基因实验步骤.doc

一 基因组DNA的提取苯酚抽提法1.冻存血样室温融化，吸取500ul血液加入2.0ml的灭菌离心管内。2.向离心管内加入1.5ml的PBS缓冲液，颠倒摇匀10min，12000rpm 4离心10min。3.弃去上清液，重复上一步骤1-2次（加液后可轻弹管壁使沉淀脱离，直至出现白色沉淀止）。4.弃去上清液，加入500ul DNA抽提缓冲液，摇动使沉淀脱离管壁。5.加入Pr酶k10ul（20ul/ml），吹打混匀，55，水浴过夜（16-18h，消化过程中可不时轻轻摇匀反应液）。6.反应液冷却至室温后，加入Tris-平衡酚500ul，摇动混匀20min，12000rpm 4离心10min。7.取上清液移至另一2.0ml的灭菌离心管内，加等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），颠倒混匀20min，12000rpm 4离心10min。8.取上清液移至另一2.0的灭菌离心管内，加等体积氯仿：异戊醇（24:1），缓慢颠倒离心管20min，12000rpm 4离心10min。9.轻轻取上清液移至另一1.5ml的灭菌离心管内，加2倍体积的无水冷乙醇（-20），轻轻上下颠倒混匀，冰浴10-20min，可见DNA沉淀，12000rpm 4离心10min。10.弃去上清液，沉淀用1ml 70%乙醇吹打洗涤，12000rpm 4离心10min。11. 弃去上清液，室温晾干。加入50ml TE溶解DNA，-20保存。二 DNA浓度与纯度的检测1. 琼脂糖凝胶电泳检测。取2uL待检NDA溶液和3uL加样缓冲液混匀，在2.0%的琼脂糖凝胶。根据电泳槽的长度确定合适的时间，一般5 V/cm，紫外灯下观察电泳结果，并拍照保存。2. 用分光光度计检测DNA浓度。吸取5uL样品，加超纯水3mL混匀，移入分光光度计的比色杯中。用3mL超纯水校正零。在260nm和280nm分别读出光密度。用OD260/OD280的比值估测纯度，比值大于1.8时，有RNA，应用RNA酶处理；比值小于1.6，有酚或者蛋白，应再次抽提。三 基因组DNA的除蛋白纯化1.50Oul的DNA溶液中加入20%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到1O0ug/ml。2.55保温10h左右。3.用等体积苯酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)和氯仿分别抽提一次，12000rpm 4离心10min。4.分相后，吸取上层水相移入另一离心管中。5.加入2倍体积冰冷无水乙醇（-20）沉淀DNA，12000rpm 4离心10min。6.弃去上清液，DNA沉淀70%乙醇洗涤一次，12000rpm 4离心10min。7. 弃去上清液，室温晾干。加入50ml TE溶解DNA，-20保存。四 基因组DNA的除RNA纯化1.DNA溶液中加入20mg/mlRNaseA使终浓度达到50ug/ml，37保温30min。2. 用等体积苯酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)和氯仿分别抽提一次，12000rpm 4离心10min。3.分相后，吸取上层水相移入另一离心管中。4.加入2倍体积冰冷无水乙醇（-20）沉淀DNA，12000rpm 4离心10min。5.弃去上清液，DNA沉淀70%乙醇洗涤一次，12000rpm 4离心10min。6.弃去上清液，室温晾干。加入50ml TE溶解DNA，-20保存。五 引物设计与合成 参考魏伍川对牦牛FSHR基因5端的测序结果进行引物设计，设计好的引物送生物公司合成。引物设计如下：引物 碱基数 序列（5至3） 扩增区域引物1 267 GAAAGGACATGCGACAG FSHR5端 CCTCCAGGCTACTTGATA 引物2 332 GTAGCCTGGAGGAAGACA FSHR5端 CTCCCAGACAAATAGCAGA 引物3 372 TCTGCTATTTGTCTGGGAGT 第1外显子GCCACGCTGTTGTTCC 六 引物溶液的配制将引物管进行瞬间离心，加入（公司DNA合成报告单上的nmol数 X10）ul灭菌双蒸水，配制成100u M的浓度，充分振荡5-10min，在4放置24小时，使其充分溶解，然后再稀释成实验浓度10 uM。七 建立最佳的PCR反应体系与反应条件 PCR的反应体系如下表：反应体系成分(浓度) 体积(单位: ul)模板 2.5 Taq混合酶 25上、下游引物(10uM) 各1.5重蒸水 19.5总体积 50注：Taq混合酶溶液组成：Taq 酶(0.05U/ ul);PCR Buffer (3mM); dNTPs(各0.4mM)。 PCR的反应条件如下图：94 94 4:00 0:30 72 72 退火温度 0:30 7:00 4 0:30 35个循环三对引物的退火温度分别对应为：55、53、51。八 PCR产物琼脂糖凝胶电泳1.称取2g琼脂糖加入到盛有100ml 1 X TBE的烧杯中，在微波炉中加热至溶。2.待溶化的胶稍微冷却后加入EB至终浓度0.5 g/ml，即制成2.0%的琼脂糖凝胶。3.用合适的梳子形成加样孔，待胶凝固后，放入电泳槽，加入1 X TBE电泳缓冲液，至少高于胶面。4.将待检测的PCR产物和加样缓冲液（溴酚蓝）以1:2的比例混合均匀，加入点样孔。5.根据电泳槽的长度确定合适的时间，一般5 V/cm。6.凝胶成像仪下检测结果。九 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳三对引物均38.5%丙烯酰胺(37.5：1)凝胶贮存液制备；第一、二对引物使用14%非变性聚丙烯酰胺凝胶工作液，第三对引物使用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶工作液。以下以14%非变性聚丙烯酰胺凝胶工作液为例，介绍实验步骤。1.洗净玻璃板和间隔片并用无水乙醇擦洗晾干。2.在制胶架上安装玻璃与间隔片。3.在烧杯中加入38.5%丙烯酰胺凝胶贮存液(37.5：1)13ml，5 X TBE 7ml，10%过硫酸铵210 ul，TEMED 50ul，加蒸馏水补充至35ml，混匀后迅速灌胶。4.当灌胶至玻璃板上沿1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合20min左右，随时观察凝胶聚合情况并补加丙烯酰胺。5.凝胶聚合好后，向电泳槽加入0.5 X TBE，用注射器冲洗点样孔。6.预电泳10min，同时准备点样。7.取2ul PCR产物置于PCR管中，加8ul SSCP变性缓冲液，离心混匀，98变性10min。8.迅速冰浴10min，用10 ul点样枪点样。9.在该引物适合的温度、电压、时间下进行电泳。三对引物适合的温度、电压、时间如下表：引物 温度 电压 时间引物1 22 200V 15h 引物2 18 150V 12h 引物3 25 300V 12h 十 硝酸银染色1.凝胶在去离子水中冲洗1遍。2.用银染固定液浸泡凝胶，轻轻摇晃10min，倒去银染固定液。3.用银染染色液浸泡凝胶，轻轻摇晃10min，倒去银染染色液。4.凝胶在