遗传病的诊断PPT课件.ppt

医学遗传学,1,遗传病的诊断DiagnosisofGeneticDisease,2,第一节临症诊断和症状前诊断,临症诊断（symptomaticdiagnosis）是根据患者的各种临床表现进行检查、确诊和判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内容。症状前诊断（presymptomaticdiagnosis）则是对遗传上异常的个体采用各种措施，使他们在出现症状前从遗传上予以确认。,3,一、病史、症状和体征病史症状与体症,4,二、家系分析根据对患者及家族成员发病情况的调查结果绘制系谱，大大有助于区分单基因病和多基因病，以及遗传方式。,5,三、细胞遗传学检查细胞遗传学检查，即染色体检查与核型分析，是应用较早的遗传病诊断手段。随着显带技术，特别是高分辨染色体显带技术的出现和改进，能够更准确地判定和发现更多的染色体畸变，确诊新的微小畸变综合征。,6,四、生化检查生化检查是遗传病诊断中的重要辅助手段，包括临床生化检验和针对遗传病的特殊检查，主要是对由于基因突变所引起的酶和蛋白质定量和定性分析，对单基因病和先天性代谢病进行诊断。,7,五、基因诊断利用分子生物学技术，检测DNA、RNA结构或基因表达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称为基因诊断。,8,第二节产前诊断和植入前诊断,产前诊断（prenataldiagnosis）是以羊膜穿刺术和绒毛取样等技术，对羊水、羊水细胞和绒毛进行遗传学和生化检查分析，对胎儿的染色体和基因进行分析诊断，是预防遗传病患儿出生的有效手段。,9,一、产前诊断的对象夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或生育过染色体病患儿的夫妇；35岁以上的孕妇；夫妇之一有开放性神经管畸形，或生育过这种畸形患儿的孕妇；夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇；X连锁遗传病致病基因携带者孕妇；有习惯性流产史的孕妇；羊水过多的孕妇；夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。,10,二、产前诊断的方法产前诊断的常规方法有无创性和有创性两类，无创性方法有B超检查，孕妇血液与尿液检测，CT、X线和核磁共振等；有创性方法有羊膜穿刺、绒毛取样和胎儿镜等。,11,B超是一种相对安全无创的检测方法，是首选的诊断方法，能够详细检查胎儿的外部形态和内部结构，可对多种遗传性疾病进行早期诊断，这些疾病包括，神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇、腭裂，颈部淋巴管瘤；先天性心脏病；支气管、肺部发育异常，胸腔积液；肢体缺陷；先天性单侧肾缺如、多囊肾；先天性幽门狭窄、先天性巨结肠等。,12,羊膜穿刺技术是产前诊断的基本方法之一，即在B超的监护与引导下，无菌抽取胎儿羊水，对羊水中的胎儿脱落细胞培养，进行染色体、基因和生化分析。例如，羊水中甲胎蛋白浓度过高时，提示胎儿可能有脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等异常。羊膜穿刺操作一般在妊娠1517周进行，发生感染、流产及其他妇科合并症的风险相对较小（约1%）。,13,羊膜穿刺示意图,14,绒毛取样法在妊娠早期诊断中最为常见，一般于妊娠1011周进行。该技术也是在B超监护下，用特制的取样器，从孕妇阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁到达取样部位后，吸取绒毛枝。绒毛取样的优点是检查时间早，根据检测结果认为有必要进行选择性流产时，给孕妇带来的损伤和痛苦相对较小。缺点是取样标本容易被污染，胎儿和母体易感染和操作不便等，引起流产的风险是羊膜穿刺法的2倍。,15,绒毛样本可用于诊断染色体病，代谢病，胎儿性别鉴定，生化检测和DNA分析。,绒毛取样法示意图,16,脐穿刺是在B超的监护下，用细针经腹壁、子宫壁进入胎儿脐带，并抽取胎儿血液样本进行诊断。本方法适宜妊娠18周进行，常作为因错过绒毛或羊膜穿刺取样最佳时机，或羊水检查失败的补救措施，还可检测胎儿血液系统疾病，先天性免疫缺陷等。,17,胎儿镜检查又称羊膜腔镜或宫腔镜检查。宫腔镜进入羊膜腔后，直接观察胎儿是否有畸形、性别和发育状况如何，可以同时抽取羊水或胎儿血样进行检查，还可进行宫内治疗。因此，理论上这是一种最为理想的方法。但由于操作困难和易引起多种并发症，目前还不能被广泛接受。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠1820周。,18,分析孕妇外周血中的胎儿细胞以及游离的胎儿DNA或RNA利用妊娠期少量胎儿细胞可以通过胎盘进入母体血液中这一现象，采用流式细胞仪分离、磁激活细胞分选、免疫磁珠法、显微操作分选法以及分子细胞遗传学技术等，分离和分析胎儿有核细胞以及血清中游离的胎儿DNA或RNA，从而进行无创性基因诊断。,19,三、植入前诊断PGD技术是指在体外受精的胚胎，发育到48细胞期，通过显微操作技术取出单个卵裂球细胞，应用PCR、FISH等技术进行快速的遗传学分析，包括染色体检查、特定基因检测，性别鉴定，正常的胚胎植入母体子宫。,20,第四节分子诊断,利用分子生物学技术，检测DNA、RNA结构或基因表达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称为基因诊断（genediagnosis）。,21,1978年，华裔美国学者简悦威（Yuet-WaiKan）首次采用DNA重组技术对血红蛋白病进行产前诊断，开创基因诊断的先河。目前，基因诊断早已进入欧美各国的临床应用，不仅针对遗传性疾病，而且用于对一些感染性疾病和肿瘤的诊断。,22,基因诊断具有以下特点：以特定基因为目标，检测基因的突变和表达信息，特异性强；采用分子杂交技术和PCR技术具有信号放大作用，微量样品即可进行诊断，灵敏度高；可用于尚无出现临床表现前，胎儿的出生前诊断，群体筛查等，应用广泛；检测样品获得便利，不受个体发育阶段性和基因表达组织特异性的限制。,23,一、基因诊断的主要方法基因诊断主要采用核酸分子杂交、PCR和DNA测序等技术。,24,核酸分子杂交技术是检测样品中是否存在相应的基因以及相应基因的表达状态等。其中Southern印迹法主要用于基因组DNA的分析，Northern印迹法用于检测样品中RNA的种类和含量。,25,斑点印迹杂交把待检测的核酸样品点在尼龙膜上，变性后与标记的探针进行结合反应，经过显色和显影后检测杂交信号的强度，与对照比较后确定所测核酸量的高低。根据尼龙膜上所点核酸样品的种类不同，分为DNAdotblotting和RNAdotblotting。,26,原位杂交把组织或细胞样品经过适当处理，用探针与核酸进行杂交。这种方法不需要提取核酸，可以确定被检核酸在组织或细胞，以及中期染色体上的定位，具有重要的生物学和病理学意义。,27,PCR-ASOASO为等位基因特异性寡核苷酸杂交法的简称。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检测者样品中的DNA分子进行杂交，根据样品与两种探针杂交信号的强弱，确定是否存在基因突变，判断被检者是突变基因的纯合体或杂合体。,28,29,基因芯片技术基因芯片技术是近年来发展迅速的大规模、高通量分子检测技术。基本过程是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片或尼龙膜等，形成矩阵点。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后与待测样本进行杂交反应，再通过激光共聚焦荧光显微镜对芯片进行扫描，经计算机系统分析处理所得资料，对上千种甚至更多基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。,30,基因芯片可以进行微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理有价值的生物样品，精细地研究各种状态下分子结构变异，了解组织细胞基因表达情况。既可检测基因的多态性，又能检测基因突变，特别适用于多个基因、多个位点的同时检测。这一技术目前处于发展和优化阶段，已经有多种针对遗传性疾病、肿瘤检测的基因芯片用于临床诊断。,31,其他常用的技术PCR-RFLPPCR利用一对或数对特异性引物，将目标DNA扩增；酶切利用某些限制性内切酶消化PCR产物，如PCR产物中含有相应的酶切位点序列，DNA链则被切开；电泳利用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离酶切后的PCR产物，根据电泳图谱判断结果。,32,PCR-SSCP当双链DNA变性为两条单链后，各自会在中性条件下形成各自特定的空间构象，因而在电泳时将在不同的位置上出现各自电泳条带。如果DNA序列发生变化，甚至只有一个碱基变化，空间构象也有可能发生变化，电泳条带也随之变化。,33,PCR-SSCP,34,RT-PCR以mRNA为模板合成cDNA，再进行PCR，用于基因表达水平的检测和分析。,35,DHPLC即变性高效液相色谱分析（denaturinghigh-performanceliquidchromatography）几乎为每一个基因诊断室所必备。DHPLC用于DNA序列变异的检测，其本质上是用离子对反相HPLC进行DNA杂合双链片段分析。,36,Westernblot法Westernblot印迹技术是检测特定蛋白质的方法，可用于某种与遗传病相关的蛋白质定性定量分析。如假肥大型肌营养不良（DMD）患者基因缺陷使肌细胞的dystrophin蛋白合成异常，采用Westernblot法可对患者dystrophin蛋白进行检测。,37,二、基因诊断技术的应用基因诊断在遗传病中的应用例如：镰状细胞贫血的基因诊断酶解正常人DNA和患者DNA，用标记的珠蛋白基因为探针作Southern杂交,38,镰状细胞贫血的基因诊断限制性内切酶Mst切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.1kb珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于AT破坏了Mst的位点，便形成1.3kb珠蛋白的DNA片段。,39,例如：血友病A的基因诊断PCR技术与RFLP相结合的方法。首先用PCR技术将包含突变DNA的片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶解，电泳后直接检测多态性位点的状态。,40,基因诊断在肿瘤中的应用ras基因突变的检测ras基因突变的检测可采用PCR-ASO方法进行，已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子。p53基因的检测目前常用PCR法进行检测p53突变的