（生物物理学专业论文）色氨酸酶基因工程菌的构建与表达.pdf

塑垩查堂堡主兰垡堡壅一 摘要 文1 j 1 1 。 7 0 - p j 用p c r 方法从大肠杆菌k 1 2 中得到色氨酸酶操纵子d n a 片段，该片段除带 有完整的色氨酸酶基因外，还带有负责表达的启动子和调节基因，将这个d n a 片 段克隆到t 载体上，经过测序发现其核苷酸序列与文献报道的完全一致。 将含有色氨酸酶操纵子d n a 的t 载体的菌株在含有色氨酸的m 9 培养基中 3 7 培养能表达大量的目标蛋白，与空宿主相比其酶活只有略微的提高。 七为了证明质粒上的基因能表达出有活性的色氨酸酶，将这个d n a 片段克隆 到p e t 2 8 c 质粒的b a m h i 和h i n d i i i 位点上，使该片段受t 7r n a 聚合酶的启动 子控制，然后转化噬菌体d e 3 的溶源菌b l 2 1 ( d e 3 ) 。用i p t g 诱导表达t 7 r n a 聚合酶，以表达质粒上的目的基因。在葡萄糖存在的条件下，用常规方法发酵和 诱导( 3 7 。c l m mi p t g ) ，发现表达的蛋白质条带的分子量与理论上计算的分子量 ， 一致。l 但是发酵液中检测不到吲哚，表明虽然表达了目标蛋白，但表达的蛋白质 没有酶活性。在葡萄糖存在的条件下由于分解代谢产物阻遏，基因组上的色氨酸 酶基因不表达，加入i p t g 只表达质粒上的基因，如果在合适条件下测得色氨酸酶 活性，则可以证明质粒上的基因能表达出有活性的色氨酸酶。检测发酵液中有无 吲哚的形成，是定性检测酶活的最简单的办法。摸索发酵条件，如改变培养温度 和i p t g 浓度等，发现在3 0 培养条件下，0 2 m m i p t g 诱导时，发酵液中的吲哚 含量最高，表明低浓度的诱导剂或低温诱导有利于表达出有活性的色氨酸酶。在 该条件培养得到的菌体能将吲哚、丙酮酸和氯化铵在p h 9 的条件下转变为色氨酸。 总之，根据测序、表达的分子量和酶活性可以证明克隆到的d n a 片段确实含有色 氨酸酶基因。 上述构建的质粒，含有两个启动子。可以分别用i p t g 和色氨酸诱导表达色 氨酸酶基因，本论文分别对两种诱导方法进行了发酵条件优化。用i p t g 诱导表达 实验结果表明：利用t 7 启动子在胞内能表达出有活性的酶：i p t g 与温度的合适 组合可以得到较高活性的色氨酸酶，在0 2 r a m 以下浓度的i p t g 诱导时，3 7 。c 是 最适温度，而用较高浓度的i p t g 诱导，低温是表达有活性的色氨酸酶的必要条件， 而且诱导时间要短。0 2 r a mi p t g 对菌体的生长有抑制作用，在细胞对数生长期前 期诱导抑制最强烈，0 1 m mi p t g 基本不抑制生长；临界浓度0 1 5 r a m 的i p t g 和 浙江大学硕士学位论文 3 7 。c 是比较好的组合。钙离子能提高酶活1 0 以上。在葡萄糖存在的条件下，用 i p t g 诱导的酶活是不用i p t g 诱导的9 1 倍。用色氨酸诱导时添加易利用的碳源， 菌体密度显著提高，总酶活反而降低；诱导剂色氨酸是最佳碳源，酵母膏和硝酸 铵分别是最适有机和无机氮源。镁离子能显著提高酶活，0 0 1 的泡敌不影响酶活。 另外，还考察了利用不同宿主表达色氨酸酶的情况，发现b l 2 1 ( d e 3 ) 是最佳宿主。 也比较了t 载体和p e t 2 8 c 两种载体对生产色氨酸酶的影响。工程菌 b l 2 1 ( d e 2 i ) p e t 2 8 c - t n a a 的活性是 到的菌体比活较用i p t g 诱导的高。 b l 2 1 ( d e 3 ) 的2 1 倍。用色氨酸诱导得 然后在1 0 l b b r a u n 发酵罐上观察了工程菌的发酵过程曲线，底物消耗以及 酶活曲线。并利用所得的菌体做色氨酸合成实验，分别以吲哚和l 一半胱氨酸、吲 哚和丙酮酸以及铵盐作为底物分别合成色氨酸，产物浓度分别达到2g l 、4 2g l 。 关键词：色氨酸酶，基因克隆，色| 瑟，大肠杆菌k 1 2 、l 色氨酸，酶法生产， 代谢产物抑制，l 半胱氨酸，吲哚，丙酮酸。 塑婆查兰堡主堂垡笙奎 a b s t r a c t u s i n gp c rt e c h n o l o g y ，a2 4 k b d n a f r a g m e n t ，p a r to ft r y p t o p a n a s eo p e r o n ， c o n t a i n i n g a p r o m o t e r ，ar e g u l a t o rg e n e t n a cl o c a t e dd o w n s t r e a mo ft h ep r o m o t e ra n d ad e s i r e d t r y p t o p a n a s eg e n et n a aw h i c hc a nb ee x p r e s s e db yt h ep r o m o t e rf r o m e c o l ik - 1 2 ，w a sc l o n e dt op m d l 8 一tv e c t o r t h ed n a s e q u e n c ei s t h es a m ea s w h i c hw a s p u b l i s h e do ns c i e n c e t o p r o v e t h a tt h ec l o n e dd n af r a g m e n tc a ne x p r e s st r y p t o p a n a s e ，an e w p l a s m i dp e t 2 8 c - t n a a ，i nw h i c h t h ec l o n e dd n af r a g m e n tw a sl o c a t e d d o w n s t r e a mo ft 7p r o m o t e ro np e t 2 8 cw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t oh o s t b l 2 1 ( d e 3 ) ，a b l 2 1 l y s o g e no fb a c t e r i o p h a g ed e 3i nw h i c ht h eo n l yp r o m o t e r k n o w nt od i r e c t t r a n s c r i p t i o n o ft h et 7r n ap o l y m e r a s e g e n e i st h el a c u v 5 p r o m o t e r ，w h i c hi s i n d u c i b l eb yi p t g a d d i t i o no fi p t gt og r o w i n gc u l t u r eo ft h e l y s o g e ni n d u c e st 7r n ap o l y m e r a s e ，w h i c h i nt u r nt r a n s c r i b et h et a r g e td n ai nt h e p l a s m i d i nt h ep r e s e n c eo fg l u c o s ea n da p p r o p r i a t ec o n d i t i o n ss u c ha st e m p e r a t u r e a n dc o n c e r n t r a t i o no f i p t g ，a5 2 k dp r o t e i n w i t h t r y p t o p a n a s ea c t i v i t y w a s e x p r e s s e d t e m p e r a t u r e a n dt h ec o n c e r n t r a t i o no fi p t ga r ec r u c i a lf a c t o r sf o r e x p r e s s i n gt r y p t o p a n a s e w i t h h i 【g ha c t i v i t y a c o n c l u s i o nc a nb ed r a w nt h a t t r y p t o p a n a s ee x p r e s s e do n l yb y c o n s t r u c t e d p l a s m i dd u r i n g c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n ” i n d u c e de i t h e rb y1 p t go r l t r y p t o p h a ni nt h ea b s e n c eo fe a s i l ym e t a b o l i z e d c a r b o ns u c ha s g l u c o s e t h es t r a i n b l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 c - t n a a c a l l e x p r e s s t r y p t o p a n a s e t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e dr e s p e c t i v e l y i n t h e p r e s e n c eo fg l u c o s ea n di p t ga si n d u c ea g e n t ，t h ec o n c e n t r a t i o n i st h ec r u c i a l f a c t o rf o re x p r e s s i o no fa c t i v et r y p t o p h a n a s e i ft h ei p t gc o n c e n t r a t i o ni sl e s st h a n 0 2 m m ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s3 7 * c 。l o w e r t e m p e r a t u r ei sn e c e s s a r yt oo b t a i n a c t i v e t r y p t o p h a n a s e i nt h ec a s eo f h i g h e rc o n c e n t r a t i o no f i p t g t h e p r e s e n c e o fc a l c i u m i sb e n e f i c i a lt oo b t a i nh i g h e rt r y p t o p h a n a s e a c t i v i t y t h ea c t i v i t y o f t r y p t o p h a n s ee x p r e s s e db ya d d i t i o no fa p p r o p r i a t ec o n c e r n t r a t i o no fi p t gi s 9 1 - f o l d h i g h e r t h a nt h a to fn o i n d u c t i o n t h e h i g h e s ts p e c i f i ca c t i v i t y w a s 5 塑坚查堂堡主兰笪堡壅 o b t a i n e d b yl - t r y p t o p h a n i n d u c t i o ni nt h e o p t i m a l m e d i u m c o n s i s t i n g o f 0 1 6 k h 2 p 0 4 ，0 5 5 k 2 h p 0 4 ，0 0 5 m g s 0 4 ，0 i n h n n 0 3 a n d0 5 y e a s t e x t r a c t m a g n e s i u mi sac r u c i a li n g r e d i e n to f t h em e d i u m i t sf o u n dt h a tb l 2 1 ( d e 3 ) i st h eb e s th o s tt h a nj m l 0 9a n dj f l l 2 5 c o m p a r e d w i t ha n o t h e r t v e c t o r ， p l a s m i dp e t 2 8 c t n a ai s am u c hs u i t a b l ev e c t o r t h ea c t i v i t yo f t r y p t o p h a n s eo f b l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 c t n a ai n d u c e db yl - t r y p t o p h a ni s 2 1t i m e sh i g h e rt h a nt h e h o s tb l 2 1 ( d e 3 ) a t3 0 。c t h e p r o c e s sc u r v ew a s o b s e r v e di nt h e1 0 lb b r a u nf e r m e n t o r u s i n gi n t a c t c e l lw i t hh i g h e s tt r y p t o p h a n a s ea c t i v i t y ，4 2 9 l t r y p t o p h a n w a s s y n t h e s i z e di n t h em i x t u r eo fi n d o l e ，s o d i u mp y r u v a t ea n da m m o n i u nc h l o r i d e 2 o g lt r y p t o p h a nw a sf o r m e df r o m0 6 5 9 lo fl c y s t e i n ea n d0 7 9o fi n d o l ei n1 0 0 m l r e a c t i o nm i x t u r es h a k i n gf o r4 8 ha t3 76 c k e y w o r d s ：t r y p t o p h a n a s e ，l - t r y p t o p h a n ，c y t o p l a s m i ce x p r e s s i o n ，a c t i v e p r o t e i n ，i n d o l e ，l c y s t e i n e ，e n z y m i c a l l y p r o d u c t i o n ， s o d i u m p y r u v a t e ， c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n 6 塑坚查兰堡圭堂焦堡兰一 第一章文献综述 1 1l 色氨酸的理化性质 l 一色氨酸，化学名称为a 氨基d 吲哚丙酸。其分子结构式为 汀一c h 2 一c n h 比- - c 。h 性状：白色至黄白色晶体或结晶性粉末。无臭或微臭，稍有苦味。熔点2 8 9 ( 分解) 。长时间光照易变色。与水共热产生少量吲哚，如在氢氧化钠、硫酸铜 存在下加热，则产生多量吲哚。色氨酸与酸在暗处加热，较稳定。与其他氨基酸、 糖类、醛类共存时极易分解。如无烃类共存，与5 m o l l 氢氧化钠共热至1 2 5 。c 仍 稳定。用酸分解蛋白质时，色氨酸完全分解，生成腐黑物。略溶于水( 1 1 9 1 0 0 m l ， 2 5 。c ) 。溶于热水、热乙醇、稀盐酸和碱性氢氧化物溶液。比旋光度【a 】：= 一2 9 7 - 1 2 l 色氨酸的用途 l - 色氨酸在天然蛋白中含量很低，即使含量较高的蛋、奶肉类中，其含量也 不超过1 ，植物蛋白中一般含量很低，特别在玉米、胡萝n 、木茨中色氨酸含量 几乎测不出。l 色氨酸是第一个被证明为人体和动物的必需氨基酸，只是需要量 不如其它必需氨基酸高，一般为其他氨基酸的1 2 1 5 。在生物体内色氨酸可转化 为许多生理上重要的物质，如可生成b 族维生素之一於酸；在体内脱羧形成 色胺；5 - 羟色胺是色氨酸的代谢产物，它是动物的一种血管增强剂和平滑肌组织刺 激剂。色氨酸在临床上用做抗闷剂，对脑代谢也起有力作用，它可作为催眠剂使 用。目前重要的应用是用作营养药剂、人工合成膳食以及输液和水解蛋白质的添 加剂。色氨酸与铁剂、维生素合用可以提高抗贫血疗效，与维生素b 6 合用可治 疗抑郁症，它可以作为强抗昏迷剂5 羟色胺和新甜昧剂6 氯色氨酸( 其甜度比蔗 糖高1 3 0 0 倍) 的合成原料，此外，色氨酸还是鱼类保鲜剂( b l f ) 的重要成分， 浙江大学硕士学位论文 它除了阻止氧化起到保鲜作用以外，还能预防发霉。色氨酸在饲料中的良好添加 效果也引起了人们的极大的重视。饲料实验表明：在玉米粉中添加0 4 的l 一赖氨 酸可使蛋白增重效益( p e r ) 由0 8 5 提高到1 0 8 ，而再添加0 0 7 的色氨酸后p e r 可进一步提高到2 2 5 ，也就是说比单独使用赖氨酸时提高一倍以上。色氨酸对泌 乳期的牛、猪泌乳有促进作用。对怀孕母猪添加色氨酸可以增加仔胎的抗体。当 色氨酸不足时，会出现畜禽生长停滞、体重减轻、脂肪积累降低、种公畜睾丸萎 缩等不良现象。因此，色氨酸是重要的氨基酸饲料之一。 世界市场色氨酸年需求量在万吨以上，而且目前全世界只有一千吨的产量，且 主要集中在日本和美国等少数国家，仅日本1 9 8 9 的销售额就达到2 5 亿日元。也 就是说，色氨酸的市场前景巨大，尽管色氨酸的研究前后经历了4 0 年，生产方法 也多种多样，究其原因有四方面的困难：一是色氨酸合成的调控系统比较复杂： 二是底物之一的l 一丝氨酸价格昂贵，几乎与l 一色氨酸相当；三是底物之一对色氨 酸合成酶的抑制较为强烈甚至完全失活：四是底物之一的吲哚水溶解性难溶于水， 转化率受到影响。， 1 3 色氨酸的生产方法 色氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法和酶法等。 提取法：以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多 种氨基酸混合物，经过分离纯化获得各种氨基酸的方法称为水解提取法，分为酸 水解法、碱水解法和酶水解法。酸水解法的产物为l 一型氨基酸，但是色氨酸全部 被破坏，碱水解法的色氨酸不被破坏，但是产生消旋作用，在工业上不采用。酶 水解法主要用于生产水解蛋白及蛋白胨，很少用于生产氨基酸。再由于天然蛋白 质中的色氨酸含量很低，所以提取法生产色氨酸不可行。 化学合成法：需要多步合成，得到的是消旋的d l 色氨酸，仅能用于饲料中， 一般d l 色氨酸的效价仅仅是l 色氨酸效价的6 0 8 0 。在食品和医药等方面的应 用皆要求为l 色氨酸，要得到l 色氨酸需要拆分。氨基酸的光学拆分的方法大致 可以分为三类：( 1 ) 物理化学法，包括优先结晶法、置换结晶法和色谱法等。( 2 ) 化学法，即将d l 一氨基酸或其衍生物与具有光学活性的酸或碱生成非对映体的盐 类，再利用后者对各种溶解度差，使d l 氨基酸分离，此法又称非对映体法。( 3 ) 浙江大学硕士学位论文 酶法拆分，即利用酶的高度特异性，使之与d l 氨基酸或其衍生物作用，而将d l - 氨基酸分离。上述几种方法中，以优先结晶法和酶法拆分最为重要。优先结晶法 又称接种法，即在消旋混合体的过饱和溶液中，接入所希望得到的光学活性的晶 种，而使同型光学活性体的结晶析出，或在所希望得到的光学活性体的过饱和溶 液中，使这种过饱和度较高的光学活性体优先析出。近年来，酶法拆分得到极大 发展，其中尤以氨基酰化酶法应用最为广泛。将d l - 氨基酸进行乙酰化，生成d l n 乙酰化，再利用氨基乙酰化酶只对l 型有水解作用，而对d 一型没有水解作用这一 性质进行拆分。反应物中留下的d 型氨基酸用化学方法消旋成d l 一型后继续拆分。 发酵法：分直接发酵法和添加前体发酵法 直接发酵法是借助微生物具有合成自身氨基酸的能力，通过对菌株的诱变处 理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物的抗性突变株，以解除代谢调节 中的反馈抑制与阻遏，达到过量合成氨基酸的目的。 芳香族氮基酸的生物合成存在着特定的调节机制，因此不可能从自然界中找到 大量积累色氨酸的菌株，但是可以从黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等为出发菌株， 设法造就从遗传角度解除芳香族氨基酸的生物合成正常代谢机制的突变菌株，这 些方法包括：解除自身反馈调节、切断支路代谢、增加前体物等等。 磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 十4 - 赤藓糖( e p ) 3 - 脱氧- 5 可拉伯糖型庚酮酸彳磷酸( d a h p ) j r 莽草酸 c o q 人k i l f 扮支酸型避垒盛参氨茴酸色氨酸 维生素k + _ 卜 扮支酸变位酶 预苯酸( p p a ) p p a 脱水酶 眵 脱氢酶 苯丙氨酸一苯丙酮酸 对羟基苯丙酮酸- 酪氨酸 图1 - i 芳香族氨基酸的生物合成途径 浙江大学硕士学位论文 1 ) 切断支路代谢 切断由分支酸到预苯酸、维生素k 、c o o 的支路代谢，节约碳源，使 中间体分支酸更多的转向合成色氨酸，同时可以解除苯丙氨酸和酪氨酸对 合成途径中d s 的反馈调节，从而利于色氨酸的积累。具体可以采用预苯 酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、酪氨酸缺陷、维生素k 缺陷、c o o 缺陷等标记。 2 ) 解除自身的反馈抑制 根据芳香族氨基酸合成调节机制，解除色氨酸特异途径的调节机制， 即使有共同途径上的反馈调节存在，也能过剩积累色氨酸，因此，可以通 过选育色氨酸的结构类似物抗性突变株，解除其自身的反馈调节来达到积 累色氨酸的目的，色氨酸的结构类似物有：5 一甲基色氨酸( 5 m t ) 、5 - 氟色 氨酸( 5 f t ) 、色氨酸氧圬酸盐( t r p h x ) 6 一甲基色氨酸( 6 - m t ) 、4 甲 基色氨酸( 4 m t ) 、6 - 氟色氨酸( 6 一m t ) ，它们都可以由于结构与色氨酸类 似而被氨茴酸合成酶( a s ) 误认，与a s 的调节部位结合。这些结构类似 物的抗性突变株可以解除色氨酸的反馈调节，从而使色氨酸得以积累。 3 ) 前体物 为了积累更多的色氨酸，必须增加更多的前体物。减少p e p 和e p 的 支路代谢，解除苯丙氨酸和酪氨酸对合成途径中d a h p 合成酶( d s ) 的反 馈调节，增加分支酸浓度等方法可以增加前体物的合成。例如，为了更多 的积累p e p ，防止丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶活力失活或低下的菌株。据 报道硫辛酸、硫胺素双重缺陷菌株产气杆菌l t 9 4 产色氨酸1 6 7 9 l ，解除 苯丙氨酸和酪氨酸对合成途径中d s 的反馈调节，除了选育它们的缺陷型 外，还需选育苯丙氨酸和酪氨酸结构类似物抗性突变株，从而使d a h p 得 以大量合成，进而生成分支酸，并优先合成色氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸的 结构类似物有对氟苯丙氨酸( p f p ) 苯丙氨酸氧圬酸盐( p h e h x ) b 一2 - 噻 恩基丙氨酸、对氨基苯丙氨酸( p a p ) 、3 - 氨基酪氨酸( 3 一a t ) 、酪氨酸氧圬 酸盐( t y r h x ) 、d 酪氨酸等等。在具有前述一些标记的基础上增加这些结 构类似物的抗性标记，可以使色氨酸的产量进一步提高。 4 ) 切断进一步的代谢 选育色氨酸酶缺失的突变株、色氨酸脱羧酶缺失突变株、色氨酰t r n a 浙江人学硕一i ：学位论文 合成酶缺失突变株，可以减少色氨酸的消耗有利于色氨酸的积累。 添加前体发酵法：添加前体发酵法，又称为微生物转化法。这种方法使用葡萄 糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质( 即氨基酸生物合成途径中的一 些合适的中f 日j 代谢产物) 以避免氨基酸合成途径中反馈抑制作用，经过微生物作 用将其有效地转变为目的氨基酸。 由于很难完全解除生物合成的反馈抑制，建立直接发酵非常困难，利用前体添 加法生产l 一色氨酸的研究比直接发酵法早。以葡萄糖为碳源和能源，添加前体邻 氨基苯甲酸或吲哚进行培养，将前体转化为l 色氨酸。f u k u i 等有枯草杆菌选育 5 氟色氨酸抗性变异株，在含1 葡萄糖和5 可溶性淀粉的培养基中，连续流加 邻氨基苯甲酸，可积累l 色氨酸9 6 9 l 。n a k a y a m a 等进一步改造该变异株，使其 具有5 氟色氨酸和8 氮鸟嘌呤双重抗性，在含1 0 葡萄糖培养基中，连续流加邻 氨基苯甲酸，可积累l 色氨酸1 5 6 9 l ，同消耗的葡萄糖相比，其摩尔转化率为1 7 4 而邻氨基苯甲酸转化为l 色氨酸的摩尔转化率为9 9 发酵法得到的是l 一色氨酸，但是要得到个产量高的菌株相当困难，再加上 发酵周期长、设备要求高，成本较高。 酶法：酶法与发酵法紧密相连，是发酵工业发展的产物，但发酵法与酶法之间 又有区别。发酵法是利用微生物的生命活动，将简单的碳源、氮源，通过复杂的 代谢活动生成天然的产品，品种上有局限性。而酶法是利用微生物中特定的酶作 为催化剂，使底物经过酶催化生产所需要的产品。因为底物选择的多样性，故而 不限于制各天然的产品，借助酶的生物催化，可以使许多难以用发酵或合成法制 备的光学活性氨基酸有工业生产的可能。酶法因以下优势极具吸引力：( 1 ) 、具有 旋光特异性好，酶法生产得到的色氨酸为l 色氨酸；( 2 ) 、常温常压下反应，既安 全又节约能源；( 3 ) 、酶经过固定化，可以反复使用，成本较低。 由于发酵法生产l 一色氨酸的产酸率尚低，生产成本高，人们期望用酶法生产 l 一色氨酸， 有三种酶可用于合成l 色氨酸色氨酸合成酶、色氨酸酶( 色氨酸裂解酶) 、 吲哚甲基乙内酰脲水解酶。 塑坚查兰堕圭堂垡堡墨一一 表1 - 1 ：l 色氨酸的酶促合成反应 反应酶 微生物 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l i ) 吲哚+ d l 丝氨酸一l 色氨酸 色氨酸合成酶 恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a s + h 2 0丝氨酸消旋酶 p u t i d a ) 吲哚十丙酮酸+ 氨一l 色氨酸+雷氏变形杆菌( p r o t e u s h 2 0 r e t t g e r i ) 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a 色氨酸酶 吲哚+ l - 半胱氨酸一l 色氨酸 c o l i j + h 2 0 透明无色杆菌( a c h r o m o b a c t e r 吲哚+ l 一丝氨酸一l 一色氨酸+ 色氨酸合成酶 l i g u i d u m ) h 2 0色氨酸酶 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l i ) i m h 水解酶、n 产氨黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u m d l 一吲哚甲基乙内酰脲( i m h ) 胺甲酰一l 色氨酸 a m i n o g e n e s ) 一l 一色氨酸+ 氨+ h 2 0 水解酶 催化吲哚和l - 丝氨酸形成l 。色氨酸的酶有两种，它们是色氨酸合成酶 ( e c 4 2 1 2 0 ) 、色氨酸酶( e c 4 1 9 9 1 ) 前者是一种具有a2p2 亚基结构异质四 聚体复合体，容易解离成两个0 亚基和两个0 亚基，催化活性需要单价阳离子如 k + 和n h 4 + ，色氨酸合成酶的动力学特征明显优于色氨酸酶，但是吲哚对其抑制 强烈，而色氨酸酶对吲哚则具有良好的稳定性。 o k o z e k i 等所开发的用步法使化学合成法生产的d l 5 吲哚甲基乙内酰脲 ( d l - i m h ) 化学定量地不对称地转化为l 色氨酸的方法。用从土壤分离的新菌 产氨黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u m a m i n o g e n e s ) 水解l i m h ，残余的d i m h ，在反应 条件下可自发消旋为l 型。用色氨酸分解酶缺失变异型菌株进行反应时，使用 5 0 l 的d l i m h 定量地转化为l 色氨酸。此法由于巧妙地利用乙内酰脲自发消 旋的性质，具有较好的应用前景，由于市场上购买不到d l - i m h ，从土壤中分离 这种菌的工作不能进行。最近几年有很多文献报道这个酶，这个酶用于生产也需 解决底物不溶于水的问题。4 。“”“”1 利用色氨酸酶( l - 色氨酸吲哚裂解酶) 生产l 色氨酸的报道较多，由于吲哚 对该酶的抑制情况好于对色氨酸合成酶。至少有两种菌产色氨酸酶，一是雷氏变 浙江人学硕l j 学位论文 形杆菌，二是大肠杆菌。该酶能将色氨酸裂解为吲哚和丙酮酸，在高浓度铵盐的 条件下能将吲哚、丙酮酸和氨转变为l 色氨酸，也能把吲哚和l 一丝氨酸转变为l - 色氨酸。由于l - 丝氨酸价格昂贵，目前这条路线在工业上不可行，如果将来l 一丝 氨酸的价格降下来则可以走这条路线。有人在开发丝氨酸转羟甲基酶，用甘氨酸 和甲醇或甲醛生产l 丝氨酸。利用吲哚、丙酮酸和氨合成色氨酸是可行的因为 市场上丙酮酸的价格不高，国内已有厂家生产，零售价8 0 元公斤。有同本人筛选 出硫辛酸缺陷菌株生产丙酮酸，培养菌体时添加硫辛酸，收获菌体后洗涤菌体， 这种菌体可以将葡萄糖转变为丙酮酸，因为菌体不能合成硫辛酸，不能将丙酮酸 转变为乙酰辅酶a 而积累丙酮酸，这种方法得到的丙酮酸不须提取即可用于合成 色氨酸，这样可以降低成本。”韦平和等报道了利用色氨酸酶以l 半胱氨酸和吲 哚合成色氨酸，所用的底物l 半胱氨酸可通过毛发水解提取l 胱氨酸后电解还原 制得产量高，价格低廉，且l 半胱氨酸的转化率为9 3 2 ，吲哚转化率为9 0 1 产 品总回收率为7 0 ，所以色氨酸酶有很好的应用前景。 1 4 色氨酸生产的基因工程进展 早在1 9 7 4 年h e r s h f i e l d 等将整个色氨酸操纵子克隆，设法提高发酵生产水平， 但是在发酵法生产中调节基因的缺失和色氨酸反馈抑制的解除是大量生产色氨酸 的基本需要，宿主菌中色氨酸酶缺陷对于色氨酸的生产是非常有效的。质粒拷贝 数增加，色氨酸合成酶活性增加，但随着色氨酸合成酶活性的增加，质粒的稳定 性下降，出于操纵子中有弱化子效应，所以通过克隆整个操纵子所构建的重组工 程菌，其色氨酸产率偏低达，不到工业化生产的要求。所以基因克隆转向色氨酸 合成的关键酶即色氨酸合成酶的基因克隆，但是底物吲哚对该酶的强烈抑制以及 底物之一l 一丝氨酸价格昂贵，使得该酶用于酶法合成色氨酸受到限制。 近年来，人们将注意力集中到色氨酸酶上，1 9 8 5 年h a m i l t o n 等克隆了大肠杆 菌的色氨酸酶基因，酶促转化产色氨酸2 0 0 9 l ( 用l 丝氨酸做底物) s h i b a t a n i 等 ( 1 9 8 7 ) 克隆了a l c a l i g e n e sf e c a l i s 的色氨酸酶基因，工程菌比野生型高4 倍， t e r a s a w a 等( 1 9 9 0 ) 构建了重组质粒p b r 3 2 2 t n a a ，用t n a a 基因酶替换色氨酸 操纵子的结构基因，胞内缺乏色氨酸时合成启动，如果胞内有色氨酸，合成的色 氨酸酶会把色氨酸分解进一步促进色氨酸酶的合成，不需要用昂贵的吲哚丙烯酸 k 簟， 1； 、 、 塑婆；苎堂堡圭兰垡鲨壅 一一 诱导又可以避开分解代谢产物阻遏。在葡萄糖存在的条件下仍然有表达，活性比 供体菌高5 0 0 倍，酶促转化产色氨酸2 0 0 9 l ( 用l 。丝氨酸做底物) 。国内张玉彬 等( 1 9 9 6 ) 构建了重组质粒p t a s e 9 ，转化宿主j m l 0 5 ，其色氨酸酶表达量占菌体 总蛋白的3 0 ，但是活性只是供体菌的2 倍。这与表达时形成了包涵体或表达时 非正确折叠有关。 本论文设法克隆提高目的基因的拷贝数以提高色氨酸酶的活性。有人利用色 氨酸酶的操纵子中固有的b a m h i 和h i n d l i i 位点色氨酸酶操纵子前半部分( 含启 动子、调节基因m a c 和色氨酸酶结构基因) 克隆到质粒载体上然后转化氨酸酶缺 陷菌株，得到了有色氨酸酶活性的菌株。提高基因拷贝数提高表达产量是常用的 手法，如前所述，提高色氨酸操纵子的拷贝数能适当提高色氨酸合成酶的活性， 只是由于衰减调节机制，不能明显提高活性，h a m i l t o n 等将深红酵母( r h o d o t o r u l a r u b r a ) 的苯丙氨酸解氨酶的基因连接到质粒上，通过转化获得了基因扩增菌株， 将该菌株的完整细胞以包埋法固定后组成生物反应器可以将0 3 7 m 肉桂酸和 7 8 5 m 氨生成o 3 5 m ( 5 9 9 l ) 的苯丙氨酸。“ 1 5 酶的合成调节 酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这 是一种在基因水平上的代谢调节。凡是能促进酶生物合成的现象称为诱导 ( i n d u c t i o n ) ，而能阻碍酶生物合成的现象称为阻遏( r e p r e s s i o n ) 。 诱导调节：根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶的底物或其有关的物质 的关系，可以把酶划分为组成酶和诱导酶两类。组成酶是细胞固有的酶类，其合 成是在相应的基因控制下进行的，它不因不分解底物或其结构类似物的存在而受 到影响。诱导酶则是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶， 如b 一半乳糖苷酶。能促进诱导酶产生的物质被称为诱导物，它可以是酶的底物， 也可以是难以代谢的底物结构类似物或是它的前体物质。例如能诱导b 半乳糖苷 酶的除了正常底物乳糖外，不能被其利用的乳糖的结构类似物异丙基一b d 一硫代半 乳糖苷( i p t g ) 也可以诱导该酶的合成，而且其诱导活性比乳糖高。色氨酸酶的 合成就需要色氨酸作为诱导物。 阻遏调节：在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除可 浙江大学硕士学位论文 用反馈抑制来抑制该途径关键酶的活性调节外，可以通过阻遏作用来阻遏代谢途 径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成。阻遏作用可以有利于生物体内节约 有限的养料和能量。阻遏的类型有末端代谢产物的阻遏和分解代谢产物的阻遏两 种。 a ) 、末端代谢产物的阻遏指由某代谢末端产物的过量积累而引起的阻遏。 对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况的较为简单，即产物作用于代谢途 径中的各种酶，使之合成受到阻遏，例如精氨酸的生物合成途径。对于分支代谢 途径可以看前面的芳香族氨基酸生物合成的反馈阻遏的例子。 b ) 分解代谢产物的阻遏指细胞内同时有两种分解底物( 碳源或氮源) 存 在时利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。如葡萄 糖的存在阻遏了乳糖酶系的合成，这一现象又被称为葡萄糖效应。人们把类似于 葡萄糖效应的阻遏统称为分解代谢产物的阻遏。“6 色氨酸酶的合成也受到分解代 谢产物的阻遏。在葡萄糖存在的条件下检测不到色氨酸酶的活性。”最有名的解 释分解代谢产物的阻遏的机制为乳糖操纵子假说，即一组功能相关的基因，它由 启动基因、操纵基因和结构基因三部分组成。当含有诱导物时，诱导物与阻遏蛋 白结合使之失去阻遏作用，r n a 聚合酶结合到d n a 上才有可能。此外乳糖操纵 子还受到另外一种调节即正调节的控制，当第二种调节蛋白c r p ( c a m p 受体蛋 白质) 或c a p ( 降解物激活蛋白) 直接与启动基因结合时，r n a 聚合酶可以结 合到d n a 上并开始转录，c r p 与c a m p 的相互作用，会提高c r p 与启动基因的 亲和性。葡萄糖会抑制c a m p 的形成，从而阻遏了操纵子的转录。 1 6 色氨酸酶操纵子 色氨酸酶的表达是由色氨酸酶操纵子( t n a a o p e r o n ) 控制，该操纵子包 含一个启动子、一个短肽调节基因m a c ，和两个结构基因t n a a 和t n a b ，结构基 因t n a a 编码色氨酸酶，结构基因t n a b 编码色氨酸渗透酶，调节基因t n a c 位于 启动子和结构基因之间，通过转录抗终止的机制控制结构基因的表达，其结构基 因的转录由于p 因子的存在使得转录被终止，当培养基中有色氨酸时调节基因c 编码的短肽可以起到转录抗终止的作用。它受到分解代谢产物的阻遏，在缺乏葡 萄糖等易于利用的碳源时，在色氨酸存在的条件下表达，该菌能在以l _ 色氨酸为 浙江大学硕士学位论文 唯一碳源的培养基中生长。 1 7 关于包涵体 基因工程菌在表达目标蛋白时，由于过表达形成水不溶性的核酸和蛋白质的 复合物，称为包涵体，这种形式的蛋白质没有正确的空间结构，没有生物学活性， 原核生物胞内缺乏氧化环境，不能正确的形成二硫键，真核生物来源的蛋白质在 胞内很难表达出有生物活性的蛋白质，需要通过分泌表达到周质或胞外直接获得 有生物学活性的蛋白质。但是，真核生物来源的蛋白质可以很容易地在大肠杆菌 中表达形成包涵体，要想得到有生物学活性的蛋白质，如细胞因子、酶、抗原、 抗体，需要重溶包涵体并复性之，许多酶和细胞因子可以通过复性方法生产，如 r n a s e a 、b 乳糖酶、溶菌酶、i n f y 、9 。g h 、m c s f 和b m p 一2 等。 由于表达目标蛋白时，很容易形成包涵体，防止形成包涵体对提高蛋白质生 物活性非常重要。了解体外蛋白质复性的原理和方法可能有助于提高目标蛋白在 胞内的活性，因为在复性方案的探索中，很重要的一点就是防止蛋白质分子间的 聚合。 非正确折叠的不具正常空间结构的蛋白质通过一定手段使之形成正确空间结 构的过程称为复性。在包涵体蛋白质复性之前，首先要将包涵体溶解，常用高浓 度的变性剂如盐酸胍或尿素溶解，另外添加一定量的还原剂，如巯基乙醇、d t t 等，将所有的二硫键还原。 将溶解的蛋白质通过稀释、透析等方法降低变性剂和还原剂的浓度，使蛋白 质在复性缓冲液中复性，复性缓冲液大致由以下组分：1 ) 缓冲系统，其作用是维 持溶液的p h 值：2 ) 变性剂，使错误折叠的蛋白质重新折叠，常用的有尿素和盐 酸胍；3 ) 氧化还原系统：其作用是使二硫键形成和交换如g s h g s s g 、胱氨酸 半胱氨酸等。4 ) 助溶物质，如浓度的盐、l - a r g 、表面活性剂和两性分子等，其 作用主要是帮助蛋白质溶解，见表1 2 ；5 ) 其它添加剂，如糖类、p e g 、甘油、 甘露醇等，其作用是稳定蛋白质分子。见表1 2 。 表1 2 ：体外复性中常用的添加剂“ 浙江大学硕士学位论文 种别添加剂应用例子 p f l u o r e s c e n s l i p a s o g d m c ih e n e g g w h i t el y s o z y m e c a r b o n i ca n h v d r a s e1 1 p o r c i n e g r o w t h h o r m o n e 非变性浓度的变u r e a h e n e g g - w h i t el y s o z y m e i g f - 1 悱荆 i n t e r f e r o n - b - p o l y p e p t i d e s pf l u o r e s c e n s l i p a s e h e n e g g w h i t el y s o z y m e l a r g f a bf l a g m e n t a g l u o c o s i d a s e 盐a m m o n i u m s u l p h a t e h e n e g g w h i t el y s o z y m e g l y c e r o lp f l u o r e s c e n s l i p a s e h e n e g g - w h i t el y s o z y m e 糖类 l g f 一1 s u c r o s e i g f 一1 g l u c o s e h e n e g g - w h i t el y s o z y m eh e ne g g - n a c e t y lg l u c o s a m i n ew h i t e l v s o z v m e n 一甲基汁氨酸( s a r c o s i n e )h e n e g g w h i t el y s o z y m e c h a p s t g f b l i k e p r o t e i n c a r b o n i c a n h y d r a s e 1 1 e e n h u m a ng r o w t hh o r m o n e s d s i n t e r f e r o n 一1 3 - p o l y p e p t i d e s s a r k o s y l r n a p o l y m e r a s e0 f a c t o r 去污剂0 表面 s o d i u m l a u o r s y l s a r c o s i n e s i n g l ec h a i nf vf r a g m e n t 性剂d o d e c y lm a l t o s i d e c l a s s i im h c t r i t o nx 1 0 0 c a r b o n i c a n h y d r a s e 1 i p o l y e t h e n eg l y c o l c a r b o n i c a n h