（分析化学专业论文）微流控芯片电化学葡萄糖检测方法研究.pdf

， f l毫 at h e s i si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y e l e c t r o c h e m i c a lg l u c o s ed e t e c t i o nw i t h m i c r o f l u i d i cc h i pc e l l b yw e ny a n y a n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw uz h i y o n g n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j a n u a r y2 0 0 8 毒l r。豫鹣晦晦棼 一；、 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 = e 思。 学位论文作者签名： i 娜 日期：姗8 。 ) j ， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： j f屯；|，i，厦 、 吩k， l ； 】 东北大学硕士研究生学位论文摘要 微流控芯片电化学葡萄糖检测方法研究 摘要 糖尿病是影响人类健康的常见病，以高血糖为主要标志。监测血糖浓度是糖尿病诊 断和治疗过程中的一个重要组成部分。理想的葡萄糖生物传感器应该具有选择性高、速 度快、操作简便、成本低等特点，微型化和便携化是其发展的一个重要方向。微流控芯 片分析技术的出现为生物传感器的小型化及试样与试剂消耗的降低提供了新的发展契 机。 本论文对生物传感器，特别是葡萄糖生物传感方法的研究现状进行了综述，对其存 在的问题进行了分析，提出采用毛细管微酶反应器与微流控芯片电化学检测池连用的方 法实现通常以修饰电极法进行葡萄糖检测的可能性。 基于微流控芯片电化学池建立了一个流动葡萄糖检测系统。首先利用吸附、共价键 合、凝胶包埋、交联等固定化酶方法，将葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定在石英毛细管内 壁( i d 2 5 0 p r o ) ，制成毛细管微酶反应器，与微流控芯片电化学检测池连接，实现了对 少量葡萄糖溶液的流动测定。固定化酶表观米氏常数( k m ) 为1 5 2 4m m o l l ，在0 5 1 0 o m m o l l 范围内呈现良好的线性( r = o 9 9 7 6 ) ，检出限o 2 5m m o l l ( s n = 3 ) ，相对标准 偏差( r s d ) 为2 8 ( n = 9 ) 。 通过壳聚糖的引入增强了葡萄糖氧化酶的固定化性能，c u 2 + 、p b 2 + 、c d 2 + 、c r 3 + 四 种重金属离子对酶的抑制作用明显缓解，固定化酶的表观米氏常数k 蕊= 1 0 9 4m m o l l 。 该电化学葡萄糖传感系统在0 2 5 1 0 0m m o l l 范围内呈现良好的线性( r - - 0 9 9 8 8 ) ，检 出限为0 1m m o l l ( s n = 3 ) ，r s d - - - - 4 2 ( n = 9 ) 。对血浆样品中的葡萄糖进行了测定， 取得了9 6 1 0 6 的高回收率，与市售血糖仪测定结果无显著性差异( p = 9 5 ) 。 本论文亦在所建立的检测系统中引入电子传递媒介体对苯醌以降低抗坏血酸对葡 萄糖测定过程的干扰作用。对苯醌浓度0 0 1m o l l 时，该法在o 2 q 0m m o l l 内的线性 相关系数为0 9 9 8 2 ，相对标准偏差r s d = 4 1 ( n = 1 1 ) 。用该方法测定了血浆中葡萄糖 的浓度，加标回收率在9 6 - - 1 0 2 之间，与市售血糖仪测定结果进行了比较无显著性差异 ( p = 9 5 ) 。 该系统具有小型、连续、样品用量少以及分析速度快等特点，通过系统优化有可能 成为新型葡萄糖电化学检测系统，并在生产过程监测及诊断和治疗中得到应用。 l，i巴 东北大学硕士研究生学位论文 摘要 关键词：微流控芯片；电化学；流动葡萄糖传感器；石英毛细管固定酶；壳聚糖；电子 传递媒介体 n l 啼、l j 蠢 吩，illi ， 、 j 。 j 东北大学硕士研究生学位论文 e l e c t r o c h e m i c a lg l u c o s ed e t e c t i o nw i t h m i c r o f l u i d i cc h i pc e l l a b s t r a c t d i a b e t e sm e l l i t u s ，i n d i c a t e db yh i g hg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni nb l o o d ，i so n eo ft h em a j o r d i s e a s e st h a ta f f e c tp e o p l e sh e a l t h d a i l ym o n i t o r i n go ft h eg l u c o s el e v e li si m p o r t a n tn o t o n l yi nt h ed i a g n o s i s ，b u ta l s oi nt h ep r o c e s so ft h e r a p h y a ni d e a lg l u c o s eb i o s e n s o rs h o u l d h a v em a n ya d v a n t a g e ss u c ha sh i g hs p e c i f i c , f a s t ，e a s yt ou s e ，l o wc o s t , a n ds oo n m i n i a t u r i z a t i o na n dp o r t a b i l i t yo ft h e d e t e c t i o ns y s t e ma r ea l s oh i g h l yd e m a n d e d t h e 0 0 踢釉o co fm i e r o f i u i d i ct e c h n o l o g yo f f e r sag o o do p p o r t u n i t yf o rt h ed e v e l o p m e n to fs m a l l b i o s e n s o rd e v i c ew i t hl e s ss a m p l ea n dr e a g e n tc o n s u m p t i o n t h es t a t u so fb i o s e n s o r si ng e n e r a l ，a n de l e c t r o c h e m i c a lg l u c o s eb i o s e n s o r si np a r t i c u l a r a r er e v i e w e d , a n dt h em a i ni s s u e sa 陀a n a l y z e d i ti sp r o p o s e dt h a te l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n o fg l u c o s ec o n v e n t i o n a l l yb ye _ a z y m em o d i f i e dm a c r oe l e c t r o d e sc o u l db er e a l i z e db y i n t e r f a c i n gac a p i l l a r ye n z y m em i c r o - r e a c t o ra n da m i c r o f l u i d i ce l e c t r o c h e m i c a lc h i pc e l l f l o wg l u c o s ed e t e c t i o nw a se s t a b l i s h e db a s e do nam i c r o f l u i d i ce l e c t r o c h e m i c a lc h i p c e l ld e v e l o p e di nt h el a b i m m o b i l i z a t i o no fg l u c o s eo x i d a s ei nap i e c eo fc a p i l l a r ya sam i c r o r e a c t o rw a sf i r s t l ys t u d i e di n v o l v i n ga d s o r p t i o n , c o v a l e n tb i n d i n g , s o l g e le n t r a p m e n ta n d c r o s s - l i n k i n g a n df l o wd e t e c t i o no fg l u c o s es o l u t i o nw a sa c h i v e db yi n t e r f a c i n gt h ec a p i l l a r y r e a c t o ra n dt h ec h i pc e l l t h em i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n t ( k m ) o fe n z y m ew a s1 5 2 4m m o l l , a n dg o o dl i n e a r i t y0 t = 0 9 9 7 6 ) w a so b t a i n e di nt h er a n g eo f0 5 - 1 0 0m m o l lw i t had e t e c t i o n l i m i t so fo 2 5m m o u l ( s m = 3 ) a n dar e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n0 t s d ) o f2 8 ( n = 9 ) c h i t o s a nw a si n t r o d u c e df o ri m p r o v i n gt h ee n z y m ei m m o b i l i z a t i o n ，a n ds u p p r e s s i o n e f f e c to fc u 2 + ，p b “，c d “a n dc pt og o dw a so b v i o u s l ya l l e v i a t e d t h em i c h a e l i s m e n t e n c o n s t a n t ( k m ) o fe n z y m ew a s1 0 9 4r e t o o l l , a n dg o o dl i n e a r i t y 限- - 0 9 9 8 8 ) w a so b t a i n e di n t h er a n g eo f0 5 - 1 0 0m m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i t so f0 1m m o l l ( s i n = 3 ) a n dar e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f4 2 ( n = 9 ) g l u c o s ei np l a s m as a m p l ew a sm e a s u r e dw i t hh i g h r e c o v e r yi nt h er a n g eo f9 6 - 1 0 6 ，a n dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p = 9 5 ) w a sn o t i c e d c o m p a r i n g t oag l u c o s ei n s t r u m e n tf r o mt h em a r k e t p - b e n z o q n i n o n e ( p - b o ) w a si n t r o d u c e da s a ne l e c t r o nm e d i a t o rf o r l o w e r i n g t h e e l e c t r o c h e m i c a li n t e r f e r e n c ed u et oo t h e re l e c t r o c h e m i c a l l ya c t i v es p e c i e ss u c ha sa s c o r b i c a c i d w i t h0 0 1m o l lb q ，l i n e a rr e s p o n s e ( r = o 9 9 8 2 ) w a so b t a i n e di nt h er a n g eo f0 2 弓o 东北大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t m m o l lw i t hr s do f4 1 ( n = 1 1 ) r e c o v e r yr a t ef r o mp l a s m as a m p l ew a sb e t w e e n9 6 - 1 0 2 t h es a m er e s u l t ( p = 9 5 ) a st h a to fac o m m e r c i a li n s t r u m e n tw a so b t a i n e df o rt h ep l a s m a s a m p l e t h es y s t e mi n t r o d u c e di nt h i sw o r ki sc h a r a c t e r i z e di ns m a l ls i z e ，c o n t i n u o u so p e r a t i o n ， s m a l lc o n s u m p t i o no fs a m p l e sa n dh i g hs p e e d w i t hf u r t h e ro p t i m i z a t i o n ，t h i ss y s t e mc o u l d b e c o m ean e wt y p eo fg l u c o s ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o ns y s t e m ，a n df i n da p p l i c a t i o n si n d i a g n o s i s ，t h e r a p ya n dp r o c e s sm o n i t o r i n g k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ；e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ；f l o wg l u c o s es e n s o r ；c a p i l l a r y e n z y m er e a c t o r ；c h i t o s a n ；e l e c t r o nt r a n s f e rm e d i a t o r v 东北大学硕士研究生学位论文目录 目录 独创性声明。i 摘要i i a b s t r a c t 。 目j 畏 第一章引言1 1 1 微流控芯片1 1 1 1 微流控芯片概述1 1 1 2 微流控芯片分析系统的优点1 1 1 3 微流控芯片检测方法2 1 2 生物传感器5 1 2 1 生物传感器概述5 1 2 2 生物传感器原理5 1 2 3 生物传感器分类9 1 2 4 生物传感器酶的固定化9 1 2 5 生物传感器的应用1 4 1 3 论文工作目的及设计思想1 5 第二章微流控芯片葡萄糖电化学检测方法建立。1 7 2 1 弓l 言1 7 2 2 实验部分1 7 2 2 1 仪器与试剂1 7 2 2 2 微流控芯片葡萄糖传感器制备。1 8 2 3 结果与讨论2 1 2 3 1 微流控芯片电解池电极性质。2 1 2 3 2 微流控芯片葡萄糖生物传感器的电极行为2 3 2 3 3 葡萄糖传感器系统工作条件优化2 5 2 3 4 传感器工作范围2 7 2 3 5 米氏常数2 7 2 3 6 石英毛细管酶反应器稳定性2 9 r 东北大学硕士研究生学位论文目录 2 3 7 重金属离子对葡萄糖氧化酶的抑制3 0 2 4 小结3 0 第三章毛细管微反应器酶固载方法的改进3 1 3 1 弓i 言3 1 3 2 实验部分3 1 3 2 1 仪器与试剂3 1 3 2 2 微流控电化学检测池及石英毛细管固定化酶反应器制备3 2 3 3 实验结果与讨论3 2 3 3 1 循环伏安扫描3 2 3 3 2 系统工作条件优化。3 2 3 3 3 传感器工作范围3 4 3 3 4 米氏常数3 6 3 3 5 石英毛细管固定化酶反应器稳定性3 7 3 3 6 回收率实验3 8 3 3 7 金属离子对葡萄糖氧化酶的抑制3 9 3 3 8 实际样品检测3 9 3 4 刀、结。4 0 第四章对苯醌电子传递媒介体的葡萄糖检测方法。4 1 4 1 弓i 言4 1 4 2 实验部分。4 1 4 2 1 仪器与试剂4 1 4 2 2 微流控电化学检测器及石英毛细管固定化酶反应器制备4 2 4 3 结果与讨论4 2 4 3 1 工作条件优化4 2 4 3 2 葡萄糖生物传感器工作范围4 3 4 3 3 石英毛细管酶反应器稳定性。4 5 4 3 4 加标回收率。4 5 4 3 5 抗坏血酸影响。4 5 4 3 6 实际样品检测。4 6 4 4d 、结z r 7 第五章结论。4 8 i rfilt乒 ， j 一 东北大学硕士研究生学位论文 目录 参考文献4 9 致谢 ! ；7 囊l莠 知，lll 东北大学硕士研究生学位论文第一章引言 1 1 微流控芯片 1 1 1 微流控芯片概述 第一章引言 微全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，或m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ， 是 与在 年首次提出的【1 1 ，旨在通过化学分析设备的微型化, u - t a s ) m a n zw i d m e r 1 9 9 0 与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到便携化的分析设备中，甚至集成到方 寸大小的芯片上，本领域的一个更为通俗的名称“芯片实验室 ( 1 a b - o n a - c h i p ，l o c ) 已被广泛接受。微流控芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p s ) 是比- t a s 中当前最活跃的领域和发展 前沿，它最集中地体现了将分析实验室的主要功能转移到芯片上来。 微流控芯片主要以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以 微管道网络为结构特征，是当前微全分析系统发展的重点内容【2 1 。经过十多年的发展， 微流控芯片可将样品预处理、分离、鉴定、富集等分析过程于一体，且可多次重复使用， 因此具有更广泛的实用性。微芯片分析系统的出现可使珍贵的生物试样与试剂消耗大大 降低到微升甚至纳升级，并随着技术水平的提高，还有可能进一步减少，而且当实现批 量生产后芯片成本可望大幅度降低，而有利于分析测试技术普及到千家万户。微流控芯 片技术是一种看好的技术平台，但其实际应用仍在探索中，并试图真正实现其预期的性 能，本文的工作也是为了实现某些方面的潜力。 1 1 2 微流控芯片分析系统的优点 方肇伦等1 3 l 将微流控芯片分析系统的优点概括为如下几点： ( 1 ) 微米级的反应器中分析速度和反应速度通常比对应的宏观系统高1 2 个数量 级。其高速度既来源于微米级通道中的高导热和传质速率( 均与通道直径平方成反比) ， 也直接来源于功能结构尺寸的缩小。 ( 2 ) 微分析或反应系统中试样与试剂消耗低，一般也与通道尺度的平方成反比， 通常仅需数纳升至数微升。这不仅可以大幅度降低贵重试样( 如某些生物样品) 的消耗， 降低原料和运行费用，同时也减少了环境污染，而成为实现绿色化学的有效途径之一。 反应物质的体积减少也使具有一定毒性、放射性和爆炸反应的危险性变得微不足道。 ( 3 ) 微分析或反应系统易实现集成化、自动化。用微加工技术制作的微流控芯片 东北大学硕士研究生学位论文 第一章引言 部件的微小尺寸使多个部件与功能有可能集成在数平方厘米的芯片面积上。在此基础上 易制成功能齐全的便携式仪器。 上述优点可带来巨大的经济与社会效益。例如可以使化学分析和新药物的研发与合 成的速度大幅度提高，成本下降；化学与生物检验仪器可大范围普及等等。近年来，秉 承微流控芯片分析的上述优点，科研工作者对基于微流控芯片检测方法进行了广泛的研 究。 1 1 3 微流控芯片检测方法 微流控芯片检测器的作用是测定被分析样品经微流控分析芯片系统分离或处理后 有关组分的组成及其含量。检测器的总体性能将影响整个微流控芯片分析系统的检出 限、检测速度、适用范围、体积等指标，是微流控分析芯片的重要组成部分之一，因此 有关检测方法和检测器的研究已成为微流控研究领域的一个重点和热点方向之一。 1 1 3 1 微流控芯片检测器的性能要求 微流控芯片检测器与传统的仪器分析系统相比，微流控芯片分析系统对检测器性能 有一些特殊的要求1 4 】： ( 1 ) 更高的灵敏度和信噪比。在微流控芯片分析过程中，由于可供检测物质的进 样体积微小( 微升、纳升甚至皮升级) ，且检测的区域一般非常小，所以要求检测器应 具有更高的检测灵敏度和信噪比。 ( 2 ) 更快的响应速度。由于芯片上的通道一般均较短，许多混合及分离过程往往 在很短的时间内( 秒级甚至更短) 即可完成，因此要求检测器有更快的响应速度。 ( 3 ) 特殊的结构。由于微流控芯片检测器要与芯片的微通道尺度相匹配，还要考 虑分析系统的总体微型化，所以检测器的结构、体积、重量等方面应利于集成化或至少 有利于同芯片系统的耦合。 ( 4 ) 多重微流控芯片分析的一个发展趋势就是在单个芯片上进行通道的高度集成 化，形成多个并行的分析单元或通道阵列，从而大大提高分析速度，为此还要求检测器 最好具有多重平行检测的功能。 ( 5 ) 适于便携。为适应便携式仪器的需要，要求微流控芯片检测器性能稳定可靠、 坚固耐用、体积小。 ( 6 ) 低成本。要构建实用的微流控芯片分析系统，其检测器成本要低。 1 1 3 2 微流控芯片检测器分类 基于不同检测原理的众多检测方法都被用于微流控芯片分析的研究中。微流控检测 扣；。0f毒 东北大学硕士研究生学位论文 第一章引言 器按检测原理进行分类大致可以分为光学检测器、电化学检测器、质谱检测器等，分类 ：jj 如图1 1 所示。 光学检测器 荧光检测器 吸收光谱检测器 化学发光检测器 激光热透镜检测器 发射光谱检测器 折射率检测器 电流检测器 电化学检测器r l _ 1电导检测器 质谱检测器 核磁共振检测器 电位检测器 e s i 质谱检测器 m a l d i 质谱检测器 激光诱导荧光检测器 l e d 荧光检测器 普通化学发光检测器 电致化学发光检测器 等离子体发射光谱检测 原子发射光谱检测器 图1 1 微流控芯片检测器分类【4 】 h g 1 1d e t e c t i o nm e t h o d s i nm i c r o f l u i d i cc h i p ( 1 ) 微流控芯片电化学检测器性能及优点 电化学检测作为一类常用的分析检测手段，在微流控分析系统微型化和集成化方面 有其特有的优势，这是因为1 4 】： 通过m e m s 技术在芯片上制作微电极比在芯片上力n - v _ 微光学器件容易得多； 与光学检测法不同，电化学传感的灵敏度并不会因为通道几何尺度的微型化而降 低； 电化学检测器对具有电活性的化合物具有较好的选择性。 微流控芯片的检测系统 东北大学硕士研究生学位论文第一章引言 因此作为微流控分析系统的集成化检测方式，电化学检测器具有灵敏度高、选择性 好、成本低、易微型化、样品消耗少、不受光程和样品浑浊度影响等优点。 ( 2 ) 微流控芯片电化学检测器分类 电化学检测法采用电极作为传感单元，可直接将溶液组分的电化学信号转变为电信 号。根据电化学检测原理不同，可分为安培检测器、电导检测器和电位检测器。 安培检测器 安培检测【5 ，6 】是根据待测物在恒( 或脉冲) 电位工作电极上发生电化学反应时所产 生的氧化电流或还原电流对待测物进行定量的检测方法。它的灵敏度接近激光诱导荧光 法，可以选择性地检测具有电活性的物质，而对于无电活性的化合物，可以采用间接安 培法检测。 安培检测法是微系统中应用最广泛的一种电化学检测技术，它检出限低、选择性高， 适用于电活性物质的痕量测定。自1 9 9 8 年w o o l l e y 等1 5 1 报道了第一例芯片毛细管电泳 的安培检测器以来，有关微流控芯片上的安培检测器报道【9 。1 6 】逐渐增多。安培检测器具 有很多优点【1 7 l ： c a ) 灵敏度高。检出限一般低于1 0 - 7 m o l l ，且对各类电活性物质灵敏度差别很小。 ( b ) 选择性高。适用于电活性物质的痕量测定。出于每种物质的氧化还原反应电 位不同，可控制电极电位提高选择性。 ( c ) 线性范围宽。一般是个数量级，有的可达6 个数量级。 ( d ) 结构简单。与光学检测方法相比，因为无需复杂的光学器件，无避光要求， 从而结构上比较简单，造价和使用成本相应降低。 ( c ) 检测池体积小，噪声低，响应速度快。 但是，安培检测器的测量原理本身也决定了它固有的局限性与不足： ( a ) 安培检测法不是通用的检测方法，它要求测定对象在所选用的电极上具有电 化学活性。 ( b ) 安培检测器采用的流动相必须有常用浓度范围内( o 0 1m o 1t o o l l ) 的 电解质存在，且安培检测器对流动相的流速、温度、p h 值等因素的变化比较敏感。 ( c ) 测量还原电流时，流动相中痕量的氧也可能发生电解反应，引起干扰。 ( d ) 由于电极表面可能发生吸附、催化氧化还原等现象，因此都有一定的寿命。 目前还没有一种通用和可靠的方法能使电极表面完全再生，需要经常清洗或更换。 电导检测器 电导检测法1 7 1 是根据带电组分对溶液电导率的贡献而进行检测的。它不要求待测组 辑i，| 螺”日 东北大学硕士研究生学位论文第一章引言 分在电极上具有电化学活性，只要是离子型组分都能检测。但由于溶质离子是以溶液为 背景，即它以高电导溶液为背景来测量因溶质离子存在而产生的电导微小变化，因此灵 敏度较低。电导检测器适于检测无机离子、氨基酸、药物等物质，其中以对无机离子的 研究比较多。 电位检测器 电位检测1 8 】是利用待测离子透过选择性膜时会产生膜电位的原理进行检测的，它对 离子特别是部分金属离子有较宽的线性范围和较高的灵敏度。但是，电位检测器不易于 微型化。 1 2 生物传感器 1 2 1 生物传感器概述 生物传感器是在生命科学和信息科学之间发展起来的一个交叉学科，在科学研究、 工业生产乃至人们的生活中起着很重要的作用，它是由生物学、化学、物理学、医学、 电子技术等多种学科互相渗透成长起来的，具有灵敏度高、选择性好、成本低、分析速 度快、能在复杂体系中在线连续监测等优点，能提供有效而快速的分析手段代替传统的 实验室技术，从而为生物医学、环境监测、食品医药工业及军事医学领域直接带来新的 技术革命。随着现代电子技术和生物技术的迅速发展，生物传感器的种类和数量迅速增 加，为了规范该领域，国际纯粹与应用化学联合会( m p a c ) 推荐了一个非常严格的定 义：一个生物传感器应是一个独立的、完整的装置，通过利用与换能器保持直接空间接 触的生物识别元件( 生物化学受体) ，能够提供特殊的定量和半定量分析信剧1 8 1 。 酶传感器作为第一代生物传感器在国内外得到了深入的研究，并已在医学、生物工 程和军事等领域中得到了广泛地应用。在酶传感器中，电化学传感器是最为常用的换能 装置，它具有灵敏度高、体积小和响应时间快等特点，且制作技术相对成熟【1 9 l 。 1 2 2 生物传感器原理 生物传感器是包括两个彼此密切联系的生化和物理换能器的体系，它能将被测物的 浓度与可测量的电信号关联起来，其原理如图1 2 所示。被测物质通过扩散进入生物敏 感膜层，经分子识别、发生生化反应后，所产生的信息被相应的物理换能器转换成与被 测物浓度相关的电信号。 东北大学硕士研究生学位论文第一章引言 被测物 生物敏感膜 生物组分 产物反应物 或物理性质 物理换能 器电极 与被测物浓度 有关的电信号 图1 2 生物传感器原理示意【硼 f i g 1 2t h e o r yd i a g r a m o fb i o s e n s o r 电化学生物传感器是指由生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素等) 或生物体本身( 细 胞、细胞器、组织等) 作为敏感元件，电极( 固体电极、离子选择性电极、气敏电极等) 作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。以葡萄糖电化学酶生物传感器 为例，根据酶与电极间电子转移的机理可以划分为以下三代： i ( 1 ) 第一代酶生物传感器 1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 2 1 】在氧电极的基础上提出了研制葡萄糖生物传感器的原理， 用一薄层葡萄糖氧化酶覆盖在氧电极表面，通过氧电极检测溶液中溶解氧的消耗量可以 间接测定葡萄糖的含量。1 9 6 7 年u p d i k c 和h i c k s 2 2 根据此原理成功地制成了世界上第 一支葡萄糖生物传感器，这可称为第一代生物传感器。从此以后，基于酶电极的电流型 生物传感器得到了迅速的发展。经典的电流型生物传感器，葡糖酸( c 1 5 h 1 2 0 7 ) 和过氧 化氢( h 2 0 2 ) ，h 2 0 2 在电极表面( + o 6v ，vs a g a g c l ) 发生氧化电化学反应产生电流， 反应式如下： 酶层：g l u c o s e + g o d ( o x ) - ，g l u c o n l a t o n e4 - g o d ( r e d ) g , o d ( r e d ) + 0 2 - - g o d ( o x ) + 8 2 0 2 电极：h 2 0 2 - - 0 24 - 2 h + 4 - 2 e 其基本原理【2 3 】如图1 3 所示。反应结果为0 2 浓度减小，h 2 0 2 浓度增大。可以通过 0 2 含量的减少或生成的h 2 0 2 浓度的增加来检测底物葡萄糖含量。由于检测易受环境中 氧分压波动的影响，响应时间较长且难以进行活体分析，灵敏度也不高。于是人们又选 择了反应产物h 2 0 2 的直接测定。葡萄糖浓度越高，过氧化氢产物越多，产生的电流越净 大，电极响应电流与葡萄糖浓度呈正相关。h 2 0 2 在金属电极和碳电极上氧化的过电位i 均较高，一般在铂电极上为( + 0 6 - - , + 0 8v ) 、在玻碳电极上为0 9v 、在涂有铂、钯、 寸 钌的碳糊电极上为0 8v 等。这样高的检测电位使试样中共存的抗坏血酸、尿酸、乙酰 氨基酚等其他电活性物质产生干扰。 乎，：，。： 东北大学硕士研究生学位论文第一章引言 稀j “。+ ，葡萄糖+ 0 2 o j 葡糖酸+ h 2 0 2 0 2 + w 里皂 、 电极 e 图1 3 第一代酶生物传感器电子转移机理【2 3 】 f i g 1 3m e c h a n i s mo fe l e c t r o nt r a l l s f c rf o rt h ef i r s tg e n e r a t i o ne i l z y i e 屺b i o s e n s o r s ( 2 ) 第二代酶生物传感器 针对第一代酶生物传感器的缺点，第二代酶生物传感器引入电子传递媒介体，氧化 酶在氧化底物的过程中变为还原态的酶，还原态的酶还原氧化态的介体使其变为还原态 “ 的介体，还原态的介体在电极上氧化，产生电流信号，这一类传感器是目前研究较多的 一类传感器，且已部分实现了商品化，克服了以分子氧作为生物氧化还原反应的电子受 体。第二代葡萄糖生物传感器就是基于电子传递媒介体的电流型生物传感器，采用人工 电子受体代替o 雄1 2 0 z 在酶反应和电极之间进行电子传递，以葡萄糖生物传感器为例： 酶层：g l u c o s e + g o d ( o x ) - * g l u c o n l a t o n e + g o d ( r e d ) 岳 修饰层：g o d ( r e d ) + m ( o x ) - - g o d ( o x ) + m ( r e d ) 电极：m ( r e m ) - + m ( o x ) + n e 其原理如图1 4 所示电子传递媒介体的作用是促进电子传递过程，降低工作电势， 以排除其他电活性物质( 如抗坏血酸、尿酸等) 的干扰，提高了测定的灵敏度和准确性。 介体r e d 介体o x 葡萄糖 葡糖酸内酯 图1 4 第二代酶生物传感器电子转移机理 f i g 1 4m e c h a n i s mo fe l e c t m nt t a l l s f c rf o rt h es e c o n dg e n e r a t i o ne l l z y l i 地b i o s e n s o r s 最初是将电子传递媒介体加入到底物溶液中，降低了工作电位，减少干扰；但不能 循环使用，且不适于特殊环境下( 活体检测) 操作，目前多是将其修饰于电极上。优良 a 东北大学硕士研究生学位论文第一章引言 的电子传递媒介体应具备如下性质【刎： 可与酶的氧化还原辅基快速反应，提高响应电流密度； 能吸附或滞留在电极表面； 呈现可逆的电极反应动力学； 具有较低的氧化还原电位，并与p h 无关； 氧化还原形式能稳定存在； 对氧惰性或非反应活性； 。 具有生物兼容性，无毒性。 目前用于生物传感器研究的电子传递媒介体可分为小分子媒介体和高分子媒介体。 7 小分子媒介体主要包括：二茂铁及其衍生物1 2 - 2 9 1 ：染料类如亚甲基绿例、麦尔多拉蓝 刚、亚甲基蓝【3 、靛酚类【3 2 1 等；对苯二酚嘲、醌及其衍生物l 蛸l ；四硫富瓦烯( t t f ) 及其衍生物鲫和导电有机盐刚等。高分子媒介体主要包括变价过渡金属离子螫合物型 高分子媒介体如锇的吡啶配合聚合物1 3 9 1 等。小分子媒介体如二茂铁、铁氰酸盐等易扩散 进入溶液而流失造成传感器稳定性差，高分子媒介体经常是将小分子媒介体插入或键合 到高分子载体的链上，由于它的高分子链间的互相缠绕或交联可防止流失，但也有可能 造成慢的电子转移速率，使响应时间延长。不同的电子传递媒介体对不同的酶反应电催 化的工作电位不同，响应的电流密度也不同。 ( 3 ) 第三代酶生物传感器 该类传感器是人们在生物传感器的构建中想要达到的最简单形式，即实现酶和电极 之间的直接电子转移。这种传感器与氧或其它电子受体无关，无需媒介体，即所谓无媒 介体传感器。但是由于生物酶分子结构的原因，酶与常规电极间的直接电子传递较为困 难，对于分子量较大的酶( 如葡萄糖氧化酶) ，这种直接电子传递很难发生。归纳起来 能实现酶直接电化学的方法有四种【柏】： 使用电子转移促进剂； 化学修饰形成电子转移中继体； j 酶吸附在电极表面的直接电化学； 酶固定在导电聚合膜内的直接电化学。 以葡萄糖传感器为例说明第三代酶传感器的检测反应式如下： 酶层：g o d ( o x ) + g l u c o s e g o d ( r e d ) + g l u c o n i ca c i d 电极：g o d ( r e d ) 一g o d ( o x ) + 耻 实现酶的直接电化学一直是生物电化学工作者努力的方向，这对于研制非媒介体的 8 一 ：“4c ? 一i ；，一、： 0 8 守i p 东北大学硕士研究生学位论文 第一章引言 酶传感器是很有意义的。到目前为止，仅有过氧化物酶【4 “3 1 、氧化酶【槔倒等少数几种分 子量相对较小的酶能够在电极上直接进行有效的电子转移。酶的直接电化学已成为生物 电化学研究最重要的发展方向之一 1 2 3 生物传感器分类 根据生物传感器的信号获取方式，可分为电化学生物传感器、光化学生物传感器【4 7 铝1 、压电生物传感驯4 9 】及热传导生物传感器1 5 0 1 。 按测量信号不同，电化学生物传感器又可分为电流型【5 1 1 、电位型【5 2 1 和电导型1 5 3 】。 电流型酶传感器的原理是利用酶对底物的催化氧化或还原，产生可在电极上还原或氧化 的组分，获得电流信号( 有时这一过程需要外加电子传递媒介体) ；电位型传感器是基 于离子选择性电极原理而发展起来的，酶对底物催化，产生离子型物质，能引起指示电 极电位变化，电位变化关系遵循能斯特方程；电导型传感器利用酶催化底物反应，导致 反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶液导电性的改变，以溶液电导率为响应 信号。 生物传感器按其分子识别元件，可分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生 物传