正常功能的前提幽- 2 2 1 。随着对g s h 的生理、生化等 方面的研究深入，g s h 在医学、食品、保健、防衰老等方面的应用已引起人们日益广泛 的关注。 h o 2 s h 图1 1 1 还原型谷胱甘肽结构 1 2 3 半胱氨酸 半胱氨酸是组成蛋白质的2 0 多种氨基酸中唯一一种具有还原性基团( s h ) 的氨基 酸。半胱氨酸在皮肤蛋白的角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性，并且补充巯基， 以维持皮肤的正常代谢。生物体内半胱氨酸对许多有害物质和毒素具有解毒作用。血 浆中半胱氨酸含量的变化会导致牛皮癣、肝损伤、老年痴呆症、骨质疏松等症状2 3 彩】。 1 2 4 还原型谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽硫转移酶( g s t s ) 是一种具有多种生理功能的蛋白质，其主要存在于细胞液 中。g s t s 是生物体内一种重要的解毒酶，其能催化还原型谷胱甘肽( g s h ) i 拘巯基( 一s h ) 结合到疏水化合物上，使亲电子的化合物变成亲水的物质，易于从尿液或胆汁中排泄【2 6 1 ， 从而达到解毒目的。哺乳类动物各组织中均含有不同种类的g s t s ，其含量和活性亦各 不相同，其中以肝脏中含量最高【2 7 1 。g s t 与肿瘤的易感性密切相关1 2 8 1 。 2 两北人学硕上学位论文 近年来，含亲电基团的荧光探针分子的开发已引起人们的广泛关注，该类探针在检 测有机小分子2 9 1 、生物活性物质【3 0 l 、氨基酸 3 1 - 3 3 】、阴离子【3 钙6 1 等方面已有若干文献报道。 亲核试剂与亲电基团反应是一种常见的化学反应类型。亲电基团作为分子识别的活性基 团引入荧光团，使荧光探针分子本身易与目标亲核试剂发生反应，从而使该类探针分子 具有了专一的识别功能。同时，由于该类探针分子中含有亲电基团，因此探针分子本身 可与亲核试剂发生亲核取代或亲核加成反应，从而破坏了荧光探针分子中本身含有的亲 电基团，导致相应荧光探针分子的光学性质( 如荧光发射波长、荧光强度等) 发生显著 改变，从而达到检测待测物的目的。生物体系中含巯基的氨基酸( 半胱氨酸，高半胱氨 酸) 和多肽( g s h ) 作为一种强亲核试剂，在一定的实验条件下易与含亲电基团的探针 发生亲核加成反应( 如醛基类) 或亲核取代反应( 如2 ，4 一二硝基苯磺酸酯类) ，使探针体 系的荧光性质发生显著改变。基于上述原理，可开发专一、灵敏、快速检测生物体中含 巯基的氨基酸和多肽的荧光探针分子。 下面，本论文对含亲电基团的荧光探针在检测生物巯基分子及还原型谷胱甘肽硫转 移酶( g s t ) 活性的基本情况进行了总结。 1 3 研究进展 1 3 1 用于检测巯基化合物的荧光探针 1 3 1 1 含硝基苯磺酸酯类荧光探针 b o u f f a r d 3 7 1 等合成一种对巯基化合物高选择性的荧光探针1 。探针分子内光诱导电 子转移过程使探针1 是一种弱荧光的物质，其荧光量子产率为0 0 0 0 8 ，最大发射波长为 5 6 0n n l 。在p h = 7 4 缓冲体系中，半胱氨酸进攻探针1 中含有吸电子基团的磺酸酯部分， 使磺酸酯断键，释放出荧光团2 ( 如图1 1 ) ，反应体系的发射波长红移至6 2 31 1 1 ，荧 光团2 的荧光量子产率0 0 1 。随着反应体系中半胱氨酸的加入，探针1 反应体系溶液的 颜色由黄色变为粉色。实验表明，探针l 对生物巯基选择性好，并能够有效抵抗氧氮等 亲核试剂的进攻。在近红外光区，生物基体光吸收或荧光强度很小，且组织的光散射明 显降低，激发光的穿透性更强，自发荧光的背景干扰显著降低。探针1 反应体系的最大 发射波长出现在近红外区，其更适合于检测生物体中的毓基化合物。该探针已成功用于 检测鼠胚胎纤维原细胞中巯基化合物的显微荧光成像。 3 第一章绪论 0 2 n 1 o b n i h 2 c n 图1 - 1 探针1 与巯基反应的机理 s h i b a t a 等【3 8 】以罗丹明1 1 0 为母体合成一种检测巯基化合物的荧光探针3 。实验中以 2 ，4 二硝基苯磺酰氯与罗丹明1 1 0 发生反应后生成一种弱荧光物质3 ，其荧光量子产率 为0 0 0 0 7 。在p h = 7 4 的孙s h c l 缓冲体系中，半胱氨酸与探针3 发生亲核取代反应， 探针3 中磺酰键断裂同时母体罗环打开，体系荧光强度增加。探针3 与半胱氨酸反应后 生成化合物4 与罗丹明1 1 0 两种物质，其中化合物4 是一种弱荧光物质，其荧光量子产 率为0 0 0 3 ，罗丹明1 1 0 的荧光量子产率为0 6 4 5 。此探针已成功用于活体细胞中巯基化 合物的荧光显微成像。 叫q 驴 n 0 2 3 乩p 峨刚村 h 2 n w e a kf l u o r e s e e n c e4 n h 罗丹明1 1 0 w a n g 等1 3 9 】以花菁素为母体合成一种检测生物巯基的荧光探针6 。以2 ，4 二硝基苯 磺酰氯为保护基团，改变了花青素分子中分子内电荷转移( i c t ) 过程。在甲醇：水( 3 ：7 ， v ) ，p h = 7 4 的磷酸缓冲反应体系中，还原型谷胱甘肽、半胱氨酸和高半胱氨酸都可 与探针6 发生亲核取代反应，反应体系溶液颜色由淡黄色变为橙色。同时反应体系的荧 光信号随还原型谷胱甘肽浓度的增加而增加( 图1 2 ) 。体系荧光强度的增量与g s h 浓 度在0 1 5 0 9 m o ll d 范围内呈线性关系，检出限为o 2 4n m o l l 一。探针6 既可以用比色法 4 现 两北人学硕上学位论文 又可用荧光光谱法检测生物体中的巯基化合物。 r s h n 0 2 p 吼4 o 6 图1 2 探针6 与巯基反应的机理 j i a n g 掣2 9 1 设计合成了种检测环境中苯硫酚的荧光探针7 。探针7 是一种无荧光物 质。当反应体系中加入苯硫酚或脂肪硫醇，由于二者p k a 值的差异( 苯硫酚的p k a = 6 5 ， 脂肪硫醇的p k a = 8 5 ) ，它们与探针发生反应的活性不同。在p h = 7 3 的反应体系中，脂 肪硫醇主要以分子形式存在，而苯硫酚主要以负离子形式存在( 此形式有很强的亲核 性) ，因此体系荧光强度随着苯硫酚浓度的增加而增加( 如图1 3 ) 。探针7 能特异性识 别苯硫酚分子，并有望用于定量检测环境中苯硫酚的含量。 置 o l | o = s ， h n n 0 2 p h = 7 3 n a r s 。 0 ， n n b 手 a r s n n 0 2 7 图1 - 3 探针7 与苯硫酚反应机理图 1 3 1 2 含s e n 键类荧光探针 t a n g 等h 0 1 以罗丹明6 g 为母体设计合成了一种含s e - n 键的荧光探针8 。由于巯基 化合物有很强的亲核能力，其可以攻击探针中的s e - n 键，释放出强荧光物质罗丹明6 g ( 图1 4 ) 。选择性实验表明探针8 对巯基化合物选择性好，灵敏度高。以还原型谷胱 甘肽作为代表性巯基化合物，在p h = 7 4 的反应体系中，体系的荧光强度随着g s h 浓度 的增加而增加。体系荧光强度的增量与g s h 的浓度在3 - 1 2 0n m o l l 0 范围内呈线性关系， 检出限为1 4n m o l l 。实验结果表明，探针8 可用于还原型谷胱甘肽的定性与定量分析。 该探针已成功实现了体内正常肝细胞中巯基化合物的原位分析。 5 夕dn呛刚 第一章绪论 h s c 八n w e a kf l u o r e s c e n c e8 罗丹明6 g9 图l - 4 探针6 检测巯基的机理 t a n g 等【4 l 】以罗丹明1 1 0 为母体合成了一种检测细胞中巯基化合物的新型荧光探针 1 0 。探针1 0 是一种无荧光的物质，当巯基化合物与探针1 0 发生亲核取代反应后，探针 中s e - n 键断裂，体系荧光强度增加了近1 7 0 倍( 如图1 5 ) 。选择性实验表明，探针 1 0 检测巯基化合物选择性好、灵敏度高。随着反应体系中巯基化合物的加入，探针1 0 反应体系溶液颜色由淡黄色变为黄绿色，利用此探针可对巯基化合物进行裸眼分辨。还 原型谷胱甘肽是细胞中含量最高的一种巯基化合物，因此选择g s h 作为代表性巯基化 合物进行光谱实验。在p h = 7 4 的反应体系中，体系的荧光强度随着g s h 浓度的增加而 增加，体系荧光强度的增量与g s h 的浓度在o 0 1 5 1 0g m o ll 。范围内呈线性关系，检 出限为1 4 4p m o l l - 1 。该探针已成功用于人正常肝细胞和人肝癌细胞的荧光显微成像。 r s h h z n + 4 1 0岁丹明1 1 0 图1 - 5 探针1 0 与巯基反应机理 1 3 1 3 含醛基类荧光探针 d u a n 等4 刁合成了一种检测半胱氨酸的萘酰亚胺类荧光探针1 l 。半胱氨酸与探针1 1 中的醛基反应后形成稳定的噻唑衍生物( 如图1 6 ) 。在乙醇：水( 6 ：4 ，v v ) ，p h = 7 2 的 反应体系中，随着反应体系中半胱氨酸浓度的增加，体系荧光强度增加，最大发射波长 从4 5 5n l n 红移至4 8 0n n l ，体系荧光颜色从蓝色变为蓝绿色。该探针已成功实现了对活 6 9 呱 西北人学硕j 二学位论文 体细胞中半胱氨酸的原位检测。 o h o - - 矿o h ：n l s h o 中n 节o h n 蕊n h 冷 h n 人ss 人n h 。，、。 l l 图l _ 6 探针l l 与巯基反应机理 k i m 等以香豆素为母体设计合成了对半胱氨酸和高半胱氨酸有特定选择性的荧 光探针1 2 。h c y 和c y s 与探针1 2 中的醛基形成六元噻嗪环或五元噻唑环。随着h c y 和 c y s 加入探针1 2 的反应体系，体系荧光强度降低( 如图l 一7 ) 。利用该探针可对半胱氨 酸和高半胱氨酸进行裸眼分辨。 o h o - 矿o l h h 2 n - 3 - ( 蒂h n = 1 c y s ； n 2 2 h c y 7 t c 0 2 乩n 脓吧 1 2 图1 7 探针1 2 与l t c y c y s 的反应机理 r u s i n 掣1 2 1 合成了对h c y 和c y s 有特异性识别的荧光探针1 3 。随着反应体系中h c y 和c y s 浓度的增加，溶液颜色由亮黄色变为橙褐色，最大吸收波长由4 8 0n i n 红移至5 0 0 姗。反应体系荧光猝灭，利用此探针可对半胱氨酸和高半胱氨酸进行裸眼分辨。 1 3 z h a n g 等【删合成一类偶氮染料类传感器1 5 。传感器1 4 的最大吸收波长位于4 6 5 i u i l ，硝基增强了传感器1 5 分子内电荷转移( i c t ) 过程，传感器1 5 最大吸收波长红移至 7， 第一章绪论 5 1 5n n l 。在中性条件下，当h e y 和c y s 分别加入传感器1 4 与传感器1 5 的反应体系中， 反应体系吸收波长分别从4 6 5a m 蓝移至4 4 2n l t l ，5 1 5n m 蓝移至4 5 7n l l l 。溶液颜色由 粉色变为黄色。利用该传感器可对半胱氨酸、高半胱氨酸进行快速、准确的分析。 o h c 1 4 n - n n o h c ：n o t p o l o m o r p h i s m ，a n dr i s ko fi s c h e m i cs t r o k e ：r e s u l t so fam e t a - a n a l y s i s j n e u r o l o g y , 2 0 0 2 ，5 9 ( 4 ) ：5 2 9 - 5 3 6 【2 0 】p a s t o e ra ，f e d e r i c ig ，b e r t i n ie a n a l y s i so fg l u t a t h i o n e ：i m p l i c a t i o ni nr e d o xa n d d e t o x i f i c a t i o n j c l i n i c h i m a c t a ，2 0 0 3 ，3 3 3 ：19 - 3 9 【21 】t o w s e n dd ，t e wk ，t a p i e r oh t h ei m p o r t a n c eo fg l u t a t h i o n ei nh u m a nd e s e a s e j b i o m e d p h a r m a c o t h e r ，2 0 0 3 ，5 7 ( 3 4 ) ：14 5 - 15 5 2 2 】 c e r e s e rc ，g u i c h a r dj ，d r a rj ，e ta 1 q u a n t i t a t i o no fr e d u c e da n dt o t a lg l u t a t h i o n ea t t h ef e m t o m o l el e v e lb yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 、厕t l lf l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n ：a p p l i c a t i o nt or e db l o o dc e l l l sa n dc u l t u r e df i b r o b l a s t s j j c h r o m a t o g r b ， 2 0 0 1 ，7 5 2 ：1 2 3 1 3 2 2 3 】 s h a h r o k h i a ns l e a dp h t h a l o c y a n i n ea sas e l e c t i v ec a r d e rf o rp r e p a r a t i o no fa c y s t e i n e s e l e c t i v ee l e c t r o d e j a n a l c h e m ，2 0 0 1 ，7 3 ：5 9 7 2 5 9 7 8 【2 4 】h a nq h ，x um x ，t a n gl ，e ta 1 h o m o c y s t e i n ee n z y m a t i cc o l o r i m e t r i ca s s a yf o r t o t a lc y s t e i n e j c l i n c h e m ，2 0 0 4 ，5 0 ( 7 ) ：1 2 2 9 1 2 3l 1 5 第一章绪论 【2 5 j a n a k y1 l ，v a