（应用化学专业论文）竹红菌素胺基衍生物的合成及其光动力作用的研究.pdf

哈尔滨工程大学硕士学位论文 摘要 竹红菌素是从竹红菌中提取出来的一类天然光敏色素，属于花醌类衍生 物。它是一种新型的光敏剂，对恶性肿瘤及病毒都有明显的杀灭作用，有望 成为抗肿瘤和抗病毒的新型光疗药物。本文对竹红菌素主要进行了以下几个 方面的研究。 ， f1 将竹红菌素应用于光动力疗法所面临的困难之就是竹红菌素本身在光 疗窗1 2 1 ( 6 0 0 9 0 0 纳米) 的吸收极弱。在温和的反应条件下，合成了三种 新型的胺基化竹红菌乙素，利用核磁氢谱、红外光谱和质谱确定出了主要 产物的结构，反应均在2 位或l l 位进行。吸收光谱显示，这三种竹红菌 素的胺基化衍生物的吸收峰都红移进入到了光疗窗口( 6 0 0 9 0 0 纳米) 以 内。 2 通过测定这三种胺基化竹红菌素在正辛醇和磷酸盐缓冲溶液中的脂水分 配系数，发现它们的水溶性大大增强，同时保留了很好的脂溶性。这就有 望解决光动力疗法中药物制剂难的问题。 3 以4 6 0 纳米为激发波长，检测了这三种胺基衍生物的荧光光谱。结果发现， 一个新的荧光峰( 7 0 0 纳米左右) 出现了，同时胺基的引入降低了它们的 荧光强度。我们认为该新的荧光峰与胺基和醌羰基之间的分子内电子转移 有关。 4 用顺磁共振( e p r ) 的自旋捕获技术研究了这三种新型的胺基化竹红菌素 衍生物活性氧的产生。结果表明，它们产生单重态氧和超氧负离子自由基 的能力都低于母体乙素。可能是由于胺基的引入发生了分子内的电荷转 移，破坏了竹红菌素母体的分子内质子转移过程。 5 。研究了正丁胺基取代竹红菌素和乙二胺基取代竹红菌素的吸收光谱和荧 哈尔滨工程大学硕士学位论文 光光谱，并与母体乙素进行了比较。实验表明竹红菌素长波方向的吸收及 其荧光发射来源于分子内的质子转移过程。胺基的引入扩展了其吸收光谱 和发射光谱，显著的溶剂依赖型表明胺基化竹红菌素在长波方向上的吸收 j m 4 和发射均来源于分子内的电荷转移过程。y ， 关键词：光动力疗法j 竹红菌素；胺基取代竹红菌素；两亲性；活性氧 哈尔滨 j 程大学硕士学位论文 a b s t r a c t h y p o c r e l l i n s ，i s o l a t e df r o mt h ep a r a s i t i cf u n g u sh y p o c r e l l ab a m b u a s es a c c ， a r ee f f i c i e n tp h o t o t h e r a p e u t i c a g e n t sa n dp h o t o s e n s i t i z e r s s t u d i e si n d i c a t e t h a t t h e yh a v es i g n i f i c a n ta n t i - t u m o ra n da n t i v i r a la c t i v i t i e s i nt h i sp a p e rt h e yh a v e b e e ni n v e s t i g a t e di nt h ef o l l o w i n g r e s p e c t s 1 o n eo ft h ed e f i c i e n c yt h a tl i m i t sh y p o c r e l l i n s u s ei np h o t o d y n a m i c t h e r a p y i s t h a tt h e yd on o td i s p l a y s u f f i c i e n t l ys t r o n ga b s o r p t i o ni np h o t o t h e r a p e n t i c w i n d o w ( 6 0 0 9 0 0 n m ) ，i n w h i c ht i s s u e p e n e t r a t i o n i sm a x i m a l w e s y n t h e s i z e dt h r e en o v e la m m o n i a t e dh y p o c r e l l i nbd e r i v a t i v e sb yt h em i l d r e a c t i o n s 。t h e i rs t r u c t u r e sw e r ec h a r a c t e r i z e dw i t hp r o t o nn u c l e a rm a g n e t i c r e s o n b l c es p e c t r a ，i n f r a r e ds p e c t r aa n dm a s ss p e c t r a t h es u b s t i t u t i o no c c u r s a t p o s i t i o n2o r 11o fh y p o c r e l l i nb t h eu v - v i sa b s o r p t i o ns p e c t r ao ft h e d e r i v a t i v e sw e r em e a s u r e da n dt h en e wa m i n o s u b s t i t u t e d h y p o c r e l l i n s s h o w e ds t r o n g a b s o r p t i o n i nt h ed o m a i no ft h ep h o t o t h e r a p e u t i cw i n d o w ( 6 0 0 9 0 0 n m ) 2 t h e i ra m p h i p h i l i c i t i e se v a l u a t e dv at h ep a r t i t i o nc o e f f i c i e n t s ( p c ) b e t w e e n 一o c t a n o la n dp b sb u f f e ri m p r o v e dr e m a r k a b l y t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e y p r e s e r v e t h e h y p o c r e l l i n s l i p i d s o l u b i l i t y w i t he n h a n c e d w a t e r - s o l u b i l i t y , w h i c hm a ys o l v et h e p r o b l e m o fd i f f i c u l t p h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n i n p h o t o d y n a m i ct h e r a p y 3 t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao ft h e s ea m i n a t e dd e r i v a t i v e se x c i t e da t4 6 0r l i t l w e r em e a s u r e da n dan e wf l u o r e s c e n tb a n da tl o n g e rw a v e l e n g t h ( a r o u n d7 0 0 n m ) a p p e a r e d ，a l o n gw i t hd e c r e a s e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f t h ed y e sd u et o t h ei n t r o d u c t i o no ft h ea m i n o g r o u p s t h en e w f l u o r e s c e n tb a n di sc o n s i d e r e d t ob er e l a t e dt ot h ei n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e rb e t w e e nt h ea m i n og r o u p a n dt h eq u i n o n o i d c a r b o n y lg r o u p 4 t h ea c t i v eo x y g e ns p e c i e sg e n e r a t e db yt h et h r e en o v e la n a i n a t e dh y p o c r e l l i n s 哈尔滨工程大学硕士学位论文 w e r ed e t e c t e d b y e l e c t r o n p a r a m a g n e t i cr e s o n a n c e ( e p r ) s p i nt r a p p i n g m e a s u r e m e n t s t h e i rg e n e r a t i o na b i l i t i e so fs i n g l e to x y g e na n ds u p e r o x i d e a n i o nr a d i c a la r eb o t hl o w e rt h a nh y p o c r e l l i nb t 1 1 ep o s s i b l er e a s o nm a yb e t h a tt h ea d d i t i o no fa m i n og r o u pi n d u c e sf a s ti n t r a m o l e c u l a re l e c t r o nt r a n s f e r a n d d e s t r o y s i n t r a m o l e c u l a r h a t o mt r a n s f e r p r o c e s s i n p e r i - h y d r o x y p e r y l e n e q u i n o nr i n g 5 t h e a b s o r p t i o n a n df l u o r e s c e n c e s p e c t r a o f b u t y l a m i n a t e d a n d e t h y l e n e d i a m i n a t e dh y p o c r e l l i n s w e r e i n v e s t i g a t e d a n d c o m p a r e d w i t h h y p o c r e l l i n i ti s c o n f i r m e dt h a tt h el o n g e rw a v e l e n g t hb a n d so f h y p o c r e l l i n a n dt h ef l u o r e s c e n ts t a t eo f h y p o c r e l l i n a r ea l ld e r i v e df r o mt h ei n t r a m o l e c u l a r h a t o mt r a n s f e rp r o c e s sb e t w e e nt h ep e r i - h y d r o x y lg r o u pa n dt h eq u i n o n o i d c a r b o n y lg r o u p i n t r o d u c t i o no fa m i n og r o u p se n l a r g e st h ea b s o r p t i o ns p e c t r a a n df l u o r e s c e n c es p e c t r ao fh b t h ed i s t i n c ts o l v e n t s - d e p e n d e n c eo ft h e i r a b s o r p t i o na n de m i s s i o ns p e c t r ai n d i c a t e st h a tt h el o n g e rw a v e l e n g t hb a n d so f a m i n a t e dh y p o c r e l l i n sd e r i v ef r o mi n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e rp r o c e s s k e y w o r d s ：p h o t o d y n a m i ct h e r a p y ；h y p o c r e l l i n ； a m i n a t e d h y p o c r e u i n ； a m p h i p h i l i c i t y ；a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本文的所有工作，是在导师的指导下， 由作者本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文献等 引用已在文中指出，并与参考文献相对应。除文中已经注 明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 公开发表的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人 和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本 声明的法律结果由本人承担。 作者( 签名) ： e t期：年月日 哈尔滨工程大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 光动力疗法的研究进展与评述 光动力疗法( p h o t o d y n a m i ct h e r a p y ，简称p d t ) 是一种正在研究发展中 的新型临床治疗技术。它是指给人体施用光敏剂，然后光照激活光敏剂产生 活性氧，活性氧进攻并杀伤病变组织，从而达到治疗疾病的目的。光动力疗 法于2 0 世纪7 0 年代末开始用于恶性肿瘤的临床诊断和治疗研究，在抗病毒、 光动力农药方面也已有成功的应用，九十年代开始向某些常规疗法难以治愈 的良性常见病方向发展，如治疗鲜红斑痣、微血管类疾病、视网膜黄斑变性 和动脉粥样硬化等，并取得突出进展。自问世至今，世界上已有许多病人受 益于光动力疗法。 光动力疗法的优势在于它的高效性和安全性。光敏剂分子相当于催化剂， 一个光敏剂分子一分钟可产生上千个高反应活性的活性氧分子作用于靶分子： 另一方面，由于光疗中同时需要光敏剂和光的参与，可获得双重选择性，选择 性的大小取决于光敏剂在靶体组织中的分布选择性和光能的空间定位程度，这 就避免或减少了对正常组织的伤害，增加了安全性。 光动力疗法在临床癌症治疗中已取得了令人瞩目的成就，1 9 9 3 年加拿大 卫生部门首先批准将p h o t o f r i n 应用于膀胱癌和食管癌的光动力治疗，到目前 为止，光动力疗法在荷兰、法国、德国、日本和美国等国相继获得批准，还 有1 1 个欧洲国家正在寻求获得批准。光动力疗法已被公认为l | 缶床上除手术、 放疗、化疗之外的第四种治疗癌症的方法。作为一种新型疗法，与传统的 肿瘤疗法相比，具有独特的优点：( 1 ) 具有很好的选择性，能选择性地消灭 局部的原发和复发肿瘤丽不危及正常组织；( 2 ) 可与放疗和化疗同时进行且 对两者均有一定的协同作用；( 3 ) 可借以缩小手术的范围和改善手术的预后， 光疗药物的特征发射荧光可指示肿瘤的浸润程度，因而使手术切除肿瘤既正 确又彻底；( 4 ) 引起的副作用小，接收光动力治疗的患者只需要在短期内避 哈尔滨工程大学硕士学位论文 免强光直射，就不会产生局部光敏皮炎；( 5 ) 可多次使用。 1 1 1 光疗发展史 1 9 0 0 ：r a a d ，首次发现草履虫在啶橙和光的协同作用下发生衰亡； 1 9 0 4 ：t a p p e i n e r 和j o d l e b a u e r ，首次将有光敏剂、氧气和光参与的生物体 杀伤作用命名为光动力作用； 1 9 1 0 ：h a u s m a n n ，将注射了血卟啉的小鼠照光后，发现光动力作用的大小 与光敏剂和光照的剂量成正比例关系； 1 9 1 3 ：m e y e r - b e t z ，在人体注射血卟啉后，对目光呈现光敏特性，表现出 极强的水肿和滞留效应： 1 9 6 0 1l i p s o n 和b a l d e s ，将血卟啉的衍生物( h p d ) 用于小鼠的光敏作用； 1 9 6 1 ：l i p s o n ，对有支气管肿瘤的患者进行h p d 的光敏治疗； 1 9 6 6 ：l i p s o n ，首次将h p d 用于治疗乳腺癌： 1 9 7 2 ：d i a m o n d ，将h p d 输入大鼠肿瘤体，用日光照射，发现肿瘤遭到破 坏： 1 9 7 6 ：k e l l y 和s n e l l ，用h p d 治疗膀胱癌； 1 9 7 8 ： 1 9 8 l ： 1 9 8 4 ： 1 9 9 3 ： 1 9 9 7 ： 1 9 9 8 w e i s h a u p t ，证实h p d 光疗破坏肿瘤的作用来源于光敏产生的单重 态氧； d o u g h e r t y ，用h p d 治疗皮肤癌： h a y a t a ，利用光纤对支气管肿瘤进行光动力治疗； d o u g h e r t y ，从h p d 中分离纯化出二血卟啉醚，即p h o t o f r i ni i ： 加拿大批准将光动力疗法用于早期膀胱癌的治疗； 法国和荷兰批准将光疗用于深度肺癌和食道癌的治疗； 德国批准将光疗用于早期肺癌的治疗； 美国食品药物管理会( f d a ) 批准将光疗用于早期支气管癌的治疗； 美国f d a 委员会建议批准将光疗用于阻塞期支气管肿瘤的治疗。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 1 1 2 光疗机制 p d t 的基础是靶体中生物物质的光敏氧化。首先，将光敏剂导入体内并 让它在组织间分布，然后，当光敏剂在靶体和非靶体中的浓度比达到最大值 时，用与光敏剂吸收光谱相匹配的光照射靶体组织，通过一系列光物理、光 化学和分子生物学过程，在氧的参与下，产生对靶体细胞功能有害的活性氧 和氧化物，使靶体组织破坏直至死亡。 光动力疗法的作用机制可分为化学机制和生物机制。 1 1 2 1 化学机制 化学机制中主要包括i 型机制( t y p ei ) 和i i 型机制( t y p e i i ) 2 1o 光敏 剂吸收光以后，由基态( 单重态) 跃迁到寿命较短的激发单重态，激发单重 态经过系间窜越生成寿命较长的激发三重态。在光敏剂的激发三重态，将发 生两类反应，如图1 1 。 ( 1 ) 直接与底物或溶剂发生抽氢反应或电子转移。1 ，生成自由基或自由基离 子，再和0 2 作用，产生氧自由基。这一过程称作t y p e i 机制，也叫自由基机 制。 ( 2 ) 直接与氧发生能量转移反应，生成单重态氧。而单重态氧是一种具有高 反应活性、高氧化性的活性体，它具有亲电性，能高效氧化生物分子，如不 饱和脂肪酸、蛋白质、核酸等。这一过程称为t y p ei i 机制，也叫单重态氧 机制。 t y p ei 和t y p ei i 可同时进行，二者的比例取决于光敏剂的性质、底物、 氧浓度以及底物与光敏剂的结合程度。因此，光动力效果与氧有关。对于大 多数光敏剂而言，光动力效果受单重态氧调控5 1 ，但其他一些活性氧，如超 氧负离子和羟基自由基也起到了一定的作用。3 。 除此之外，化学机制中还包括光热效应、光诱导构型变化等。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 ，n 宰 等，型涮，伽山。钯 图1 1 光动力疗法的化学机制( t y p ei 和t y p e i i ) 1 1 2 2 生物机制 光动力疗法的生物机制是以化学机制为基础的。研究表明，光动力疗法 对肿瘤的作用主要体现在两个方面：一是对肿瘤细胞的直接杀伤作用；二是 通过作用于肿瘤组织的微血管造成血管完全封闭，使肿瘤组织因缺氧和营养 枯竭而坏死。其特征为：首先细胞膜的通透性增加，细胞肿胀并发生不规则 变化，内质网扩张，核染色质不规则移动，进而线粒体及细胞核肿胀，溶酶 体和细胞膜破裂，胞浆外溢，引起炎症反应，组织充血水肿。两种作用中何 种作用为主，依不同光敏剂而异”1 。对于现在广泛用于临床的光敏剂p h o t o f r i n i i 而言，第二种作用尤为重要。 近年来，越来越多的实验证据表明光动力疗法还可以诱发细胞凋亡，细 胞凋亡是机体细胞自身基因参与调控的一种细胞死亡过程”。其特征为：细 胞首先变圆，随即与邻近细胞分离，核d n a 断裂成核小体片断并形成有膜 包裹的凋亡小体，进而迅速被邻近细胞或吞噬细胞所吞噬。p d t 诱导细胞凋 亡可迅速发生“1 ，而且没有溶酶体和细胞膜的破裂，不会引起炎症反应， 所以被认为是一种更为理想的机制。 在一定的p d t 剂量范围内，光敏杀伤癌细胞可能主要是通过细胞凋亡途 径，而在更高剂量的情况下，细胞将发生不可逆的坏死，细胞死亡的模式( 坏 哈尔滨工程大学硕士学位论文 死和凋亡) 与p d t 剂量之间的关系可能主要取决于所用细胞类型和光敏剂的 种类。对于某种固定的光敏剂与细胞结合来说，细胞死亡的模式从凋亡转向 坏死与p d t 剂量是呈函数关系的”“。 1 1 3 光疗药物的研究进展 光动力治疗肿瘤的最终目的是消灭肿瘤而对正常组织又无损伤，p d t 的三 要素为光敏剂、光源和氧。 随着激光技术和光导纤维技术的发展和应用，光源和光传导的问题得到了 很好的解决，寻求理想的光疗药物成为光动力疗法中一个至关重要的问题。要 想成为一种理想的光疗药物，应具有如下特性： ( 1 ) 在光疗窗口有强吸收。由于生物体内红血球的存在和光散射等原因，不同 波长的光对组织的穿透程度不同，总的说来，光的波长越长对组织的穿 透深度越大。在6 3 0 纳米( p h o t o f r i ni il 临床治疗所用波长) 处，有效穿 透深度平均为3 m m 左右，而在7 0 0 8 5 0 纳米左右穿透深度约增加一倍 以上。一般认为6 0 0 9 0 0 纳米是治疗肿瘤的光疗窗口“3 。1 ，穿透深度更 浅时难以实现对实体肿瘤的有效治疗。 ( 2 ) 较高的三重态量子产率，从而可以得到较高的活性氧( 单重态氧和氧自 由基等) 产率。在光动力疗法中，光敏剂受光照激发到激发单重态，短寿 命的激发单重态经系间窜跃转变成激发三重态。三重态的寿命较长( 一般 在几个微秒以上) ，p d t 中的主要反应都发生在激发三重态。在氧的存在 下，激发三重态的光敏剂可以通过能量传递和电子转移分别产生单重念氧 和超氧负离子自由基。现已证明单重态氧在p d t 中起着至关重要的作用。 ( 3 ) 尽量低的暗毒性，高的光毒性，从而可以得到较高的光增强因子。同时这 也是保证正常组织免受损伤而提高光动力治疗选择性的一个重要方面。光 动力疗法之所以优于化疗、放疗等传统疗法主要在于所用药物( 即光敏剂) 在无光照时没有毒副作用，而在对靶体组织进行选择性光照时，靶体组织 哈尔滨工程大学硕士学位论文 内的光敏剂被激活而只对靶体组织选择性地发挥作用。 ( 4 ) 在肿瘤组织中选择性定位，从而降低光疗药物对正常组织的不可逆的永久 性损伤。光动力疗法双重选择性实现的一个最重要的基础就是光敏剂要能 在肿瘤组织内选择性的富集，而在正常组织内部分布很少或无分布，从根 本上保证对肿瘤组织的选择性杀伤作用。 ( 5 ) 在体内不易聚集。可从正常组织中快速清除，副作用小。 ( 6 ) 原料易得，便于分离纯化，成分单一，便于工业化规模生产。 血卟啉衍生物( h p d ) 被称为第一代光疗药物，是目前i 临床应用的主要 光疗药物。它是具有不同结构的卟啉类物质的混合物，有较好的抗肿瘤组织 选择性和杀伤效应，但其缺点是化学成分不单一，皮肤光毒性时间长，要求 病人在注射药物后避免光照达4 6 周。“3 ，在长波方向吸收差，组织的穿透 性弱，因此较大的实体肿瘤不易用该光敏剂治疗，i 临床上使用的6 3 0 纳米的 激光也不能发挥其最大治疗效应。 为克j 艮h p d 的缺点，人们先后合成了许多在光疗窗口有强吸收的光敏剂， 即第二代光疗药物，其中大部分为卟啉的类似物，如二氢卟酚、四氢卟酚、 酞菁和核心改性的卟啉等。另外，许多非卟啉化合物如竹红菌素及其类似物、 吩噻嗪类化合物、花青染料、5 氨基酮戊酸( 5 a l a ) 、吖啶化合物等也引起 了人们的广泛重视。 1 2 竹红菌素的研究进展与评述 竹红菌素( h y p o c r e l l i n ) 是从寄生于我国云南箭竹上的一种寄生真菌一 一竹红菌( h y p o c r c l l ab a m b u a s e ) 中提取出的一种天然光敏剂，属于3 ，1 0 一二羟基一4 ，9 一花醌衍生物。天然竹红菌素主要有两种组分：竹红菌甲素 ( h y p o c r e l l i na ，简称h a ) 和竹红菌乙素( h y p o c r e l l i nb ，简称h b ) ，其中 9 5 以上为甲素，但在碱性条件下，h a 可脱水转化为h b “”，如图1 2 。关 于竹红菌素的结构和性质已有几篇优秀的综述发表“8 删。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 c h 3 c h 3 h a ( 1 ) c h 3 c h 3 o ho h b ( 2 ) 图1 2 竹红菌甲素和竹红菌乙素 1 2 1 竹红菌素的研究进展 作为一种新型的光动力抗肿瘤药物，竹红菌素与血卟啉衍生物( h p d ) 相比，具有原料易得易纯化，光敏剂三重态量子产率和单重态氧量子产率高， 光毒性高，暗毒性低，从正常组织的排除速度快等优点，其最大优点在于容 易进行定点化学修饰，获得纯的单体衍生物“4 “，是一种很有应用前景的光 疗药物。 自从八十年代初以来，蒋丽金院士等率先开始竹红菌素这种新型光敏剂 的研究，并对甲素和乙素的化学结构鉴定、光物理、光化学及光动力作用的 分子机制作了系统的研究“8 ”1 。九十年代以来，竹红菌素的研究引起了国内 外多个研究小组的兴趣，对竹红菌素的光物理、光化学及光生物性质做了有 意义的研究。加拿大a l b e r t a 大学的l o w n 教授等在竹红菌素的人工合成、同 位索标记竹红菌素的合成、胺基化竹红菌素的合成及其光生物学性质方面做 了大量的工作“。美国i o w a 州立大学的p e t r i c h 教授等开展了对竹红菌素抗 病毒、细胞毒性及其机制方面的研究，并将竹红菌素和结构相似的金丝桃蒽 酮( h y p e r i c i n ) 作了对比。”1 。国内一些研究小组在竹红菌素的激发态性质、 结构修饰、光敏机制、量化计算、对脂类及d n a 等生物大分子的光动力损 哈尔滨工程大学硕士学位论文 伤作了一些有意义的工作”“。 竹红菌素及其衍生物对许多癌细胞( 如海拉细胞、e m t - 6 、内植s 一1 8 0 、 肝肿瘤细胞和人体恶性上皮癌细胞等) 的光动力作用已经在细胞水平上被进 行了广泛深入的研究“”“4 7 - 4 u 3 。e s t e y 等对1 6 种竹红菌素衍生物进行了系 统的理化、生物学特性研究“，从中筛选出三种竹红菌乙素的衍生物进行了 临床前的评估。，这三种衍生物主要定位在溶酶体和高尔基氏器，主要通过 i i 型机制产生光敏毒性，可完全治愈小鼠的e m t 6 e d 移植瘤而几乎没有皮肤 光毒效应，不具有致突变性。初步实验表明，细胞凋亡是它们介导光敏毒性 的主要途径。对实验动物无明显毒理作用，体内半衰期为2 小时左右，显示 出良好的药物代谢动力学特性。另外，值得一提的是，竹红菌素能明显杀灭 h i v 病毒“”，而且竹红菌甲素和乙素均有良好的抗单纯性疱疹类型i 病毒和 s i n d b i s 病毒的活性1 。 但是，作为抗癌药物来说，天然的竹红菌素在光疗窗口( 6 0 0 9 0 0 纳米) 几乎没有吸收，极大地限制了其在临床上的应用。另外，天然的竹红菌素是 亲脂性化合物，水溶性不好，不便于制成药剂。为了得到在光疗窗口有强吸 收( 即波长红移以配合激光治疗) 和脂水兼容( 便于药物制剂) 的光疗药物， 近年来，人们以结构修饰的方法合成了一系列竹红菌素的衍生物，并取得了 一些突破性进展。 总的说来，竹红菌素有下面几个反应位置：芳环，酚羟基，醌羰基，七元 环和甲氧基，下一节将系统介绍一下前人对竹红菌素所作的结构修饰并对这些 衍生物作以对比。 1 2 2 红菌素的结构修饰 1 2 2 1 酚羟基和醌羰基上的反应 ( 1 ) 与金属离子的络合反应 由于醌羰基氧上孤对电子的存在再如上n 位羟基花醌合适的空间构型， 哈尔滨工程大学硕士学位论文 使得竹红菌素可与许多金属离子发生络合反应，这些金属离子包括i i a 族、 i i i a 族及过渡金属离子“。“。这些金属离子的亲水性要比自由的竹红菌素好， 竹红菌素的镁、钙络合物表现出比母体强的光毒性和红光吸收能力呻，“1 。以 h a 和铝离子的反应为例”。 h a 与铝离子( a 1 3 干) 络合形成i ：1 的络合物a j 3 + h a ( 3 ) 。该络合物形 成一个长链聚合体，但链长未能测定。它易溶于极性有机溶剂，如n ，n 一二 甲基甲酰胺、d m s o 、乙醇和水。与母体h a ，其它金属和竹红菌素络合的 产物相比，a 1 3 + h a 有更好的水溶性，在水中有更高的稳定性。实验表明， a l ”一h a 保持了母体产生单重态氧的能力，在电子给体( 如b n a h ) 的存在 下，a l ”- h a 产生超氧负离子的能力可大大增强。 a 一 1 0 o ) 中反应，主要得到 5 位( 或和8 位) 巯基取代一4 位( 或和9 位) 胺基环化的衍生物”。以 h b 与半胱氨的反应为例，产物为1 3 ，1 4 。 嘟缍秘裕( no h 噶器 另外，在h b 与半胱氨酸的反应中，得到了一种迫位胺基产物( d c h b ) ， 即化合物1 5 ，它是由希弗碱式结构的中间体( d i ) 迅速转化而来的”“。 该法所得产物由于引入了胺基，使吸收光谱明显红移。化合物1 5 是一钠 盐形式，水溶性电很好。与非平面卟啉相似，其与小牛胸腺d n a 的结合是 以非嵌入方式进行的。光照下，它从d n a 得到一个电子，而导致d n a 的损 伤和断裂。由d n a 向三重态d c h b 的电子转移生成d c h b 的还原产物即 稳一 哈尔滨工程大学硕士学位论文 d c h b 及由此再反应生成的d c h b h 2 ，而这些还原产物又是0 2 和o h 的前 体。另一方面，由三重态d c h b 向分子氧的能量转移形成了1 0 2 。所有这些 活性氧都在d n a 的断裂中起作用。但d n a 的给电子作用降低了1 0 2 的表观 产率，而增强第一过程，甚至在无氧条件下也能发生d n a 的断裂，这适合 于肿瘤细胞中的缺氧环境，并可能有利于d c h b 体内光疗活性的发挥“。 1 2 2 3 七元环上取代的衍生物 ( 1 ) 磺化反应 c h ，o c h t o 1 6 在通空气的条件下，加热回流竹红菌素( 以h a 为例) 和亚硫酸钠 ( n a 2 s 0 3 ) 的含1 n a o h 强碱水溶液，可生成1 4 一脱羟基一1 5 一脱乙酰基一1 3 一 磺酸钠竹红菌素( 1 3 s 0 3 n a d d h a ) ，即化合物1 6 ”。 化合物1 6 与母体h a 相比，是一种水溶性很好的竹红菌素的衍生物。 4 呱壤呱 黜蒸感 器一 器 口屿叫呱 一簇一 蕊 呱建呱 睡一 捺 哈尔滨工程大学硕士学位论文 ( 2 ) 与氨基酸的反应 甘氨酸是最简单、胺基化反应位阻最小的氨基酸。加热竹红菌乙素和甘 氨酸的d m f 一1 n a o h 溶液，可得到1 5 位脱甲酰基1 3 位氨基酸取代的竹 红菌素衍生物1 7 ”“。 c h 3 0 c h 3 0 与上述方法相似，使6 一胺基己酸( 或4 一胺基丁酸) 与乙索反应，可得到 化合物，”“，产率大约为。其中，化合物 2 ) 5 化合物 ： z ) 3 。 c h l 1 8 1 9 观察化合物1 8 ，1 9 对人胃癌细胞株 和人口腔上皮癌细胞株 的光动力抗肿瘤活性可以发现，光照后它们对癌细胞的杀伤作用极为明 显，光毒性高，暗毒性低，光增强因子大。 ( 3 ) 与氨水的反应 用吡啶作溶剂，在加热的条件下() ，使与氨水反应，可 ， 袋 糕一 哈尔滨工程大学硕士学位论文 得到1 7 位取代的衍生物2 0 ”。 2 0 化合物2 0 与其母体相比，在光疗窗口的吸收增强了。它保持了竹红菌素 产生单重态氧的能力，同时，其超氧负离子自由基的生成能力也有了一定程 度的提高。但其产率仅为1 3 。 ( 4 ) 与乙醇胺的反应 用毗啶作溶剂，将h b 与乙醇胺的溶液加热到5 0 ，反应5 h ，可生成七 元环胺基取代的衍生物2 1 ，2 2 ，2 3 ”“。 1 6 蕊豁 哈尔滨工程大学硕士学位论文 修饰以后的产物在6 4 0 纳米波长有较强的吸收峰，同时，这些衍生物既 保持了竹红菌素本身所具有的良好的脂溶性，水溶性也有所改进。将乙醇胺 取代乙素的衍生物、5 位溴代乙素衍生物和5 ，8 位溴代乙素衍生物对小鼠腹 水肝癌细胞的光损伤能力进行对比，可以发现乙醇胺取代乙素的衍生物杀伤 癌细胞的能力是最强的”。但该反应的产物多，不利于最终分离纯化，产率 也较低( 仅为1 0 左右) 。 1 2 2 42 位脂肪胺基取代的衍生物 用吡啶作溶剂，在温和的条件下( 5 0 5 5 。c ) ，使h a ( h b ) 与正丁胺反应， 可得到2 位胺基取代的衍生物2 4 ( i p ( c h 2 ) 3 c h 3 ) 。“。 c c 但是，由于该法所用溶剂的沸点较高，副产物较多，导致产率较低。徐 尚杰为了克服以上的缺点，改用不同的溶剂进行反应并筛选出了理想的反应 溶剂四氢呋喃水= 4 ：1 。用该溶剂代替毗啶，使正丁胺与竹红菌素反应， 取得了很好的效果”。用同样的方法，使其它烷基胺与竹红菌素反应，可以 得到与上面结构类似的衍生物”6 。7 。 与脂肪胺生成的2 位胺基取代的竹红菌素衍生物保留了母体的迫位羟基 结构，光动力疗效得到了明显的提高。从化合物2 4 对人体胃癌细胞m g c 8 0 3 的光毒性实验结果来看，它主要定位在内质网和线粒体，摄取迅速，光动力 哈尔滨工程大学硕士学位论文 作用途径以诱导细胞凋亡为主，p 5 3 和b c l 2 基因对其光动力作用起着重要的 调控作用”“7 6 , 7 7 3o 在相同的条件下，化合物2 4 对e m t - 6 e d 肿瘤细胞的光疗 效果是p h o t o f r i ni i 的3 0 0 倍。和h a 相比，它不仅降低了暗毒性，而且光毒 性明显增强。用移植胰腺癌的裸鼠实验研究正丁胺基取代竹红菌素对活体癌 肿瘤的抑制作用，结果发现注射正丁胺基取代的竹红菌素组对胰腺癌的生长 抑制率基本上达到i 0 0 ”。从环己胺2 位取代乙素对人体胰腺肿瘤细胞 c a p a n 一1 的光毒性实验结果来看，它表现出了比母体乙素和f 丁胺取代衍生 物更高的光动力活性”。 以上对竹红菌素所作的结构修饰尽管在一定程度上增强了其在红光部分 的吸收，提高了其水溶性，但总体上说。并未实现预期的效果。 由以前所作竹红菌素与氨基酸、乙醇胺、半胱氨、半胱氨酸和正丁胺等 所合成衍生物的实验结果可以看出，胺基取代的竹红菌素表现出了较好的光 动力效果，优于其它的竹红菌素衍生物。生物体内外的实验表明，各种衍生 物中，胺基取代的竹红菌素衍生物由于引入了胺基，使其吸收光谱红移，在 光疗窗口的吸收大大增强，它的抗肿瘤效果是最好的。同时，竹红菌素的胺 基衍生物能更有效地富集在溶酶体，这种有效的富集能提高光敏剂的光毒性 并降低其暗毒性，提高光敏剂的选择性。已经证明在溶酶体聚集的光疗药物 具有很多优点“。 a 溶酶体能高效地富集光动力药物，在低剂量药物下仍能有效地杀伤 癌细胞，这样就可降低药物对正常组织的损伤。理论上，根据溶酶 体膜的p n 梯度，溶酶体内外的药物浓度可以相差几千倍； b 已有报道溶酶体的光损伤可以高效地诱导癌细胞的退化和凋亡。 e m t - 6 e d 癌细胞对竹红菌素的摄取速度特别快，而且可以在很短 时间内达到最大浓度； c 胺基化竹红菌素氧化电位降低，更容易通过i 型机制，即半醌负离 哈尔滨工程大学硕士学位论文 子自由基的活性中间体达到光敏损伤的目的； d 因为一般的癌细胞的p h 值比正常组织低，可以使具有弱碱性的胺 基化竹红菌素能选择性的富集于病变组织； 因此，近年来，人们不断探索新的胺基取代的竹红菌素衍生物，以期得 到光动力疗效好的胺基取代衍生物，将竹红菌素这一具有诸多优势的抗癌药 物早日应用于临床。 1 3 课题的提出与意义 竹红菌素作为我国特产的天然光敏剂，与目前广泛用于临床的光敏剂 p h o t o f r i ni i 相比具有很多的优势，越来越引起人们的关注。但是竹红菌素母 体本身在应用于光动力治疗中有两大局限性：其一，在光疗窗口( 6 0 0 9 0 0 纳米) 几乎没有吸收；其二，水溶性差。综上，为了克服这两个局限性，人 们在竹红菌素的结构改性方面作了许多工作，但结果并不是很理想。 尽管如此，我们也从中得到了一定的启发，即含有胺基的竹红菌素修饰 物表现出了较强的红外吸收和较好的光动力作用。但以前合成出的胺基化竹 红菌素其水溶性并没有得到很好地改善，这极大地限制了其在临床上的应用。 于是我们试图设计合成出具有一定水溶性的胺基化的竹红菌素衍生物， 希望在保留其较强红外吸收和较好光动力作用的同时，解决其水溶性差的缺 点，期望早日实现竹红菌素在光疗中的临床化。 同时，为了进一步了解在胺基化竹红菌素中的质子转移和电荷转移过程 的细节，我们尝试对它们的特征光谱进行研究，希望通过讨论竹红菌素和其 胺基取代衍生物表现出的不同的溶剂效应，从中得到有益的启示。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 第2 章胺基竹红菌素的合成及其光动力作用 在第1 章绪论中我们比较了以前所作竹红菌素的衍生物，可以发现，最 初将水溶性好的基团如磺酸钠、铝离子、羧酸等引入竹红菌素，得到了水溶 性很好的衍生物，但发现它们的光动力效果很不理想。我们认为以前合成出 的水溶性竹红菌素总是在茈醌环上引入一个水溶性极好的基团，从而使整个 分子的水溶性有效地增强。但由于细胞膜的亲脂性阻碍了光敏剂对癌细胞的 穿透与进攻，这些水溶性好的衍生物在光疗窗口的吸收并没有得到有效地改 善。前人设计合成出了胺基取代的竹红菌素的衍生物，胺基的引入使这些衍 生物在光疗窗口的吸收大大增强，并且在细胞实验和动物活体实验中都取得 了很好的效果。然而这种胺基取代衍生物的水溶性较差，给药物制剂带来了 很大的不便，从而限制了它们在临床上的应用。 综合以上两个因素，为使竹红菌素向临床应用更进一步，设计并合成具 有一定脂一水兼溶性的胺基取代的衍生物( 即两亲性的胺基取代的衍生物) 是我们的目标。 2 1 胺基取代竹红菌素的合成 2 1 1 材料与方法 1 材料 竹红菌乙素( h b ) 由竹红菌甲素( h a ) 脱水制得，其纯度经薄层层析 ( t l c ) 检测为大于9 5 ：2 一吗啡啉一1 一乙胺( m l ) 、n ，n - - - 甲基乙二胺 ( d m e ) 、 2 - 哌嗪一卜乙胺( p z ) 等购于s i g m a 公司；所用溶剂至少为分析纯， 从北京化工厂或天津韦斯实验用品公司购得。柱层析( c c ) 和薄层层析( t l c ) 都用硅胶g f 2 5 4 ，以l 磷酸二氢钾水溶液调制，1 0 5 1 1 04 c 活化1 小时。 2 方法 质谱用f a bm sa e i m s5 0k r a t o n s 测得；紫外一可见吸收光谱用 s h i m a d z u 1 6 0 一a 分光光度计测定；红外光谱在p e r k i n e l m e r5 5 7 红外光谱仪 哈尔滨工程大学硕士学位论文 上获得；核磁氢谱用v a r i a nx l 3 0 0 仪上测定。 3 胺基化竹红菌乙素的合成与提纯 乙素2 0 0 毫克，胺( m l 、p z 或d m e ) 1 0 毫升和四氢呋喃( t h f ) 1 0 0 毫升一起放入5 0 0 毫升的圆底烧瓶中，避光下电磁搅拌。反应过程中温度控 制在5 0 5 5 之间。 待发应进行1 0 1 5 小时后，点板检测反应已趋于平衡，这时反应溶液为 深蓝色。停止反应，减压抽去四氢呋喃得蓝黑色固体，用氯仿溶解，用1 0 稀盐酸洗3 4 次，直到水层p h 值接近中性。取氯仿层减压浓缩，得一蓝黑 色固体。用一定的混合溶剂为展开剂进行柱层析和薄层层析之后，各自得到 一种最终纯净的胺基取代衍生物。 反应方程式如图2 1 所示： ：器捺一锤_ 锤 删c n ，。嘲m w g 。m c o n 图2 1m l h b ，d m e h b 和p z h b 的合成路线 f i g u r e2 1p a t h w a yf o rt h es y n t h e s i so f m l h b ，d m e h b a n dp z h b 由于这三种衍生物的极性较大，而且反应过程中有许多副产物产生，所 以较难分离纯化。为了简化提纯过程，