实用流式细胞技术及其样品处理ppt课件

实用流式细胞技术及其样品处理,FACSAria(FACSDiva),1,流式细胞术基本原理在不同领域的应用样品及其前处理,2,一、流式细胞术基本原理,3,最大特点：单细胞水平的分析,4,Detector,单细胞液流柱的形成,5,利用流式细胞术可以获得哪些信息,细胞的相对计数、绝对计数细胞成分的相对定量、绝对定量单参数或多参数细胞表面、细胞内成分可溶性成分流式分子表型,6,流式细胞术可以产生哪些信号,细胞的物理参数：散射光,细胞的理化参数：荧光,7,散射光信号,前向角散射（FSC）：与球形细胞直径的平方密切相关。侧向角散射（SSC）：对细胞膜、细胞质的折射率敏感。对细胞质内较大的颗粒也有反映。用来获取有关细胞内部精细结构和颗粒性质的有关信息。,8,9,Laser,FSC,SSC,Monocyte,Lymphocyte,Granulocyte,FSC,SSC,10,荧光信号,11,单标样品,12,Laser,42%positiveAntigenA,58%negativeAntigenA,FL2,FSC,13,双标样品,14,Laser,Logfluorescence(green),Logfluorescence(red),A+(%),B+(%),A+B+(%),neg.(%),FSC,FL1,FL2,15,Histogram,DotPlot,ContourPlot,Pseudo3-dimensionPlot,3-dimensionPlot,Unimodalorbimodal,16,道数（channel）荧光强度坐标不等距,17,“Particle”canbeusedasamoregeneraltermforanyoftheobjectsflowingthroughaflowcytometer.“Event”isanythingthathasbeeninterpretedbytheinstrument,tobeasingleparticle,correctlyorincorrectly.Eachmeasurementfromeachdetectorisreferredtoasa“parameter”.Dataarestoredinso-calledflowcytometrystandard(FCS)format.Datastoredononecytometermaynotbeanalyzableonsoftwarefromanothercytometer.,18,细胞分选,19,分选纯度分选产率,20,21,厂家、型号、激光器、滤光片、软件,22,23,24,25,460500540,460500540,460500540,SP500,LP500,BP500/50,LongpassShortpassBandpass,滤光片,26,二、在不同领域的应用,27,细胞周期分析细胞功能分析细胞凋亡分析免疫学领域其他领域,28,（一）细胞周期分析,29,30,CellularDNAcontent,必须用RNase去除RNA,31,DNA合成-BrdUIncorporation,32,增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）:参与DNA复制和核酸的切补修复（excisionrepair）的一种蛋白增殖相关抗原（proliferationrelatedantigen）：Ki-67，Ki-S1细胞周期蛋白：CyclinD1,E,A,B1,33,（二）细胞功能分析,细胞活性分析细胞膜电位线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A6细胞内Ca2+胞浆内pH活性氧（ROS）,34,1、细胞活性分析,根据对细胞膜的渗透性不同来区分活/死/凋亡细胞：PI，EB，7-AADandHoechst33342,35,2、细胞膜电位,由于细胞膜上各种泵的作用，如钠钾泵、钙泵等，使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度，造成细胞膜电位,36,3、线粒体膜电位（MMP）,线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学位能储存于线粒体内膜。JC-1可进入细胞内，特异地与线粒体内膜结合，其聚集程度随MMP升高而增加。,37,4、线粒体膜蛋白抗原7A6（38kDa）,凋亡早期的反应，早于形态学、光学特征变化及台盼蓝染色,38,5、细胞内Ca2+,浓度上升，与两种情况有关。一是与细胞活化，二是细胞膜完整性遭到破坏，可作为细胞凋亡或坏死的标志。,39,6、胞浆内pH,活细胞内pH变化范围较小。某些生物学过程，如细胞分裂及对细胞信号的应答，会出现pHi的变化。增殖细胞比静止期细胞偏碱性。,40,7、活性氧（ROS）参与细胞生长、发育、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。,DCFH-DA本身没有荧光，在细胞内转化成DCFH。在ROS作用下，氧化为绿色荧光物质DCF。其荧光强度与细胞内ROS水平成正比。,41,（三）细胞凋亡分析,42,43,1、散射光信号的变化,44,2.DNA含量,45,3、磷脂酰丝氨酸外翻（Phospholipidredistribution）,46,4、Caspases-3的激活,47,凋亡晚期，核酸内切酶活化，双链DNA会出现许多不对称断裂点，产生一系列的3末端。TdT酶能够催化外源性荧光素-dUTP连接到DNA的3末端。尽管坏死细胞的细胞核DNA也在降解，末端也增多。但这种随机的降解所产生的末端较难与荧光素-dUTP结合。因而，坏死的细胞进行TUNEL反应观察不到荧光。,5.TUNEL,48,49,6.p53,53kDa的核内磷蛋白，在细胞周期中，控制着细胞在DNA损伤无法修复时启动细胞的“自杀”过程。P53突变或缺失是多种肿瘤发生的重要原因。,50,（四）在免疫学领域的应用,51,52,NK细胞中有CD8+细胞;少量的单核细胞也能表达CD4;结合淋巴细胞绝对数来看待某一亚群百分比的改变。,1、淋巴细胞亚群分析,评价机体的免疫状态：自身免疫、免疫缺陷等,53,54,Nave/MemoryTlymphocyte,刚从胸腺移出到外周循环的Naive细胞，首次遇到抗原时，增殖反应强，产生细胞因子能力弱。当Memory细胞遇到同类抗原时，产生大量的细胞因子，而不是增殖反应。NaiveT细胞高表达CD45RAhi、CD62Lhi。MemoryT细胞表达CD45RO，一般不表达CD45RA从Naive向Memory细胞转化过程中，CD11a表达增加、CD62L（L-selectin）表达丢失。,55,Th1/Th2lymphocyte,T细胞根据其分泌的细胞因子分为两型。Th1类细胞分泌IL-2,IFN-和TNF-，参与细胞免疫，对抗胞内病原体，如病毒；Th2类细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10与IL-13,参与体液免疫，对抗胞外感染，如寄生虫。,56,Mouse,57,chicken（42d）,58,chicken（42d）,59,2、细胞表面活化抗原的表达,60,61,3、细胞因子分析,62,CBA（CytometricBeadsAssay）分析液体样本中可溶性成分,用一系列荧光强度不同的微球同时分析样本中多种可溶性成分。每种微球大小一致，分别包被有适合于特定分析的特异性抗体。所有分析只需一组标准曲线，检测的线性范围宽（0-5000pg/ml）,captureAb,FluroescentdetectionAb,63,64,HumanTh1/Th2CytokineCBA,65,细胞膜表面的细胞因子分析,66,67,将细胞表达的细胞因子阻断在细胞内,68,69,CESEstainingcellprotein,4、细胞分裂,70,PKHlipophilic(亲脂性)dyethatinsertsintothelipidbilayeroftheoutermembrane.,71,通过分析，可以计算分化前体频率（precursorfrequency）,72,评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡，CTL介导的裂解功能的抑制。,5、CTL功能分析,FluorogenicCaspaseSubstrates检测CTL介导的靶细胞凋亡,73,Intheuncleavedsubstrates,fluorescenceisquenchedowingtotheformationofintramolecularexcitonicdimers.,Oncleavageofthepeptidesbyspecificcaspases,thefluorophorefluorophoreinteractionisabolished,leadingtoanincreaseinfluoresence.,74,只要合成各种特异性抗原，即可定量体内抗原特异性CTL。,6、抗原特异性T淋巴细胞的分析,75,其他领域的应用,76,具有细胞壁的细胞及其细胞壁的主要成分：植物细胞（纤维素）、细菌（肽聚糖）、真菌（几丁质）细菌的大小、质量、核苷酸和蛋白含量等大约是哺乳动物细胞的1/1000。信号强度低，限制了检测的精确度。细菌吸收和排除染料、药物等受细胞壁结构和孔、泵的影响。,G+：一般不需要额外的处理，便可以吸收大量的试剂。也有例外，如：Walberg等发现，吸入不同的核苷酸染料，也有不同的变化。G-：细胞膜排斥多数亲脂性或疏水分子，如cyanine染料。EDTA等破膜后，可使亲脂性化合物穿透细胞膜，但是，破膜后的特性与自然状态不同。,77,X4550，X4550(pVAX1-trc-DsRed)，X4550(p3334-DsRed),X6212(p3334-DsRed)，Xa(pVAX1-trc-DsRed),DsRed在不同重组菌中的表达,78,体外细菌感染效率,79,病毒感染细胞的检测,80,流式分子表型（Molecularphenotyping）,FCM-PCR-FISH：细胞中HIV特异性DNA或RNA,如：测定端粒长度,81,三、样品及其前处理,82,颗粒：细胞单细胞悬液，避免任何细胞沉积荧光标记仪器的限制：激光器、滤光片-荧光素实验的限制：荧光素组合,总的要求,83,1、细胞大小,所有的细胞均需要经过过滤：200（75m）-300（45m）-400（37m）目,84,2、细胞物理参数的变化,不同的处理和固定方法也可能造成FSC信号的改变。另外，非球形细胞（禽类红细胞）由于其在液流中空间取向不同，也可能导致对同种细胞的FSC信号完全不同。在可能的情况下，尽量用荧光参数来设门。,85,3、设门,散射光设门：注意细胞形态的变化,荧光设门：要明显区分阴、阳性细胞,86,4、荧光补偿,87,需要用单标样品来调节荧光补偿,88,5、红细胞的影响,溶血：不影响表面抗原的标记，常用标记后溶血,89,6、洗涤效果,90,7、标记效果,91,胞内抗原（IC：同型对照）,表面抗原（标记荧光和自发荧光）,改变抗体的量是改变浓度而不是体积,lessthanorequalto0.5gpermillioncellsina100vltotalstainingvolume,92,避光标记同一实验尽量用同厂家、同批次高质量抗体。按照说明，标记试剂一般不能冻存慎用未经FCM鉴定的抗体首选直标，间标有时效果不好,93,8、实验对照的设计,空白对照阴性对照：常用同型对照单色分析：同型对照多色分析：同型对照、单阳性对照同型对照：与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。阳性对照：检测阴性时Fc受体的阻断：与抗体匹配的动物的血清或IgG。,94,9、细胞数量,统计学意义计数：106数量级/0.1-0.5ml非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞需要分析的细胞至少要大于500个。DNA分析的样品要大于10000个。,95,荧光强度与结合位点数量成正比（可用百分数和荧光强度表示）,10、单个细胞成分的定量,96,DCFH染色检测活性氧的产生（多用荧光强度表示）,97,11、仪器每次开机的状态都会有一些差异，每次处理的样品也会有所不同，仅有细微差别的实验要在同一次实验过程中完成。,CMF-DA标记检测细胞内酶的活性,98,12、检测速度,通过改变液流的直径来改变检测速度，液流流速不变。,99,默认为一个细胞荧光强度升高对于细微差别的比较，结果影响较大DNA样品可用双联体辨别模式（DDM）区分,13、样品中的细胞聚集和碎片要尽量少,100,Time,Voltage,Time,Voltage,根据细胞通过激光照射点的时间，将光信号成比例的转变成电信号,101,102,14、细胞的活性,抗凝剂：肝素避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程。PI排除死细胞,103,15、弱表达抗原常选用PE标记,CD8:PerCPAPCFITCECDPC5PE,104,16、胞内染色,105,胞膜和胞内同时表达的抗原:分别作表面和胞浆内染色。在检测胞浆内抗原时，表面表达必须被控制或视为阴性。固定破膜不能影响抗原属性或抗原抗体结合率。先固定后染色可能会使表面抗原丢失或改变。固定：蛋白的交联和变性。破膜：细胞膜穿孔。1皂甙同时测定表面、胞内Ag和DNA含量：膜胞内DNA。膜抗体荧光素不被破膜剂损坏，对胞内抗体，要保证荧光素分子足够小，能进入胞内。,106,17、DNA分析,RNA酶处理前后的比较,107,18、酵母菌的自发荧光,108,19、细胞