（应用化学专业论文）蜡蚧轮枝菌固态发酵产孢培养的研究.pdf

浙江理工人学硕士学位论文 摘要 蜡蚧轮枝菌( v e r t i c i l l i u ml e c a n i i ) 是一种重要的生物防治真菌，寄主范围广， 能寄生蚧类、蚜虫类、螨类、粉虱，还可寄生鳞翅目的一些害虫、线虫等，在生物 防治中有重要的应用价值。固态发酵具有设备投资少、能耗低、污染少、容易操作 等特点，非常适用于蜡蚧轮枝菌的治病活体分生孢子的生产。本论文研究了蜡蚧轮 枝菌的常规固态发酵及惰性载体吸附固态发酵产孢：优化了吸附的液体培养基和培 养参数，比较了天然及合成惰性载体吸附固态发酵产孢性能的差异，并对p u 软质 泡沫吸附固态发酵产生的分生孢子进行了抗逆性测定，最终建立了一个可回收利用、 便于操作的p u 软质泡沫吸附固态发酵体系，取得了较好的结果。 1 对蜡蚧轮枝菌菌株( v e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s10 2 0 71 ) 的原始菌种进行了活 化培养，研究了p d a 平板菌落、菌丝及孢子形态，最后确定成功的获得了原始菌株 的纯培养，并按照真菌的保藏方法进行了保藏；以麦麸为天然固态发酵基质进行了 常规的固态发酵，优化了发酵参数，确定了优化条件下的蜡蚧轮枝菌菌株 ( v e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s1 0 2 0 7 1 ) 的产孢量及周期：最适温度在2 3 - 2 5 ，最适料 水比为5 ：4 ，接种浓度为8 x 1 0 7 孢子m l ；优化后麦麸产孢量约为2 4 0 x 1 0 9 孢子儋干 重，培养6 - - 8 d 达到最大产孢量。 2 以废弃的甘蔗渣作为惰性载体，进行惰性载体吸附固态发酵。先对吸附的 液体培养基进行了统计优化，获得了优化的培养基配方( g 1 ) ：玉米粉3 5 7 9 ，酵 母膏8 6 9 ，k h 2 p 0 41 6 3 ，k 2 h p 0 4 0 5 ，m g s 0 2 0 2 5 。然后将常规的麦麸固态发酵和 甘蔗渣吸附固态发酵的产孢量进行比较：优化培养基后，甘蔗渣吸附固态发酵产孢 量达到1 0 8 1 0 1 0 孢子儋干重，比麦麸常规固态发酵产孢量( 2 4 0 x 1 0 9 孢子儋干重) 提高约3 5 0 。 3 选择5 种惰性载体( 甘蔗渣、玉米芯、稻草、p u 软质泡沫、活性炭) ，研 究吸附经过优化的液体培养液固态发酵产孢性能的差异。比较了产孢量、生长曲线、 分生孢子萌发率：甘蔗渣、p u 泡沫吸附固态发酵的产孢量最高；甘蔗渣、p u 泡沫 吸附固态发酵的稳定期较长，不易衰亡：5 种不同的惰性载体固态发酵产生的分生 浙江理t 大学硕上学位论文 孢子2 4 h 的萌发率都为1 0 0 。通过比较分析，最终选择了可以回收重复利用的p u 软质泡沫作为后续固态发酵产孢的惰性载体。 4 对p u 软质泡沫吸附固态发酵参数进行了研究，确定了适宜的产孢子条件 及最优条件下的产孢量和周期：培养温度2 5 、吸附培养液1 4 m l 、培养基初始 p h = 5 5 、接种量1 6 x1 0 7 孢子、菌种代数第二代、菌龄为6 d ；在优化条件下，最高 产孢量约为2 0 5 x1 0 1 0 孢子儋干重，培养1 0 - 1 3 d 获得最高的产孢量。 5 分生孢子的抗逆性研究。对p u 软质泡沫吸附固态发酵体系生产的分生孢 子的耐高温、低湿度、紫外线辐射进行了研究：温度从3 0 - - - , 4 0 时，分生孢子的萌 发率从9 7 - 1 0 ；在相对湿9 0 - - - 6 5 下，分生孢子的萌发率逐渐在下降，萌发率从 9 8 - 0 ；在用紫外线辐射从3 0 , - 一3 0 0 s 时，分生孢子的萌发率不断在减小，从9 6 降到2 4 。这些参数与文献报道的其它蜡蚧轮枝菌分生孢子相比，p u 软质泡沫吸 附固态发酵体系生产的v e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s1 0 2 0 7 1 分生孢子有较好的抗逆性。 关键词：蜡蚧轮枝菌、固态发酵、部分因子设计、中心组合设计、响应面法、惰 性载体、分生孢子、p u 泡沫、萌发率 i i 浙江理丁大学硕一l ：学位论文 s t u d yo ns p o r ep r o d u c t i o no fv e r t i c i l l i u ml e c a n i ii ns o l i d - s t a t e f e r m e n t a t i o n a b s t r a c t v e r t i c i l l i u ml e c a n i ii saw e l lk n o w ne n t o m o p a t h o g e n i cf u n g u sw i t hab r o a dr a n g eo f h o s t si n c l u d i n gc o l e o p t e r a ，o r t h o p t e t a ，h o m o p t e r a , l e p i d o p t e r aa n dc u c u m b e rp o w d e r y m i l d e w ，t h u si tp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt h eb i o l o g i c a lc o n t r 0 1 s o l i d - s a t ef e r m e n t a t i o n h a sa d v a n t a g e ss u c ha sl o wi n v e s t m e n ti ne q u i p m e n t s ，l o we n e r g yc o n s u m p t i o n ，r a r e p o l l u t i o na n db e i n ge a s yt oo p e r a t e ，s oi ti ss u i t a b l ef o rs p o r ep r o d u c t i o no fv e r t i c i l l i u m l e c a n i i 。t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s i n go nt h es p o r ep r o d u c t i o no fv e r t i c i l l i u ml e c a n i ii n n o r m a ls o l i d s t a t ea n di n e r tc a r r i e ra d s o r b e ds o l i d - s t a t ef e r m e n t a i o n ，t h ef o l l o w i n g a s p e c t s w e r es t u d i e d ：o p t i m i z a t i o no fl i q u i dm e d i u ma n df e r m e n t a t i o np a r a m e t e r s ， a n a l y z i n gt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nn a t u r a li n e r tc a r r i e ra n da r t i f i c i a li n e r tc a r r i e ra d s o r b e d f e r m e n t a t i o nf o rt h es p o r ep r o d u c t i o n ，m e n s u r a t i n gt h es t r e s sr e s i s t a n c eo fc o n i d i u mi n s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nu s i n gp uf o a ma si n e r tc a r r i e r f i n a l l y ，ar e c y c l a b l ea n de a s i l y o p e r a t e ds o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e du s i n gp uf o a ma si n e r tc a r t i e r , a n ds a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r ea c h i e v e d 1 v e r t & i l l i u ml e c a n i ic b s10 2 0 71w a sa c t i v a t e di nt h ep d ap l a t e ，a n dt h e m o r p h o l o g i e so fc o l o n y ，m y c e l i u ma n dc o n i d i u mw e r eo b s e r v e d ，t h ep u r ec u l t u r ew a s a l s os u c c e s s f u l l ya c h i e v e da tl a s t t h eo p t i m a lp a r a m e t e r su s i n gw h e a tb r a na ss u b s t r a t e f o rs p o r u l a t i o no fv e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s10 2 0 71i ns o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nw e r e a s c e r t a i n e d ：o p t i m a lt e m p e r a t u r e2 3 2 5 。c ，i n i t i a lm a t e r i a l w a t e rr a t i o5 ：4 ，i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n8 107 s p o r e s m l ；u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，m a x i m u ms p o r ey i e l d r e a c h e d2 4 0 x10 s p o r e s gd r ym a t t e r 2 t h es p o m l a t i o no fv e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s10 2 0 71i ns o l i d s a t ef e r m e n t a t i o n u s i n gs u g a r c a n eb a g a s s ea si n e r tc a r r i e rw a se v a l u a t e d 。f i r s t ，t h ei n g r e d i e n t so fa d s o r b i n g l i q u i dm e d i u mw e r ea s c e r t a i n e db ys t a t i s t i c a lo p t i m i z a t i o n ：c o r nf l o u r35 7 9 9 1 ，y e a s t e x t r a c t s8 6 9 9 1 ，k h 2 p 0 41 6 3 9 l ，k 2 h p 0 4o s g 1 ，m g s 0 20 2 5 1 s e c o n d ，a f t e rm e d i u m o p t i m i z a t i o n ，m a x i m u ms p o r ey i e l d i ns u g a r c a n eb a g a s s ea d s o r b i n gl i q u i dm e d i u m i i i r e a c h e d1 0 8 x l o s p o r e s gd r ym a t t e r ，i n c r e a s e db y3 5 0 t h a nw h e a tb r a n ( 2 4 0 x 1 0 9 s p o r e s gd r ym a t t e r ) 3 t h e5d i f f e r e n tm a t e r i a l s ：s u g a r c a n eb a g a s s e ，c o r n c o b ，h a u l m ，p uf o a ma n d a c t i v a t e dc a r b o n ，w h i c hw e r eu s e da si n e r tc a r r i e rf o rs p o r u l a t i o no fv e r t i c i l l i u mt e c n n 珏 c b s10 2 0 71i ns o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n ，w e r ei n v e s t i g a t e d ：s u g a r c a n eb a g a s s ea n dp u f o a ma d s o r b e ds o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nh a dm a x i m u ms p o r ey i e l da n dl o n gs t a t i o n a r y p h a s e ，t h ec o n i d i u mp r o d u c e db yt h e5i n e r tc a r r i e r sa d s o r b e ds o l i d s t a t ef e n n e m a t i o n h a dt h es a n l eg e r m i n a t i o nr a t ea t2 4h o u r s f i n a l l y ，t h er e c o v e r a b l ep uf o a mw a sc h o o s e d a si n e r tc a r r i e rf o rs p o r u l a t i o no fv e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s10 2 0 7 1i nt h ef o l l o w i n g s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n 4 c u l t u r e di nt h ep uf o a ma d s o r b e df e r m e n t a t i o nf o rs p o r u l a t i o no fv e r t i c i l l i “m l e c a n i ic b s10 2 0 7 1 ，o p t i m u mp a r a m e t e r sw e r ea s c e r t a i n e d ：c u l t u r et e m p e r a t u r e2 5 c ， l i q u i dm e d i u mv o l u m ea d s o r b e d14 m l ，i n o c u l u ma m o u n t16 xl0 7 s p o r e s ，s e c o n d a y g e n e r a t i o n ，c e l la g e6 d a y s u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n ，t h em a x i m u ms p o r ey i e l do f v e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s1 0 2 0 7 1r e a c h e d2 0 5 x 1 0 1 0s p o r e s gd r ym a t t e ra t h a r v e s t i n g t i m ef r o m10 d a y st o13 d a y s 5 ，t h es t r e s sr e s i s t a n c eo fc o n i d i a mp r o d u c e di np uf o a ma d s o r b e ds o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o nw a se v a l u a t e d ：w i t ht h ei n c r e a s i n gt e m p e r a t u r ef r o m3 0 ct o4 0 。c ，t h e g e r m i n a t i o nr a t eo fc o n i d i u md e c r e a s e df r o m9 7 t o10 ：w h e nt h er e l a t i v eh u m i d i t y d e c r e a s ef r o m9 0 t o6 5 ，t h eg e r m i n a t i o nr a t eo fc o r t i d i u md e c r e a s e df r o m9 8 t o0 ： w i t ht h ei n c r e a s i n gr a d i a n tt i m eb yu vf r o m3 0 st o 3 0 0 s ，t h eg e r m i n a t i o nr a t eo f c o n i d i u md e c r e a s ef r o m9 6 t o2 4 t h e s ep a r a m e t e r si n d i c a t e dt h a tc o n i d i u mo f v e r t i c i l l i u ml e c a n i ic b s10 2 0 71i np uf o a ma d s o r b e ds o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nh a db e t t e r s t r e s sr e s i s t a n c ep r o p e r t i e si nc o n t r a s tt oo t h e rs t r a i n sr e p o r t e d k e y w o r d s ：v e r t i c i l l i u m c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ， f o a m ，g e r m i n a t i o nr a t e l e c a n i ls o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n ，f r a c t i o n a lf a c t o r i a ld e s i g n ， r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ，i n e r tc a r r i e r ，c o n i d i u m ，p u i v 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：石玉杰 日期：细7 年弓月岁日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密图 学位论文作者签名：石五杰 日期：2 q 年弓月箩日 年解密后使用本版权书。 浙江理工人学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 引言 长期以来，各国政府和研究机构花费大量的人力才力去研制化学农药，化学农 药的广泛使用一度有效控制了病虫害，提高了农作物产量，然而却产生了严重的环 境安全和食品安全问题：化学农药残留和污染环境，特别是食品中的化学农药残留 严重威胁人们的生命健康；大量的使用化学农药迫使病虫的抗药性急剧上升，会导 致化学农药使用量不断增加，危害更大；化学农药会杀伤害虫的天敌，破坏生态平 衡，会引发次级害虫的大爆发。国际上将这三种巨大威胁称为“3 r ，也就是 “r e s i s t a n c e ，r e s i d u e ，r e s u r g e n c e 【l 】o 1 9 9 2 年的世界环境与发展大会就明确要求在全球范围内控制化学农药的销售 和使用，加强农药残留的毒理学研究，对有致癌作用的化学农药严禁使用，不断提 高生物农药所占比重。据联合国粮农组织调查资料介绍，全球每年被病虫害夺去的 谷物占收成的2 0 3 0 ，由此造成的经济损失达1 2 0 0 亿美元。世界各国为了对付 日益复杂的病虫害，每年要生产各种化学农药，这些化学农药相当部分是高毒高残 留，会使病虫的抗药性增强，以致发生大规模的此级危害。我国每年农药使用都在 8 0 - - 1 0 0 力吨左右，而且农药结构极不合理，集中体现在3 个7 0 ，即杀虫剂占农药 总量的7 0 ，有机磷农药占杀虫剂的7 0 ，有机磷农药中高毒品种占7 0 。据估算， 2 0 0 2 年以来，国外的“绿色壁垒”造成我国农产品出口直接损失约在1 0 0 亿美元左右， 仅1 9 9 8 年就因此被退货7 4 亿美元，化学农药残留严重影响了我国农产品出口和国家 形象。作为化学农药使用量居世界前列的国家，我国对高毒化学农药的使用控制已 经日益紧迫。 目前世界上已发现可用作防治病虫草害等具有农药作用的细菌1 0 0 余种、真菌 5 0 0 余种、病毒7 0 0 余种、植物4 0 0 0 余种，再加上线虫、微生物代谢物、抗生素等， 数量巨大，而我国幅员辽阔，微生物资源丰富，这将为生物农药的开发提供很坚强 的研发平台。针对我国已经人世，发达国家纷纷调整提高了产品进口的技术门槛， 农产品受到的影响首当其冲。生物农药属于环境友好型产品，发展生物农药，从而 浙江理工大学硕+ 学位论文 减少化学农药和化肥的使用，将为我国农产品出口创造十分有利的条件，极大地增 强我国农产品的国际竞争力。此外，发展生物农药将有效地实现农产品的优质安全 生产，提升农产品的经济附加值，扩大我国农副产品外销市场，推进绿色农业产业 的发展，在未来农药市场格局中，生物农药的产量和比重必将不断提高。 1 2 微生物农药的研究 1 2 1 微生物农药 生物农药是指利用生物活体或其代谢产物对害虫、病菌、杂草、线虫、鼠类等 有害生物进行防治，或是通过仿生合成具有特异性作用的农药制剂。生物农药按照 其成分和来源可分为微生物活体农药、微生物代谢产物农药、植物源农药、动物源 农药4 个部分；按照防治对象可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、杀鼠剂、植 物生长调节剂等。在实际应用中，生物农药泛指可以进行大规模工业化生产的微生 物源农药【2 1 。 微生物农药是生物农药的重要组成部分，它是指利用微生物及其基因产生或表 达的各种生物活性物质成分，制备出用于防治植物病虫害、环卫昆虫、杂草以及调 节植物生长的制剂的总称。能够用于制备微生物农药的微生物类群，包括细菌、真 菌以及病毒等，微生物农药具有对生态环境影响小、对人畜安全、可利用农副产品 进行生产加工、生物设备通用性较好、产品改良技术潜力大和开发投资风险相对较 小等优点，与保护生态环境和社会协调发展的要求相吻合【3 】。因此开发利用有益微 生物及其生物代谢产物来防治病虫害已经成为一项重要的研究课题。 1 2 2 微生物农药的种类 微生物农药包括微生物杀虫剂、微生物杀菌剂、微生物除草剂、微生物调节剂、 微生物杀鼠剂f 4 】。目前，国内外研究开发并形成商品化产品的主要有细菌类杀虫剂、 病毒类杀虫剂、真菌类杀虫剂。 细菌类杀虫剂主要有苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s 纽b t ) 、日本金龟子 芽孢杆菌和球形芽孢杆菌，其中苏云金芽孢杆菌是最具有代表性的品种。病毒类杀 虫剂是一类以昆虫为寄主的病毒类群，应用比较普遍的有核型多角体病毒 2 浙江理t 大学硕十学位论文 ( n u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ，n p v ) 、颗粒体病毒( g r a n u l o v i r u s ，g v ) 和质型多角体病 毒( c y p o v i r u s ，c p v ) ，可用于防治棉铃虫、斜纹夜蛾、菜青虫和黄地老虎等。真 菌类杀虫剂是一类寄生谱比较广泛的生物防治剂，目前研究利用的主要种类有蜡蚧 轮枝菌( v e r t i c i l l i u ml e c a n i i ) 、白僵菌( b e a u v e r i a ) 、绿僵菌( m e t a r h i z i u m ) 、拟 青霉( p a e c i l o m y c e s ) 和座壳孢菌( a s c h e r s o n i a ) 等。 1 3 蜡蚧轮枝菌的研究概况 1 3 1 蜡蚧轮枝菌的分类 蜡蚧轮枝菌最早由斯里兰卡的n i e t e r 于1 8 6 1 年作为一种昆虫病原菌记录的，是虫 生真菌中的重要一员，属轮枝菌属，是轮枝菌的典型代表1 5 。18 9 8 年，z i m m e r m a n n 定名为蜡蚧头孢霉( c e p h a l o s p o r i u ml e c a n i i ) ，1 9 3 9 年，v i e g a s 将蜡蚧头孢霉并入轮 枝菌属，并定名为蜡蚧轮枝菌( v e r t i c i l l i u ml e c a n i i z i m m e r m a n n v i e g a s ) ，1 9 7 1 年， g a m s 把多数虫生的头孢霉也归在轮枝菌属中t 6 。但由于菌株问的生长及菌落特征差 异显著、对于其有性型处于争论阶段，造成该属鉴定、分类上的困难。最新的分类 是根据2 1 种形态学及2 0 种生理生化特性来研究v e r t i c i l l i u m 属6 4 种的系统关系，并应 用g o w e r sc o e f f - 方法，计算菌株问的相似性，最终通过联合分类方法把分离的6 4 种 蜡蚧轮枝菌分为6 个群体：来源于昆虫的蚜虫科；来自u k ( 英国) 源的菌株；从咖 啡锈病病原菌分离的菌株；植物锈病重寄生物包括形p s a l l i o t a e 从主要分布在热带 蚧类昆虫虫尸分离的菌株包括矿a l b o a t r u m ；其余的主要来自虫草菌c o r d y c e p s 、 t o r r u b i e l l a 及感染的热带森林节肢动物【7 8 】。 1 3 2 蜡蚧轮枝菌的形态特征 蜡蚧轮枝菌在麦芽琼脂平板上，菌落为圆形、白色，培养1 0 d 菌落直径为2 2 2 5 m m ，1 4 d 为3 l 一3 4 m m ；菌落表面呈绒毛状至絮状，结构致密、扩展，菌落中央有 不规则沟纹，边缘波浪状，菌落背面成奶油黄色，无可溶性色素。气生菌丝有分枝， 宽度为1 1 1 9 ( 2 8 ) u m 。分生孢子梗透明，基部形大，向上逐渐变细，呈现锥形， 单生、对生或轮生在菌丝上。每一轮从气生菌丝的同一位置上可长出分生孢子，分 生孢子透明，呈椭圆形、卵形或柱形，偶尔有圆形；分生孢子在分生孢子梗顶端粘 3 浙江理工火学硕j ：学位论文 结成球形头状，直径为4 1 0 u m ，遇水解体，释放出分生孢子。每个球形头状体通 常含孢子数6 - 2 5 个，个别可达7 0 个，不存在厚垣孢子，来自不同昆虫和非昆虫寄主、 土壤和采集地点的蜡蚧轮枝菌的分生孢子大小变化范围很大，从2 1 8 u r n 3 到 18 2 5 u m 3 1 9 , 1 0 】。 在p d a ( 马铃薯葡糖琼脂培养基) 上，蜡蚧轮枝菌的菌落也为圆形、雪白色、 菌落中央隆起，表面有或无辐射状纹沟，较致密，呈绒毛至絮状，培养1 0 d 菌落直径 达到2 4 2 7 删= i l ，1 4 d 为3 1 - - 3 8 m m ，菌落背面成奶油黄色，无可溶性色素【1 1 1 。 1 3 3 蜡蚧轮枝菌的毒素 感染了蜡蚧轮枝菌的虫尸或植物病原菌一般布满白色绒毛状的菌丝及分生孢 子，而感染了蜡蚧轮枝菌的梨蓟马( t a e n i o t h r i p si n c o s e q u e n s ) 幼虫虫尸，却长满了 粉红色的绒毛状菌丝及分生孢子，这种粉红色被认为是昆虫表皮对蜡蚧轮枝菌毒素 的一种反应【1 2 】。已知蜡蚧轮枝菌毒素种有以下三种。 1 3 3 1 球孢交酯( c 1 2 h 2 1 n 0 3 ) n 一类似球孢白僵菌中产生的环状羧酸肽类物质。1 9 7 8 年，日本学者k a n a o k a 从一 株由家蚕蛹虫尸上分离的蜡蚧轮枝菌的曲丝中提取到并获得了非结晶体【1 3 1 。在查氏 培养基中，2 6 5 c 培养1 0 d 后，经过提取纯化，1 升培养液能得至l j l 6 m g 的白僵菌交酯。 此物质对家蚕、棉铃虫幼虫有胃毒作用，在2 u g l a r v a 的剂量时可诱导引起虫体滞缓 效应，5 u g 1 a r v a 的剂量可以引起致死作用【1 4 j 。 1 3 3 2 吡啶2 ，6 一二羧酸 1 9 8 2 年，英国学者n o r m a n 通过对不同来源的7 个菌株的活性产物进行提取，实 验表明：6 个菌株能产生有杀虫活性的次生代谢产物吡啶2 ，6 一二羧酸，另外还有两 种产量极少但毒性较高的c 2 5 化合物：c 2 5 h 3 8 0 3 ，c 2 5 h 3 8 0 4 。吡啶2 ，6 一二羧酸的钠盐 对红头丽蝇( c a l l i p h o r ae r y t h r o c e p h a l a ) 有毒性，4 8 h 的l d s o 是4 0 u 虫，尽管毒性 较低，但是1 l 发酵液可产生3 2 0 m g 的化合物。目前对于2 ，6 一二羧酸的作用机理尚不 清楚，但实验结果表明：单价吡啶羧酸对丽蝇没有杀虫活性，原因可能是由于阳离 4 浙江理工人学硕上学位论文 子参与的三齿配体的协调模式，这与由布氏白僵菌产生的草酸的作用方式相类似。 c 2 5 化合物( c 2 5 h 3 8 0 3 ，c 2 5 h 3 8 0 4 ) 通过注射对家蝇的毒性为4 8 h 、l d 5 01 3 u g 3 1 1 t 14 1 。 1 3 3 3 内毒素磷酸酯 1 9 9 4 年，以色列学者g i n d i n 等用萨氏液体培养基对一株由棉籽长蝽 ( o x y c a r e n u sh y a l i n i p e n n 括) 上分离的蜡蚧轮枝菌进行摇瓶培养，2 5 c 下培养7 d 后， 从菌丝中提取纯化到该物质，但具体结构不清矧1 5 】。烟粉虱( b t a b a c i ) 幼虫对此毒 性非常敏感，在0 0 1 的浓度下就能引起个别死亡，0 1 的浓度下死亡率达3 3 6 ， 当浓度提高到0 5 时，能达到9 0 的死亡率。幼虫表现为脱水、虫体颜色变成暗黄， 逐渐微缩干燥死亡。蚜虫对此毒素最敏感，暴露在此毒素下1 0 - - 2 0 m i n 后，腿部就 发生麻痹。此外，蓟马成虫也高度敏感。g i n d i n 等认为该毒素可能是在感染后期、 真菌细胞发生降解时产生【”】。 1 3 4 蜡蚧轮枝菌的致病性 蜡蚧轮枝菌不同菌株的寄主专一性很强，致病力的差异性也较大【”】。环境因 素及寄主因素等都对其的致病性有影响作用。j a c k s o n 等通过对18 种蚜虫 ( m a c r o s i p h o n i e l l as n a b o n i ) 具有不同致病力的蜡蚧轮枝菌的研究，发现影响致病 力的因素有：孢子萌发的速率、高的产孢率、胞外淀粉酶的失活、高的几丁质酶活 性【7 1 。孢子的大小与致病力没有太大关系，致病力是这些影响因素共同作用的结果， 单一因素并不能决定致病力的强弱【l0 1 。 ： 虫生真菌致病力受温度和湿度影响，且湿度的影响作用更大。d r u m m o n d 等把 菌液( 1 0 6 孢子m 1 ) 9 1 ：理的温室粉虱先置于高湿度( 9 5 r h ) 下1 6 h ，再转到低湿度 ( 7 0 r h ) 下0 一- - 2 0 h ，然后又恢复高湿条件，发现在常温和7 0 的湿度下保持4 h 就能 显著降低蜡蚧轮枝菌的毒力【1 6 】。 昆虫发育阶段的不同也影响致病力，例如蜡蚧轮技菌对银叶粉虱 ( b e m i s i a a r g e n r i f o l h 烟粉虱b 型) 的卵不敏感，对若虫、蛹、成虫敏感，在相同条 件下，若虫死亡率为9 5 , - - 9 8 ，蛹死亡率为5 9 , - - - 7 2 5 ，成虫死亡率为3 4 1 - - 5 2 6 t 17 1 。 在印度，室内测定一株从金合欢黄卷蛾( a r c h i p s p o m i v o r a ) 上分离的蜡蚧轮枝菌的 5 浙江理工人学硕上学位论文 致病力时发现：悬液浓度2 8 x 1 0 9 孢子m l 时，对小菜蛾低龄幼虫的毒力达1 0 0 ，但 对老熟幼虫的毒力却较差【1 8 】。 由于分生孢子萌发速率及芽管长度与分生孢子的形成时间长短有关，因此分生 孢子的形成时间对致病力同样有影响。经过2 - - - 3 d 培养获得的分生孢子l 9 4 d 以上培养 获得的分生孢子能更快地萌发，且萌发时芽管的长度要长，即较早收获的分生孢子 的致病力强，孢子萌发率对致病力基本没有影响或影响很小【1 9 j 。c h a n d l e r 等对3 株具 有不同致病力的虫生蜡蚧轮枝菌在完全培养基和温室白粉虱( t r i c l e a r o d e s v a p o r a v i o r u m ) 虫体上孢子萌发率的比较发现，在完全培养基上，3 个菌株的孢子萌 发率不同，而在虫体上却相同，这表明在实验室生测中，3 个菌株对白粉虱的致病力 与在虫体上的萌发率没有相关性。在生物防治的应用中，可利用这个原理，尽量控 制影响致病力的因素，提高防治效果【2 0 1 。 1 3 5 蜡蚧轮枝菌的侵染过程和致病机理 蜡蚧轮枝菌的一些菌株具有寄主专一性，其寄主可分为昆虫和植物病原菌，所 以对于其侵染过程和致病机理从寄主的类别加以讨论。虫生蜡蚧轮枝菌的寄主范围 广，不但能寄主粉虱蚜虫等同翅目昆虫，对鳞翅目的害虫也有防治效果。当分生孢 子或菌丝落于虫体表面时，在合适的温度和8 5 1 0 0 相对湿度的条件下，孢子很容 易萌发，并穿透表皮，整个过程约4 h i l l 可完成。超微结构和显微生化特征表明旷 l e c a n i i 感染蚜虫( m a c r o s i p h r o me a p h o r i b i a e ) 需要经过如下过程：分生孢子黏附到 寄主表皮；孢子萌发及分枝菌丝芽管产生；产生的酶穿透昆虫体壁，芽管入侵皮下 并定植在前表皮；侵入昆虫体腔，芽孢子生长同时进入血淋巴中；掠夺虫体的营养 和水分，并迫使虫体循环障碍，组织细胞受到机械破坏，产生代谢产物如毒素、酶； 昆虫致死，分生孢子释放【2 1 盈】。蜡蚧轮枝菌对昆虫的致病机理主要有以下两个方面。 ( 1 ) 菌丝生长对昆虫的破坏作用：在温度和湿度适合的条件下，虫体表面的分 生孢子萌发，并分泌降解昆虫表皮的几丁质酶、蛋白酶等促进菌丝和芽管穿透表皮， 在体腔内菌丝对组织没有选择性，向前向前足、口腔等开口部位生长，向后沿体壁 内侧向肛门处生长，逐渐充满整个体腔，吸取虫体的营养和水分等，使虫体的营养 耗尽、体循环发生障碍及组织细胞受到机械破坏，从而导致昆虫死亡【2 3 1 。徐均焕等 6 浙江理t 大学硕十学位论文 将胞外蛋白酶降解昆虫表皮的过程分为三个阶段：酶分泌后被吸附到表皮上，该吸 附过程多半是由于表皮中羧基的作用；蛋白酶的作用点与表皮蛋白酶的专性肽链序 列对接；表皮肽片断被降解成氨基酸，从而为真菌的生长提供营养【2 4 1 。 ( 2 ) 菌体产生代谢毒素，对昆虫产生致病作用：蜡蚧轮枝菌产生毒素如吡啶2 ， 6 一二羧酸、c 2 5 的强毒性成分及白僵菌交酯，对昆虫有较高的毒杀作用，可以在较 短的时间内诱导滞缓效应，引起麻痹，导致死亡【2 5 2 6 1 。蜡蚧轮枝菌对寄主昆虫的侵 染致病作用，主要是通过以上二种机理的联合作用而实现的，二种机理的共同作用 促使了寄主由发病至最终死亡过程的发生。 蜡蚧轮枝菌能防治锈病、白粉病、灰霉病以及线虫等植物病害，已报导的蜡蚧 轮枝菌所寄生的植物病原菌涉及8 个属2 0 余种【2 1 1 。 蜡蚧轮枝菌寄生植物病原菌后，两者之间存在一些微妙的生理生态的变化。如 当寄生锈菌后，能产生溶解锈菌孢子和芽管的物质，而且蜡蚧轮枝菌的孢子梗时常 通过产生具有无定型粘液的假根状结构附着于锈菌的表面【2 7 1 。a s k a r y 等对蜡蚧轮枝 菌与黄瓜白粉病菌细胞间的相互作用的研究发现，感染了蜡蚧轮枝菌的病原菌产生 了一系列的生理反应：细胞质的生理失调并出现空胞；原生质膜收缩；局部细胞质 凝缩；细胞壁发生扭曲并被破坏；病原菌细胞死亡【2 8 】。a s k a r y 等认为这些变化是由 于蜡蚧轮枝菌对病原菌的机械压力与酶解作用，并认为作用过程分为：菌丝或者孢 子吸附到病原菌上；机械压力与产生的细胞壁降解酶作用使蜡蚧轮枝菌进入病原菌 体内并迅速生长；降解细胞致使病原菌细胞死亡，并不断向其它细胞扩散。但是对 不同种的植物病原菌的致病机理并不是完全相同，因此，对植物病原菌的侵染机理 需要进一步研究【2 8 刎。 1 3 6 蜡蚧轮枝菌的发酵培养与生产 各种昆虫病原菌均可在表面培养基上生长。蜡蚧轮枝菌已经成功在查氏培养基 ( c z a p e k d o x ) 、麦芽糖琼脂培养基( m a l t a g a r ) 、沙堡氏培养基( s a b o u r a u d ) 、马铃薯 葡萄糖琼脂培养基( p o t a t o d e x t r o s ea g a r ) 等表面培养基大批量生产，徐力文报道了一 株蜡蚧轮枝菌表面培养生产技术，获得了较高的产孢量1 0 9 孢子儋培养基【3 0 l 。 7 浙江理t 大学硕一l ：学位论文 在深层液体培养中，蜡蚧轮枝菌通常产生酵母样的芽生孢子，芽生孢子在生产 后不容易保存，而且芽生孢子的侵染和致病力不及分生孢子1 3 1 】。殷华等采用恒温摇 床振荡培养的方法对蜡蚧轮枝菌的液体培养条件进行了研究，结果表明，最适产孢 培养温度为2 5 ，产孢量和菌丝量受培养基的影响较大，受三角瓶中装液量影响大 小随培养液成分不同而不同【3 2 】。f e n g 等研究了初始p h 值、接种浓度以及培养液体积 对蜡蚧轮枝菌的影响，单因素对孢子产量影响显著，而且其影响作用随菌株和发酵 方法不同而有变化，有些情况下单因素影响不显著，而交互作用影响变得显著1 3 3 1 。 半固体发酵( 深层发酵用于菌丝生长，接着用浅盘培养生产芽生孢子和分生孢 子) 是最常用的大规模生产病原真菌的方法。英国的t a r e 和l y l e 公司已经将这种生 产技术标准化，最优化适合于生产发酵的培养基也已确定，由这种技术可以持续生 产1 0 5 - 一1 0 6 分生孢子克【3 4 1 。张仙红等也用液固双相发酵的方法生产孢子粉，具体方 法为：菌种接种到液体培养中( 成分为：淀粉2 5 、葡萄糖2 5 、谷粒浸液2 5 、 n a c lo 5 、c a c 0 30 2 、p h = 5 o ) ，在2 0 的温度度下，摇床培养4 一- 5 d ，可得1 0 7 芽孢子；将芽孢子接到事先做好的小米培养基上( 开水泡小米至体积膨胀两倍，清 水去除多余淀粉，室温干燥，5 0 0 m l 的三角瓶内装约1 c m 厚的小米，灭菌，摇松即可) ， 在相对湿度9 0 、2 5 下培养7 d ，长出大量菌丝；把相对湿度降到5 0 ，在2 8 3 0 下慢慢干燥2 , - 一3 周，长出大量孢子；打开瓶塞，经过5 d 充分干燥，即可获得含有 大量分生孢子的固体小颗粒粉术。以此种方法培养蜡蚧轮枝菌，小米培养基的内部 也充满了菌丝，弥补了单重固体发酵产孢子数量少、液体孢子寿命短及侵染力差的 缺点【3 5 1 。液固双相发酵工艺发展较快，采用此生产工艺生产防治湿地松粉蚧的蜡蚧 轮枝菌，产孢量可达5 5 x 1 0 9 克，而且成本大为降低，具体的生产工艺流程为：一级 斜面菌种在2 2 培养2 4 0 h ；二级三角瓶摇床液体种子2 2 条件下培养7 2 d , 时；三级 大罐通气培养扩大液体在2 2 。c 培养7 2 h ；四级固体开放培养在2 2 。c 条件下培养3 6 0 h ， 然后干燥，含水率3 0 以下再自然晾干；包装贮藏。可以直接将晾干的固体基质在 田问施用，也可以用水将孢子洗脱下来，制备成孢子悬浮液，喷洒在植物叶面上， 可以有效防治病虫害1 3 6 】。 蜡蚧轮枝菌的生产方法主要是用固体培养来大量生产，如用灭菌的高梁属的谷 粒装进塑料袋，用蜡蚧轮枝菌接种后，密封袋口，放在室温下培养三周即可转运到 8 浙江理t 大学硕上学位论文 田地施用【l 引。李锋等研究了