（蔬菜学专业论文）番茄中BR相关基因的遗传转化研究.pdf

飞7 3 2 9 4 8 学校代码：! q 兰兰量 研究生学号：2 0 2 1 6 0 5 2 番茄中b r 相关基因的遗传转化研究 论文评阅人：型! 塞蝗婴童旦主国坐趱盟窥压 汪自强熬援逝堑盍堂壅堂随 麦盔煎数援逝、江太堂壅堂瞳 答辩委员会主席：曾亡塞熬援逝江盔堂篁佥型堂堂医 答辩委员会委员：途巨民教援逝延太堂壅堂隧壅堂丕 堑堑基副教握逝、江太堂壅堂瞳国苎丕 湮值搓数援逝江太堂盔堂医国苎丕： 兰塑里照坠堂垡兰壅 墨垫! 曼坚塑苎墨里塑丝堡茎些堕茎 摘要 油菜素甾酵类化合物( b r s ) 是在植物的生长发育中起重要作用的一类植物激素。b r 的主要生理作 用是促进植物的生长和提高植物对环境逆境的抗性。目前b r 信号转导途径已基本清楚，b r 信号转导 的主要组分包括膜受体b r i i 、与哺乳动物糖元合成酶澈酶3 相似的b i n 2 激酶、核蛋白b z r l 和 b z r 2 b e s l 等。最新研究表明b z r i 在调节b r 信号转导、b r 生物合成和生长响应中发挥关键性作用。 本研究选用模式植物番茄作为遗传转化受体引入b r 信号转导重要组分基因口z r 基因以 期为迸一步分析b z r l 在诵节b p , 的信号转导途径、b r 水平和b r 诱导基因的表述中的功能以及探讨能 否通过对b z r l 的调控进行作物改良奠定基础。因此，我们建立了番茄离体培养植株再生体系，构建了 b z r l 基因植物表达载体，并将目的基因导入根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 菌株中，进行了番茄的遗传转化研究， 获得了1 9 株番茄k a n r 植株。主要研究结果如下： ( 1 ) 通过不同的激素配比的筛选，提出了一个番茄离体培养再生频率较高的培养基配方( m s 培养 基+ 3 蔗糖4 - 0 7 琼 1 + 2 m g l6 - b a + 0 2 r a g r l i a a ) ，子叶外植体的再生频率达8 9 ，下胚轴外植体 的再生频率达9 4 。 ( 2 ) 检铡鉴定了已构建的含b z r i 基因的植物表达载体质粒3 5 s b z r i c f p 和含b z r i 基因的植物 表达载体质粒3 5 s b z r l - c f p 分别将它们导入农杆菌l b a 4 4 0 4 菌株中。 ( 3 ) 经过对番茄外植体k a n 筛选浓度的确定、抑菌剂a m p 的敏感性试验、预培养和共培养时间的 筛选，建立了一个番茄遗传转化体系。具体操作为：将番茄子叶外植体在预培养基上培养2 ，3 d 后，用 含目的基因的农杆菌l b a 4 4 0 4 菌液侵染1 5 r a i n ，在灭菌滤纸上吸干菌液，置于共培养基上培养3 d ，随 后将外植体转入含k a n2 0 m g l 的选择分化培养基上诱导不定芽，2 - 3 周转瓶一次，当抗性不定芽长至 2 - 3 c m 时，在愈伤组织处切下幼苗，置于生根培养基上诱导不定根，2 0 d 左右后不定根长成，开瓶炼茁， 然后移栽至营养中，正常管理a ( 4 ) 按已建立的番茄遗传转化体系获得了1 9 抹卡那霉素抗性苗，对全部的k a n 8 转基因番茄植 株进行了p c r 检测，结果有1 6 株含6 7 2 b p 标记基因( 俨r 口基因) 扩增产物 目前，番茄转基因植株的进一步分子检测和田间鉴定及遗传特性等研究还在继续中。 关键词：番茄；b r 信号转导；b z r l ；遗传转化 兰鬯墨兰塑生曼堡墼 量茎! ! 璺塑羞茎垦堕堕堡蔓些堡塞 a b s t r a c t b r s i n o s t e r o i d ( b r s ) a r eac l a s so fs t e r o i dh o r m o n e st h a tp l a y i m p o r t a n tr o l e si np l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t b rc a np r o m o t ep l a n tg r o w t ha n de n h a n c et h er e s i s t a n c eo f p l a n t st oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s t h e p i c t u r eo fb rs i g n a l l i n gi se m e r g i n gi nr e c e n ty e a r s t h em a i nc o m p o n e n t so fb r s i g n a lt r a n s d u c t i o ni n c l u d e t h ec e l l 。s u f a c er e c e p t o rk i n a s eb r l l ，t h eg l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 一3 一l i k ek i n a s eb i n 2 ，n u c l e a r p r o t e i n sb z r l a n db z r 2 b e s i ar e c e n t s t u d yd e f i n e sb z r l a c e n t r a lr e g u l a t o rf o rc o o r d i n a t i n gb r s i g n a l l i n g b r b i o s y n t h e s i s ，a n dg r o w t hr e s p o n s e s i nt h i ss t u d y , w ec o n s t r u c t e da l le f f i c i e n tt o m a t og e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，a n dt r a n s f o r m e db r s i g n a l 缸茁l s 出k 主i _ 。ng e n e ( _ b z r ig e n e ) i 幽t o m a t o ，w h i c hw e h o p e 乜m a k e a s t r o n gb a s i s 董对f u r t h e ri n v e s t s g a t i n gt h e f u n c t i o no f b z r ii nr e g u l a t i n gb r s i g n a l l i n g ，t h el e v e lo f b r i np l a n t , a n de x p r e s s i o no f b r i n d u c e d g e n e s ， a n dt h e r e f o r ed e v e l o p i n g s t r a t e g yf o rc r o pi m p r o v e m e n tb yr e g u l a t i o no f b z r l ，t h em a i nr e s u l t sa f ea sf o l l o w ： ( 1 ) w eh a v ed e v e l o p e da ne f f i c i e n tm e t h o df o rp l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mt o m a t oe x p l a n to fc o t y l e d o na n d h y p o c o t y l m sm e d i u m ，s u p p l e m e n t e d3 s u c r o s e ，0 7 a g a r , 2 m g l6 - b aa n d0 2 m g ，li a aw a st h e o p t i m u mm e d i u m i n o b t a i n i n gh i g hf r e q u e n c y s h o o t r e g e n e r a t i o n i nt o m a t o t h e f r e q u e n c y o fs h o o t r e g e n e r a t i o nf r o mc o t y l e d o nw a s8 9 ，w h i l et h ef r e q u e n c yo fs h o o tr e g e n e r a t i o nf r o mh y p o c o t y l sr e a c h e da s h i g ha s9 4 b y t h i sm e a n s ( 2 ) t h ep l a n te x p r e s s i n gp l a s m i dv e c t o r s3 5 s b z r i c f pa n d3 5 s - h z r l c fp w h i c hc o n t a d nb z r ia n d b z r lg e n er e s p e c t i v e l yw e r ec o n s t r u c t e d ，a n di n t r o d u c e dt oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i nl b a 4 4 0 4b y t r i p a r e n t a lc r o s s ( 3 ) a ne f f i c i e n tg e n et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e d ，a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o r t h e t r a n s f o r m a t i o no fb z r lo rb z r lw e r ea sf o l l o w ：t h ee x p l a n t sw e r ei n f e c t e db ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s s t r a i nl b a 4 4 0 4f o r1 5m i n u t e s ，a n dc o c u l t i v a t e df o r3d a y sa f t e rt h e yw e r e p r e c u l t i v a t e df o r2 - 3d a y s ，t h e nt h e e x p l a n t sw e r ei n o c u l a t e di n t ot h er e g e n e r a t i o nm e d i u mc o n t a i n i n g2 0 m g lk a n t oo b t a i nt h ek a r l ts h o o t ，a n d t h ee x p l a n t sw e r et r a n s f e r r e dt of l e s hm e d i u ma li n t e r v a l so f 2 - 3w e e k s t h ek a n “s h o o t sw e r ec u to f f f r o mt h e e x p l a n t sa n dp l a c e di nr o o t - i n d u c i n g m e d i u mw h e n t h e yg r e w t o2 - 3 c m l o n g r o o t sw e r ei n d u c e d i nt h es h o o t s a f t e r2 0d a y s ，a n dt h e nt h ec o v e ro ft h ec o n t a i n e rw e r eo p e n e dg r a d u a l l yw i t h i nt h ef i r s tw e e k ，a f t e rt h a t ，t h e y o u n gt r a n s g e n i cp l a n t sw e r et r a n s f e r r e dt os o i li nl a r g e rp o t s a n dg r o w n i nag r e e n h o u s e ( 4 ) 1 9k a n “y o u n gp l a n t sw e r eo b t a i n e di nt h et o m a t og e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nt e s t p e ra n a l y s i ss h o w e d t h a t1 6o f t h e1 9p l a n t sc o n t a i nt h e6 7 2 b p ( n p t 仂a m p l i f i c a t i o np r o d u c t s k e yw a r d s ：t o m a t o ；b rs i g n a lt r a n s d u c t i o n ；b z r lg e n e ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n 2 浙江大学碗士学位论文 番茄中b r 相关基因的遗传转化研究 0 前言 油菜素甾醇类化合物( b r a s s i n o s t e r o i d s ，简称b r s ) 是1 9 9 8 年日本千叶第1 6 届国际植物生长会议 公认的第六大植物激素，指具有生物活性的一类以甾醇为基本结构的天然植物产物n 普遍存在于植物 界及植物的各个组织器官中，其中以花粉和未成熟种子中最为丰富。在天然b r s 的家族中，油菜素内酯 ( b r a s s i n o l i d e 简称b r ) 的生物活性强，被认为是植物特殊发育过程中起作用的b r s 的活性形式。 b r 具有许多与常见的植物五大激素( 生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯) 不同的独特 的生理效应，含量极低就能发挥很强的生理活性。从2 0 世纪8 0 年代开始，我国在b r 的生理功能及其 农业上的应用方面开展了较为系统的研究，特别是b r 促进生长和提高植物对环境的抗性效应及其在农 业上的应用方孟研究较多【l “。b r 的生理作用可以概括为以下几个方面：促进细胞的伸长和分裂+ 增强 植物的光合作用，利于光合产物的运输和积累；提高种子活力，促进种子萌发；促进花粉管生长伸长， 调节开花；促进核酸和蛋白质合成及影响一些酶如过氧化物酶和硝酸还原酶的活性：减少低温下细胞内 离子的外渗，保护生物膜，提高作物的耐冷性；提高作物的抗病能力；减轻农药对叶片光台作用的抑制， 减轻除草剂的药害；提高作物的抗旱力、抗盐力，增加作物的抗逆境能力。因此。b r 在蔬菜生产上有 广泛的应用，主要体现在促进生长，提高产量；保花保果，促进果实膨大：提高抗逆性( 抗寒、抗盐和 抗病) ；提早成熟，延缓衰老改善品质等。 在传统的激素生理研究中，其中有一个方面的试验方法是先加入某种外源激素，然后观察所处理的 器官或植物在生理上的变化，这方面的研究已经取得了大量的成果。但随着激素分子生理学的发展，人 们开始认识到这样的试验存在明显的局限性，如加入外源激素时，由于对激素的吸收、运输和代谢过程 了解甚少，而所有这些过程都会因植物组织、器官以及发育阶段不同而异，因此，同一浓度的外源激素 进入细胞后其在细胞内的有效浓度可以差异很大，而这种差异将导致生理上的反应因试验条件不同而 异，甚至相互矛盾，因此外源激素处理不能完全重复内源激素的功能。 本研究基于b r 具有提高植物对环境抗性效应的生理功能，利用基因工程手段，选用模式植物番茄 作为遗传转化受体，引入b r 信号转导相关基因b z r l ，探讨能否通过这种手段，使植株在3 5 s 强启动 子的驱动下增强体内b r 相关基因的表达，从而影响b r 的信号转导途径，进而调节体内的b r 水平和 b r 诱导基因的表达，实现b r 的生理功能，提高番茄植株对不良环境的抗性效应。这可能在番茄作物 提早育苗、早春栽培上提高幼苗的抗性等方面提供一条新的途径，同时也为b z r l 基因或b r 信号转导 的其它相关基因在遗传转化提高作物抗逆性和对环境的适应性等方面的应用积累一部分资料。这样，试 验在验证b r 的生理功能过程中，避免了施加外源激素b r ，而是利用转基因技术，通过b z r l 调节b r 信号转导下游生长反应和内源b r 水平，直接验证内源b r 的生理功能，为激素生理研究提供一条新的 思路。 堂塑型堡主兰垡笙苎 墨垄! ! 墨塑薹茎里笪垫壁鲎堡堡壅 1 文献综述 1 1b r 信号转导研究进展 细胞信号转导( s i g n a lt r a n s d u c t i o n ) 主要研究细胞感受、转导环境刺激的分子途径及其调控的基因 表达和生理反应。3 0 余年来细胞信号转导的研究取得了重大进展，已成为生物学最重要、发展最迅速的 领域之一。 植物激素的信号转导系统是以激素受体为起点，性状产生为终点的细胞内信号转导途径。重要的研 究手段之一是通过对激素响应突变体的分析，找出突变基因所对应的正常基因在激素信号转导中的位 置进一步克隆该基因，分析基因表达产物的功能；还可通过转基因技术，将突变基因导入表达系统中， 验证基因表达产物的功能 t j 。 b r 信号转导是植物激素信号转导的一个重要组成部分。近年来，通过对模式植物拟南芥的一些分 子遗传学研究和生化分析b r 信号转导的研究取得丁很大的进展“，b r 信号转导的多个组分被发现， b r 信号从细胞膜向细胞核转导的途径也已基本清晰。 1 1 1b r i i 介导的b r 信号转导途径 在植物体内，从b r 信号的产生到与膜受体结合，引起信号的感知和传递，再到引起核内b r 诱 导基因的表达，擐终产生特定的生理反应，是一个连续且相互影响的过程，并且每一个环节都受到多种 内外因子在多个层次上的调节。目前关于b r l l 介导的b r 信号转导途径的研究比较多，且有比较大的 进展。 1 1 1 1b r 信号的感知 b r 信号的感知是其信号转导的第一步。b r 受体的研究主要集中于拟南芥中最早发现的b r 非敏感 型突变体b r i l ( b r s i n o l i d ei n s e n s i t i v e1 ) 上，它与b r 生物合成突变体的表型类似，与后者不同的是外 源b r 处理并不能逆转b r i l 的表型i ”】。拟南芥b r l l 基因的序列分析表明，它编码一个富含亮氨酸重复 序列( l e u c i n e - r i c hr e p e a t s ，简称u 汛) 的跨膜受体蛋白激酶( r e c e p t o r - l i k ek i n a s e s ，简称r l k ) ，属于 l r r r l k 家族【j 4 1 。b r l l 由胞外部分、跨膜结构域部分和胞内部分组成。胞外部分包括氮末端的信号多 肽( n - t e r m i n a ls i g n a lp e p t i d e ) 、亮氨酸拉链序列( l e u c i n e - z i p p e rm o t i f ) 、2 5 个串联的l r r 以及位于其 头尾的2 个半胱氨酸残基( c y s t e i n e ) ，在第2 1 和2 2 个l r r 之间还有一个7 0 个氮基酸的岛屿( 7 0 a m i n o a c i di s l a n d ) 。胞内部分包括近膜部分( j u x t a m e m b r a n er e g i o n ) 、胞质丝氨酸，苏氮酸激酶( c y t o p l a s m i cs e f i n e t h r e o i n ek i n a s e ) 及碳末端( c a r b o x y - t e r m i n a l r e g i o n ) a 很多研究表明，b r 1 是b r 受体的重要组成部分，b r 1 的胞外部分l r r 能直接感受b r 信号。h e ( 何祖华) 等曾将b r i i 的胞外l r r 、跨膜结构域部分及胞内近膜部分和水稻x a 2 l ( 是水稻中分离到的 一种与抗病性有关的l r r - r l k 基因) 的胞内蛋自激酶结构域融合构成嵌台体，此时外源b r 处理引起 了细胞的防御反应，表明b r i i 在细胞感知b r 信号中起直接作用，其胞外部分能感知b r 信号1 1 “。最 4 浙江大学礤士学位论文 番茄中b r 相关基因的遗传转化研究 近，k i n o s h i t a 等首次报道b r 能直接被b r i i 感知是b r 分子与b r i i 胞外功能域中一段9 4 个氨基酸组 成的序列( i d l r r 2 2 ) 直接结合，并不是像推测的那样b r 先与甾醇结合蛋白( s t e r o i d b i n d i n gp r o t e i n ，简 称s b p ) 形成复合体后再与b r l l 结合( j 6 i 。 l 1 1 2b r 信号从细胞膜到细胞质的转导 b r l l 下游的b r 信号转导组分包括b a k i 、b i n 2 、b z r l 和b z r 2 b e s l 等。 b a k l ( b r i ia s s o c i a t e dr e c e p t o rk i n a s e1 ) 是与b r l l 直接相互作用的一种l r r 受体激酶，它与b r l l 有类似的结构构成和亚细胞定位，不同的是它在胞外只有5 个l r r ，而且没有7 0 个氨基酸的岛屿部分。 目前b a k l 在b r 信号转导中的作用机制还不完全清楚，有不同的认为【l “1 8 1 , 突变体的进一步研究发现在拟南芥中有另一个与突变体b r i l 表型相似的b r 非敏感型突变体b i n 2 ( b r a s s i n o s t e r o i d i n s e n s i t i v e2 ) 。b i n 2 基因编码种胞质丝氨酸苏氨酸激酶，其催化功能域与果蝇的 s h a g g y 激酶和哺乳动物的糖元合成酶激酶3 ( g l u c o g e ns y n t h a s ek i n a s e - 3 ，简称g s k - 3 ) 有7 0 的同源性， 属于g s k - 3 s h a g g y * l i k e 基因家族【i ”。g s k - 3 1 s h a g g y - l i k e 激酶广泛存在于动物细胞中，一般作为信号转 导的负调节因子，在动物w i n g l e s s w i n 中，g s k - 3 s h a g g y l i k e 激酶将底物b 连环蛋白( 0 一e a t e n i n ) 磷酸化而阻遏信号的转导。因此推测b i n 2 在b r 信号转导中起类似的作用。b i n 2 是b r 信号转导途径 中的负调节因子，通过磷酸化作用阻遏b r 信号的转导。当b r 信号被感知时，b i n 2 的激酶活性受到抑 制，使b r 信号转导的抑制也得以解除。对b i n 2 激酶活性的抑制是b r 信号转导中的关键性步骤。 遗传筛选发现的两个显性或半显性突变体b z r l - d ( b r a s s i n a z o l er e s i s t a n t1 - d ) 和b e s i - d ( b r i l e m s s u p p r e s s o r1 - d ) 表明b z r l 及其同源蛋白b z r 2 b e s i 可能是b i n 2 激酶的底物1 2 0 1 ，两者有 8 8 的共有序列，在细胞质和细胞核中都有存在，它们是b r 信号转导的正向调节因子b “j 。外源b r 处理快速而明显地影响b z r l 和b z r 2 b e s i 的磷酸化和细胞定位。当没有b r 信号时，b i n 2 使b z r l 和b z r 2 b e s l 磷酸化，磷酸化的b z r l 和b z r 2 b e s l 被蛋白酶体系统水解，从而使它们在核中的积累 减少田1 当b r 信号被感知时，上游信号转导的启动使b i n 2 激酶的活性受到抑制，防止了b z r l 和 b z r 2 b e s l 的磷酸化，细胞质中游离的b z r l 和b z r 2 b e s i 水平得以提高，进而增加在细胞核中的积 累，活化b r 诱导基因的表达。由于b e s l 的主要功能为活化b r 诱导基因的表达，而b z r i 则不仅能 活化b r 诱导基因的表达，而且还抑制b r 生物合成中的关键酶基因如c p d 的活性，从而导致b r 生物 合成的反馈抑制川，因此b e s i 和b z r i 代表了b r 信号转导途径中有重叠功能的两个分枝。最近在b z r l 和b e s i 的作用机制研究上取得较大进展，已经发现b z r i 是一种在b r 的体内平衡和生氏反应中发挥 双重功能的转录抑制子讲j ，而b e s l 属于一类植物特异性转录囡子，与b i m l 等其它转录因子共同调节 b r 诱导基因的表达”。 拟南芥突变体d e t 3 的发现揭示了b r 信号转导途径在b r l l 的下游可能还有一个分支口“2 7 1 od e t 3 基因编码广泛存在于内膜和质膜上的液泡h + - a t p 酶( v a c u o l a rp r o t o n a t p a s e ，简称v - a t p a s e ) 的c 亚 基。b r 诱导突变体d e t 3 在反向地心引力作用下向上生长的下胚轴同样能伸长，先前还另有试验表明b r 诱导的黄瓜下胚轴的伸长依赖于连接在膜上的a t p a s e 活性。这样看来，d e t 3 可能在b r l l 的下游起作 用，b r 可能通过调节v - a t p a s e 的装配( a s s e m b l y ) ，促进液泡对水的吸收，从而引起细胞的伸欧。 f 1 1 1 3b r 信号在细胞核中对诱导基因表达的调控 浙江大学顼士学位论文 番茄中b r 相关基因的遗传转化研究 b r 信号转导的最后一步是在细胞核中调控b r 诱导基因的表达，从而影响植物的形态发生和发育。 受b r 调节的基因有很多，目前研究的较为深入的是木葡聚糖内转糖基酶( x y l o g l u c a n e n d o t r a n s g l y c o s y l a s e ，简称x e t s ) 基因【2 7 j ，在大豆、拟南芥、水稻和番茄中都有。b r 可以通过调节x e t 基因的表达影响细胞的伸长。像大豆中的b r u i 基因表达就在b r 刺激茎的伸长中发挥作用，而且b r 是在b r u i 转录后水平对其表达进行调节f 2 ”。拟南芥t c h 4 基因的表达也类似不过拟南芥t c h 4 基冈 的表达还受生长素和一些环境刺激如黑暗、温度等的影响，说明x e t 基因的袭达不仅只受b r 的调控， 同时t c h 4 基因表达的调节作用发生在转录水平上【驯。b r 还能通过调节微管基因的表达来影响细胞的 伸长b ”。b r 也能调节其它相关的基因表达来影响细胞的分裂和分化等。新兴的d n a 芯片技术又突破 了传统方法的限制，筛选鉴定到了其它大量的受b r 调控的基因。 1 1 2 不依赖于b i u l 的b r 信号转导途径 目前，关于b r 信号转导的研究大部分集中在以b r l l 为受体的b r 信号转导途径，而且b r 诱导的 很多基因都与细胞的伸长有关。虽然关于b r 对细胞分裂的影响报道较少但也有研究阐述了b r 在细 胞分裂中的功能及相应的信号转导途径1 ，像拟南芥d e t 2 ( b r 生物合成突变体) 悬浮培养细胞中c y c d 3 ( d 型植物细胞周期蛋白基因) 介导的b r 信号转导途径。 1 1 3b r 与其它信号的相互作用 由于植物细胞内存在复杂的信号转导网络体系( n e t w o r k s ) ，了解不同信号之间的相互作用对于我们 理解遮一复杂的信号转导网络体系越来越重要，这一类研究也已成为信号转导领域的研究热点p ”。因此， 在植物激素信号转导的研究中，不同激素信号间的相互作用也是一个重要的组成部分。植物激紊间的相 互作用对植物的正常发育来说非常重要，不同植物激素信号转导途径之问存在相互协同、拮抗和因果等 关系。对于b r 与生长素、赤霉素、细胞分裂素、茉莉酸及水杨酸等信号之间的相互作用很多的研究 都取得了较大的进展t 8 “】。 另外，b r 与光信号之间相互作用的研究也有不少报道睁2 12 3 3 ”。在一系列与光调节有关的拟南芥 突变体研究中发现，b r 信号可以调节植物的一些光反应，而光也能调节b r 的生物合成和信号转导过 程，b r 生物合成的一些关键酶基因如c p d 基因表达受光的调节。b r 信号的正向调节因子b z r l 具有 调节下游生长反应和b r 生物合成的反馈抑制的双重作用，而且这种作用依赖于光信号。在黑暗条件下， b z r l 对b r 信号转导的正向调节作用占优势，而在光照条件下，它对b r 生物合成的反馈抑制占优势a 因此，b z r l 基因可能是光和b r 信号转导途径相互作用中的一个调节点。 1 1 4 小结与展望 与其它的植物激素相比，b r 是一类新的植物内源激素。近些年来，对b r 的研究发展很快。b r i i 介导的b r 信号转导途径已经有了一个大致的轮廓( 图1 ) 。b r 信号是在细胞膜上被一个富含亮氨酸重 复序列的跨膜受体蛋白激酶( l r r r l k ) 感知，从胞外转导到了胞内；b r 信号在细胞质中通过b i n 2 激酶的活性受到抑制而防止了b e s l 和b z r i 的磷酸化，使游离的b e s l 和b z r l 在细胞质和细胞核中 的水平提高，b r 信号也从细胞质转导到了细胞核内：通过调节细胞核中b r 诱导基因的表达，影响植 物的生长发育，b r 信号实现了在细胞中的转导。 6 塑翌奎堂塑圭堂堡堡苎 量垄! ! 墨塑整里堕望堡篓些堡壅 但是目前被发现的多个b r 信号鞲导明组竹处个足以组厩一7 r 元墅刚1 - 芎转寻惩任，廿k j i ，r 寻州 b r 信号转导中还有很多的空白。b r 信号在细胞质中的传递即b r i i 与b i n 2 之间的b r 信号转导不清 楚，b r 信号在核内诱导特异基因表达的机理也不清楚，这些都有待于进一步的研究。同时，目前关于 b r 信号转导的研究犬部分集中于以b r l l 介导的b r 信号转导途径，而且b r 诱导的基因多与细胞的伸 跃有关。尽管不依赖于b r i i 的b r 信号转导途径也有报道，但都还不够明确，都需要更多的证据来证 明。 图1b r 信号转导模式图 f i g 1m o d e t f o rb r s i g n a lt r a n s d u c t i o n 随着研究的深入，通过遗传筛选发现新的有用突变体和基因以及通过生化技术手段发现新的b r 信 号转导组分，可以预见，b r 的信号转导研究将更为完善，b r 的信号转导途径将更加完整清晰a 同时t 信号系统之间的相互关系及时空性研究也将会达到一个新的高度。 1 2 番茄遗传转化研究进展 番茄( 五y c o p 8 珊血d he s c u l e n t u mm i l l ) ，茄科番茄属蔬菜。由于它适应范围广、产最高、富含维生素 类和糖类，以及在消费领域中有较广泛的用途，并在生产领域中有多种栽培方式，近一个多世纪班来， 已发展成为广泛分布于世界不同地区的重要蔬菜作物，被列为全世界年产量最高的3 0 种农作物之一3 “。 番茄不仅在经济领域中是一砷重要的经济作物，而且在生命科学的研究领域中也是一种重要的研究对象 7 浙江太学硕士学位论文 番茄中b r 相关基因的遗传转化研究 和试验材料，有其不可忽视的地位。在高等植物的基因工程技术中，番茄是最早进行基因转化研究的高 等植物之一已成为一种基因工程的模式植物。 1 2 1 农杆菌介导的番茄遗传转化研究 番茄的遗传转化主要采用农杆菌介导的遗传转化方法。通过这种转化方法，已培育出延缓成熟、抗 病虫害、抗除草剂、抗逆和高品质的优良番茄品种 3 5 4 0 1 。 1 2 1 1 延缓成熟与衰老的研究 延缓成熟与衰老的研究主要是通过调控乙烯的合成途径和抑制细胞壁果胶的降解来延迟番茄的成 熟。1 9 9 4 年世界上第一例商品化生产的转基因作物转基因延熟保鲜番茄f l a v r - s a v r 由美国c a l g e n e 公司培育成功并获美国农业部( u s d a ) 和美国食品与药物管理局( f d a ) 批准进入市场它是将反义 a c c - c d n a 导入番茄。 对乙烯合成途径的调控，主要是利用a c c 合成酶和a c c 氧化酶的反义r n a 表达来抑制乙烯生成， 从而达到延迟成熟、耐贮藏的目的。我国学者从1 9 9 0 年开始，利用转基因技术将乙烯形成酶( e f e ) 反 义基园导入番茄，创建了转基因耐贮藏番茄材料，并结合传统的杂种优势选育方法进行了杂种代品种 的选育，创建的转基因番茄材料于1 9 9 5 年通过农业部组织的专家鉴定，并于1 9 9 6 年获农业部农业生物 基因工程安全委员会批准，成为我国第一个可进行商品化生产的农业生物基因工程产品【4 ”。 另外，多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 和果胶甲酯酶( p e ) 这两大类细胞壁水解酶对果实的成熟有促进 作用，通过抑制阻止细胞壁水解酶活性，可抑制果实细胞壁的降解，延缓成熟与衰老。1 9 9 0 年s m i t h 构 建了p g 的反义基因，导入番茄后有效地阻止了细胞壁果胶的降解【4 ”，我国学者也有转反义p g 基因番 茄的研究， 1 2 l 2 抗病毒研究 抗病毒研究主要是把来自于病毒如外壳蛋白( c p ) 基因、卫星砌q a ( s a t r n a ) 基因、核糖俸失活 蛋白( r i p ) 及病毒的反义r n a 等引入番茄，利用源自病毒基因的抗性、卫星r n a 对病毒复制的干扰 和蛋白毒紊在核塘体对蛋自质合成的抑制等机理，使转基因植株表现出或增强抗性。抗病毒转基因番茄 最早始于1 9 8 6 年p o w e l l 将烟草花叶病毒( t m v ) 外壳蛋自c p 基因转入番茄h ”，培育出能稳定遗传的 抗病毒植株。此后人们不断分离出源于病毒的抗性基因，将之转入番茄获得抗病毒基因工程植株，如表 达黄瓜花叶瘸毒外壳蛋白( c m vc p ) 的转基因番茄植株表现出对c m v 侵染的抗性( 4 ”。将c m v 卫星 r n a 的c d n a 单体基因转化番茄【4 6 1 和天花粉蛋白( t g s ) y c 5 基因转化番茄 4 7 1 也有成功的报道。 1 2 1 3 抗真菌、抗细菌研究 抗真菌研究主要是利用植物几丁质酶和b 1 , 3 一葡聚糖酶基因转化番茄，这两种酶可以分别催化几丁 质和b 1 ，3 葡聚糖的水解反应，这两类物质又是许多真蘸细胞壁的主要成分，其降解的结果导致真菌生 长受阻。j o n g d i j k 等就将烟草i i 型几丁质酶基因和i 型b 1 , 3 一葡聚糖酶基因同时转入番茄中，得到的转 基因番茄用枯萎病病原菌感染后，病害比对照减少3 6 - 5 8 ，且受害植株可回复正常生长”“。水稻几丁 质酶基因“9 1 和细菌几丁质酶基因也分别被成功地导入到番茄中，培育出的番茄对枯萎瘸和晚疫病等有 良好的防治效果。 8 浙江大学硕士学位论文 番茄中b r 相关基因的遗传转化研究 同时也做了一些抗细菌番茄的研究工作”】。t a n s l e y 等从秘鲁番茄中克隆出抗细菌斑点病病菌的 基因p r o ，该基因编码的产物是色氨酸苏氨酸激酶型的蛋白质，可与该菌非毒性基因产物作用，转p r o 基因的番茄植株能抗细菌斑点病。我国学者将兔防御素n p j 基因转入番茄，转基因番茄植株在接种番 茄青枯病菌后生长良好，而对照植株出现全株萎蔫。 1 2 1 4 抗虫研究 抗虫研究使用最多的是用从苏云金芽孢杆菌获取的编码6 内毒素豹b t 毒蛋白基因和来源于高等植 物蛋白酶抑制因子的p l 基因如豇豆胰蛋白酶抑制基因( c 口t i ) ，其次还有雪花莲( s n o w d r o p ) 的外凝集 素基因( 1 e c t i n ) 。b t 基因是一种特异性杀虫基因，主要杀鳞翅目昆虫；p i 基因是一种广谱性抗虫基因， 其清蛋白具杀虫能力，且昆虫产生抗性的可能性很小：雪花莲凝集素基因能特异性地对蚜虫等刺吸式昆 虫有抑制作用。1 9 8 7 年f i s h h o f f 首次将b t k u r s t a k ih d b 缺失的c r y l a d 基因导入番茄，使转化植株抗 烟草天蛾等能力大大提高1 3 6 。后来将经过修饰的毒蛋白基因c r y u l ( b ) 和c r y l c 转入番茄，转化植株可以 产生对甜菜夜蛾、烟芽夜蛾和烟草天蛾的抗性”】；将含有雪花莲外源凝集素基因( g n a ) 的质粒转化番 茄，转化植株有一定的抗蚜虫效果p ”。 l - 2 1 5 抗除草剂研究 抗除草剂的研究主要有两种策略，一是转入能降解除草剂的酶基因来消除除草剂对作物的危害作 用，二是修饰除草剂作用的靶蛋白使其对除草剂不敏感，或促使这种靶蛋白过量表达使植物在吸收除草 剂后仍能进行正常代谢。现已获得转乙酰转移酶( p a t ) b a r 基因的抗草丁膦番茄洲、转突变的e p s p 合 成酶基因a r o 的抗草甘膦等除草剂的番茄i ”】、转a r o 4 突变基因的抗草甘膦番茄i “3 等。 1 2 1 6 抗逆研究 抗逆研究主要集中在抗冻和抗盐胁迫方面。首例由基因工程提高番茄抗冻性的成功报道是1 9 9 1 年 h i g h t o w e r 将比目鱼体内的抗冻蛋白( a f p ) 基因转入番茄，不但稳定转录a f p 的m r n a ，还能产生一 种新的蛋白质，转基因植株抗冻能力明显提高p “。 根据一些植物在受到盐胁迫时体内草酸氧化酶大量积累并通过其催化的反应产物h 2 0 2 诱导促使植 物系统抗性增加的原理，将草酸氧化酶基因转入番茄，得到的转基因番茄在盐胁迫情况下系统抗性将增 加”1 。从啤酒酵母中扩增得到的可调节植物细胞离子均衡的h a l l 基因和从大肠杆菌t g l 菌株中扩 增得到的胆碱脱氢酶( c d h ) 基因转入番茄后，转基因番茄耐盐性提高。 1 2 1 7 改良品质的研究 改良番茄品质的研究主要有增加番茄甜度、提高番茄固形物和类胡萝h 素含量。 增加甜度的研究主要有两种方法，一种是将酸性转化酶的反义c d n a 转入番茄【删抑制酸性转化酶 催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖，提高蔗糖含量，另一种是将甜味蛋白基因转入番茄1 6 “。 提高可溶性固形物研究主要是增加细胞分裂素的合成，使光合产物在果实中的分配增加，m a r t i n e a u 等以番茄子房壁调节因子基因与农杆菌的编码异戊烯转移酶基因p t 整合，使弘基因在番茄子房中表达， 由于异戊烯转移酶参与细胞分裂素的合成过程，所以使细胞分裂素的合成增加，从而增加了番茄可溶性 固型物的含量及总产量p ”。 9 浙江大学硕士学位论文 番茄中b r 相关基因的遗传转化研究 类胡萝i - 素含量是番茄品质和营养价值高低的主要标志之一，d r a k e 等将番茄红素合成酶基因的密 码子中的第3 个碱基进行修饰改变后，由c a m v 3 5 s 可控制启动子和n o s 终止子序列等蹩合在质粒载体 p r e l 3 上转化番茄，避免了共抑制的发生，使番茄红紊得到了超量表达”1 。 1 2 1 8 雄性不育性的研究 雄性不育性的研究是随著雄性不育学和细胞学研究的不断深入而发展起来的。研究发现绒毡屡发育 异常可导致花粉败育。绒毡层核酸酶( r n a s e ) 基因的启动和表达可使r n a 降解，花粉不能正常发育。 1 9 9 0 年m a r i a n i 将烟草花药绒毡层特异表达的基因启动子t a 2 9 与芽孢杆菌核糖核酸酶基因b a r n a s e 相 连导入甘蓝型油菜，得到了雄性不育的工程植株1 6 2 1 。我国学者也用t a 2 9 启动子和核糖核酸酶基因 b a m m s e 构建成雄性不育嵌合基因转化番茄，获得了具有雄性不育特征的转基因植株f 6 3 。 1 2 1 9 其它方面的研究 在其它方面，转基因番茄疫苗的研究也取得了一定的成果”1 。用狂犬病痛毒g 蛋自基因转化番 茄，外源抗原基因转化成功，所表达的重组g 蛋白能与多克隆g 蛋白抗体形成免疫沉淀，表明具有抗 原性。将乙型肝炎病毒的表面抗原基因导入番茄，成功获得了转基因抗乙肝番茄，相信经过更深入的研 究，口服一定量的该转基因番茄，人体即可通过免疫反应获得对乙肝病毒的抗体。还有利用转基因番茄 作为生物反应器生产人胰岛素，研究以口服方式摄入胰岛素在抑制自身免疫攻击以及预防i 型糖尿病中 所起到的作用。 1 2 2 利用花粉管导入法进行的番茄遗传转化研究 除了农杆菌介导的遗传转化方法利用花粉管导入法进行番茄的遗传转化也有成功的先例，黄永芬 等将整合了美洲拟鲽抗冻蛋白基因a f p 的t i 质粒直接注入番茄子房或花粉管中进行转化获得了抗冻番 茄【6 5 】。2 0 0 1 年陈火英等对番茄野生品种的耐盐性进行了研究，并提出可以通过花粉管导入技术将野生 番茄的d n a 导入到栽培番茄中，从而提高其耐盐性忡。 1 2 3 番茄基因工程展望 随着植物基因工程的发展与深入，番茄作为一种重要的蔬菜