（分析化学专业论文）小白菜对镉和汞的吸收、迁移和分布机制初探.pdf

摘要 摘要 重金属污染的来源、迁移转化和归宿及其污染的控制和治理一直是近年来人 们关注的热点问题之一。与传统重金属污染土壤的化学和物理修复技术相比，植 物修复不仅成本低而且不会对环境造成连带的二次破坏。但是，目前所发现的重 金属超富集植物大都有生物量小、生长速度慢等缺点而导致修复效率低。通过常 规杂交或转基因技术把现有超富集植物的功能基因片断转移到生物量大、生长速 度快的普通植物体中使之具有超富集能力是一条可行的途径。因此认识重金属超 富集植物的超富集生物学机制是当前研究的首要任务。 我们选择芸苔属( b r a s s i e a c e a e ) 的小白菜( b r a s s i c ac h i n e n s i sl ) 作为研究 对象，研究其对镉和汞的富集超富集特性，以期在分子水平上获得其富集超富 集的生物化学机制及解毒机制，为实现重金属污染土壤的植物修复提供理论依 据。全文包含以下几个部分： 第一章主要对植物修复技术及超富集重金属植物的生物化学机制研究进行 综述，阐述元素形态分析的重要性，对重金属形态分析技术进行详细的介绍，并 提出对小白菜富集及耐受镉和汞的机制以及存在形态进行研究。 第二章以小白菜作为超富集镉( c d ) 的研究材料，通过不同浓度的c d 胁迫 研究小白菜富集c d 的能力以及可能的细胞抵御机制。在2 0 0 岬o ll - 1c d 胁迫下， 小白菜地上部分及根部c d 含量分别为1 3 4 8 3 和3 7 6 1 0m gk g 。( 干重) 。小白菜 体内c d 含量与植物络合素( p h y t o c h e l a t i n s ，p c s ) 含量成正相关，c d 浓度越高 p c s 的含量也越高，这个研究结果表明p c s 络合c d 在小白菜体内c d 的解毒及 耐受机制中起最主要的作用。另外，在研究c d 胁迫下小白菜地上部分丙二醛 ( m d a ) 的产生、h 2 0 2 的含量及抗氧化酶如超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化 氢酶( c a = i ) 、愈创木酚过氧化酶( p o d ) 及抗坏血酸过氧化酶( a p x ) 的活性 变化的过程中发现，在5 5 0p a n o ll - 1c d 胁迫下，酶的活性成上升趋势，有效地 抵御氧化胁迫，说明抗氧化系统在小白菜c d 解毒中起第二抵御作用。这些抵御 机制降低了游离c d 的破坏作用，提高了对c d 的富集和耐受能力；然而，在更 高浓度c d 的作用下，小白菜的谷胱甘肽含量下降，p c s 合成缓慢，而且抗氧化 摘要 酶的活性受到抑制，尤其是a p x ，h 2 0 2 大量富集，远远超过小白菜对c d 解毒 能力从而导致细胞的死亡。总的说来，这些实验结果都说明了p c s 及抗氧化系 统协同抵御c d 诱导的氧化胁迫，并在小白菜自身富集抵御c d 的过程中起着重 要作用。 第三章主要是应用尺寸排阻色谱与电感耦合等离子体质谱( s e c i c p m s ) 联用技术和电喷雾二级质谱( e s i m s m s ) 研究体外合成的c d - p c 络合物及小 白菜体内合成的c d - p c 络合物的组成。将c d 胁迫的小白菜体内分离出来的p c s 单体和c d c l 2 混合，通过e s i m s 及e s i m s m s 直接进样研究发现有c d g s l 2 、 ( c d g s ) 2 、c d l 2 p c 2 、c d l - 3 p c 3 、c d l 一3 p c 4 和c d t 3 p c 5 形成。通过s e c i c p m s 及 e s i m s m s 研究经c d 胁迫的小白菜n h 4 h c 0 3 提取液，发现小白菜体内不仅存 在游离态的p c 2 5 和d c s g l u p c 3 而且也存在c d p c 3 和c d p g 络合物。这两个络 合物的存在得到了它们相应的同位素分布及m s m s 质谱的确认，这是小白菜体 内合成c d p c 3 和c d p g 的首次发现。结果显示p c s 在植物抵抗c d 胁迫过程中 起着重要作用；另一方面，s e c i c p m s 及e s i m s m s 也展示其在金属毒性研 究中将发挥重要作用。 第四章研究了在h g c l 2 胁迫下，小白菜富集h g 的行为；研究了腐植酸( h a ) 和半胱氨酸( c y s ) 的存在对小白菜在h g c l 2 胁迫下体内富集h g 和对其体内合 成p c s 和h g p c 络合物的影响。h a 及c y s 处理的小白菜根部h g 含量下降但生 物量增加而且也诱导了根部p c s 的产生。以反相液相色谱( r p l c ) 与 i c p - m s e s i m s m s 联用技术，研究体外化学合成的h g p c 络合物主要有 h g g s 2 、h g p c 2 、h g p c 3 、h g p c 4 和h 9 2 p c 4 等形式；而经h a 或c y s 处理的小白 菜根部除发现了氧化的p c 2 - 4 以外，还首次发现了h g f c 2 - 4 和h 9 2 p c 4 络合物，它 们的存在得到了h g 同位素分布及m s m s 质谱验证。这些研究结果不仅说明小 白菜对h g 具有一定的富集和耐受能力，而且表明h a 和c y s 在对h g 的吸收和 h g 诱导小白菜合成p c s 的过程中发挥了作用。深入的研究有待开展。 第五章总结了本硕士论文的研究工作，对其不足进行了检讨，并对将来进一 步研究工作进行了展望。 关键词：小白菜抗氧化酶植物络合素( p h y t o c h e l a t i n ) c d - p h y t o c h e l a t i n 络合 摘要 物h g - p h y t o c h e l a t i n 络合物 a b s t r a c t a b s t r a c t e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o no fh e a v ym e t a l s ，s u c ha sc a d m i u m ( c d ) a n dm e r c u r y ( r i 曲， f r o ma n t h r o p o g e n i ca c t i v i t i e sa r et h r e a t e n i n ge n v i r o n m e n t a la n dh u m a nh e a l t hw i t h t h e i ru n w a n t e dp r o p e r t i e s t h u st h e r ei sa l lu r g e n tn e e dt od e v e l o pl o w - c o s t ，e f f e c t i v e ， a n ds u s t a i n a b l em e t h o d sf o rt h e i rr e m o v a la n dd e t o x i f i c a t i o n p l a n t - b a s e da p p r o a c h e s ， s u c ha sp h y t o r e m e d i a t i o n , a r er e l a t i v e l yi n e x p e n s i v ea n de c o l o g i c a l l yr e s p o n s i b l e s i n c et h e ya r ep e r f o r m e di ns i t ua n da r es o l a r - d r i v e n ，w h i l et h ec l e a n - u pm e t h o d ss u c h a ss o i lw a s h i n ga n de l e c t r o k i n e t i cr e m e d i a t i o nr e m o v i n gc o n t a m i n a t e ds o i lf r o mas i t e a r eg e n e r a l l yt o oc o s t l ya n de n v i r o n m e n t a l l yd e s t r u c t i v et ob ea p p l i e do nt h ei m p o s i n g s c a l et h a ti sn o wr e q u k e d a sm e t a l - h y p e r a c c u m u l a t i n gp l a n t sw ek n o wm o s t l yh a v e l o wb i o m a s sa n d p o o rg r o w t h ，i t i s h a r dt ou s ei n p h y t o r e m e d i a t i o n m e t a l - h y p e r a c e u m u l a t i n gp l a n t sw i t hu n i q u e a b i l i t i e st ot o l e r a t e ，a c c u m u l a t e ，a n d d e t o x i f ym e t a l sr e p r e s e n ta ni m p o r t a n tr e s e r v o i ro fu n i q u eg e n e st h a tc o u l db e t r a n s f e r r e dt of a s t g r o w i n gp l a n ts p e c i e sf o re n h a n c e dp h y t o r e m e d i a t i o n t h e r e f o r e ，i t i sp r i m a r yt oe l u c i d a t et h em e c h a n i s m sb yw h i c hp l a n t sa c c u m u l a t ea n dd e t o x i f y h e a v ym e t a l i nt h i st h e s i s ，b r a s s i c ac h i n e n s i sl ，w h i c hi so n eo ft h es t a p l ea n dm o s tp o p u l a r v e g e t a b l e si nc h i n a , w a sc h o s e na sam o d e lt oi n v e s t i g a t et h eb i o c h e m i c a lr e s p o n s e s o fp l a n t su n d e rc da n dh gs t r e s s i tc o n s i s t so f5c h a p t e r sa sb e l o w ： i nc h a p t e ro n e ，t h ed e v e l o p m e n to fp h y t o r e m e d i a t i o na n dc e l l u l a rm e c h a n i s m sf o r h e a v ym e t a ld e t o x i f i c a t i o na n dt o l e r a n c ew e r ei n t r o d u c e d ；t h ea n a l y t i c a lt e c h n i q u e so f e l e m e n t a ls p e c i a t i o nh a v ea l s ob e e nr e v i e w e d r e s e a r c hp r o p o s a lw a st h u sm a d ef o r t h i st h e s i s ，a i m i n gt os t u d yc da n dh ga c c u m u l a t i o n ，s p e c i a t i o na n dd e t o x i f i c a t i o ni n b c h n e n s s i nc h a p t e rt w o 。b c h i n e n s i sw a se x p o s e dt od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc dt o e v a l u a t ei t sc d - a c c u m u l a t i n gc a p a c i t ya n di t sp o t e n t i a lc e l l u l a rd e f e n s i v em e c h a n i s m s c da c c u m u l a t i o ni nt h es h o o t sa n dr o o t s ，r e s p e c t i v e l y , o fb c h i n e n s i sw a su pt o i v a b s t r a c t 1 3 4 8 3a n d3 7 6 1 0m gk g - ld r yw e i g h tu n d e rc de x p o s u r eo f2 0 0p m o ll 一 i n c r e a s i n gc da c c u m u l a t i o ni nt h ep l a n tw a sa c c o m p a n i e db yr a p i da c c u m u l a t i o no f p h y t o c h e l a t i n s ( p c s ) ，a n dt h es e q u e s t r a t i o no f c db yp c ss e e m e dt op r o v i d ea p r i m a r y c e l l u l a rm e c h a n i s mf o rc dd e t o x i f i c a t i o na n dt o l e r a n c ei nb c h i n e n s i s f u r t h e r m o r e 。 m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) f o r m a t i o n ，h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) c o n t e n ta n d a n t i o x i d a t i v ee n z y m ea c t i v i t i e ss u c ha ss u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，c a t a l a s e ，g u a i a c o l p e r o x i d a s e a n da s c o r b a t e p e r o x i d a s e ( a p x ) w e r eo b s e r v e d i nt h es h o o t s o f c d s t r e s s e db c h i n e n s i s i n c r e a s i n ge n z y m ea c t i v i t i e si nr e s p o n s et oc o n c e n t r a t i o n s f r o m5t o5 0p m o ll c ds h o w e da ne f f i c i e n td e f e n s ea g a i n s to x i d a t i v es t r e s s ， s u g g e s t i n gt h a tt h ea n t i o x i d a t i v es y s t e mw a sas e c o n d a r yd e f e n s i v em e c h a n i s m t h e s e r e s u l t e di nr e d u c e df r e ec dd a m a g ea n de n h a n c e dc da c c u m u l a t i o na n dt o l e r a n c e h o w e v e r , a th i g h e rc o n c e n t r a t i o n so fc d ，t h ed e p l e t i o no fg h t a t h i o n e ，t h es u b d u e d p r o d u c t i o no fp c sa n dt h ei n h i b i t i o no fp r o t e c t i v ee n z y m ea c t i v i t i e s ，e s p e c i a l l ya p x a c t i v i t y , p r o m o t e dh 2 0 2a c e u r n u l a t i o n a n de x c e e d e dt h ed e t o x i f i c a t i o nc a p a c i t y , l e a d i n gt oc e l ld e a t h i ng e n e r a l ，t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tp c sa n dt h ea n t i o x i d a t i v e s y s t e ma r es y n e r g i s t i ci nc o m b a t t i n gc d - i n d u c e do x i d a t i v es t r e s sa n dt h a tt h e yp l a y i m p o r t a n tr o l e si nc dd e t o x i f i c a t i o n i n c h a p t e rt h r e e ，i n - v i t r os y n t h e s i z e dc d p h y t o c h e l a t i n ( p c ) c o m p l e x e s a n d i n v i v oc d - p cc o m p l e x e si nc d - s t r e s s e db c h i n e n s i s ，w h i c hh a sb e e ni d e n t i f i e da sa c dh y p e r a c c u m u l a t o r , w e r ec h a r a c t e r i z e du s i n gs e c i c p m sa n de s i - m s m s t h e p c s ( n = l 5 ) o b t a i n e df r o mc d - s t r e s s e db c h i n e n s i st o g e t h e r 诵t l lc d c l 2w e r eu s e d t os y n t h e s i z et h ei n v i t r oc d - p cc o m p l e x e s ，a n dt h ef o r m a t i o no fc d g s i - 2 ，( c d g s ) 2 ， c d l - 2 p c 2 ，c d l 3 p c 3 ，c d i _ 3 p c 4a n dc d l 3 p c 5w a so b s e r v e d i na d d i t i o n ，f o rt h ef n s t t i m e ，i n v i v oc d p c 3a n dc d p c 4c o m p l e x e s ，a sw e l la sc d - f r e ep c s ( n = 2 5 ) a n d d e s g l u p c 3w e r ed e t e c t e di nt h ee x t r a c t so fc d - s t r e s s e db c h i n e n s i sa n dc o n f i r m e d b ym e a n so ft h e i rc o r r e s p o n d i n gi s o t o p i cp e a kd i s t r i b u t i o na n dm s m ss p e c t r a n i 仃o g e ns a t u r a t e da m m o n i u mb i c a r b o n a t eb u f f e r0 h = 7 8 ) ，i n s t e a do ft r i s h c i a n dp h o s p h a t eb u f f e r , w a su s e da sas u i t a b l em o b i l ep h a s ei no r d e rt os t a b i l i z et h e c d - p cc o m p l e x e sa n de f f e c t i v e l ya v o i dp o s s i b l eo x i d a t i o no fp ca n a l o g u e sd u r i n g s e cf r a c t i o n a t i o n r e s u l mo b t a i n e di nt h i ss t u d yg i v ed e f i n i t ee v i d e n c ee l u c i d a t i n g a b s t r a c t t h ei m p o r t a n tr o l e sw h i c hp c sp l a yi np l a n td e f e n s i v em e c h a n i s m st oc ds t r e s s s e c j c p m sa n de s i m s m sw e r ed e m o n s t r a t e da s p o w e r f u la n dp r o m i s i n g t e c h n i q u e sf o rs c r e e n i n ga n di d e n t i f y i n gt h ei n v i v om e t a l l o p e p t i d e s ，w i t ha c c u r a t e i s o t o p i cd i s t r i b u t i o na s s i g n m e n t ，i nm e t a lt o x i c o l o g ys t u d i e s i nc h a p t e rf o u r , t h ea c c u m u l a t i o no fh ga n dt h ef o r m a t i o no fp c sa n dh g - p c c o m p l e x e si nb c h i n e n s i sp l a n t su n d e rh g c h ，( h g c l 2 + h u m i ca c i d s ) a n dh g c y s 2 e x p o s u r ea l es t u d i e d t r e a t m e n tw i t hh u m i ea c i d sa n dc y sh a sd e c r e a s e dt h eh g a c c u m u l a t i o ni nb c h i n e n s i sr o o t sb u ti n c r e a s e ds e e d l i n gg r o w t ha n di n d u c e dp c s s y n t h e s i si nt h er o o t s s p e c i a t i o ns t u d i e so n n v i t r oc o n s t i t u t e da n di n - v i v oh g p c c o m p l e x e sa n dp c sw e r ec o n d u c t e du s i n gr p l cc o u p l e do n l i n ew i t hi c p - m sa n d e s i - m s m s t h ef o r m a t i o no fh g g s 2 ，h g v c 2 ，h g p c 3 ，h g p c 4a n d h 9 2 p c 4 伽v i t r o h a sb e e no b s e r v e da n dc h a r a c t e r i z e db ye s i m s m s b e s i d e so x i d i z e dp c 2 - 4 , n v i v o h g p c 2 - 4a n dh g a p c 4c o m p l e x e sh a v ea l s ob e e nd e t e c t e di nt h er o o t so fh u m i ca c i d s a n dc y st r e a t e db c h i n e n s i su n d e rh gs t r e s sa n dc o n f i r m e db yt h e i rc o r r e s p o n d i n g a c c u r a t e i s o t o p i cp e a kd i s t r i b u t i o na n dm s m ss p e c t r af o rt h e f i r s tt i m e t h e p r e l i m i n a r yr e s u l t ss u g g e s tt h a th u m i ea c i da n dc y sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nh g d e t o x i f i c a t i o na n dt o l e r a n c ei n 及c h i n e n s i sf o rn o to n l yp c ss y n t h e s i sb u ta l s o c o n s e q u e n ts e q u e s t r a t i o no fh 9 2 + b yf o r m i n gh g t h i o l a t e i n t e n s i v es t u d i e so ft h e b i o l o g i c a lm e c h a n i s m sb e h i n dt h e s ep h e n o m e n as h o u l db ec a r r i e do u ti nt h ef u t u r e i nc h a p t e rf i v e ，as u m m a r yo ft h i st h e s i sw a sc o n c l u d e da n dt h ed e v e l o p i n gt r e n d w a sa l s od i s c u s s e d k e y w o r d s ：b r a s s i c a c h i n e n s i s l ；a n t i o x i d a t i v ee n z y m e s ；p h y t o c h e l a t i n ； c d - p h y t o c h e l a t i nc o m p l e x e s ；h g p h y t o c h e l a t i nc o m p l e x e s 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ： 年月日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 日期：年月 日 日期：年月日 第一章前言 第一章前言 1 1 重金属污染土壤的植物修复技术 随着工农业的迅猛发展和人类活动范围的迅速延伸，重金属污染土壤已经成 为一个全球性普遍关注的环境问题。土壤中的重金属主要来源于采矿、冶炼、化 工、废电池处理、电子、制革和染料等工业排放废弃物及汽车尾气排放、农药和 化肥的施用等【1 1 。它们不仅可以通过径流和淋洗作用污染地表水和地下水，恶化 水环境，而且可以释放到大气中与大气颗粒物结合进行长距离传输。人类健康通 过饮用水和呼吸直接受到重金属污染的威胁；另外，人类作为生物链的顶端生物 又受到重金属污染的植物和动物的危害【2 1 。因此，重金属污染的来源、迁移转化 和归宿以及其污染的控制和治理一直是近年来人们关注的热点问题之一。 传统治理土壤重金属污染主要采用物理和化学技术，如化学固定 ( i m m o b i l i z a t i o n ) 【3 】，土壤淋洗( s o i lw a s h i n g f l u s h i n g e x t r a c t i o n ) 【4 】，动电修复 ( e l e c t r o k i n e t i cr e m e d i a t i o n ) i s 等。然而这些方法不仅费用昂贵，对大面积的污 染效果差，而且只能暂时减轻土壤重金属污染。与传统的措施相比，植物修复技 术( p h y t o r e m e d i a t i o n ) 是目前较为合适的重金属污染土壤的修复技术。它不仅 成本低且不会对环境造成连带的二次污染破坏。广义上的植物修复是指利用植物 去除土壤、水体或空气中重金属、有机污染物等污染物的技术 o q ，包括植物萃取 ( p h y t o e x t r a c t i o n ) 、根际过滤( r h i z o f i l t r a t i o n ) 、植物挥发( p h y t o v o l a t i l i z a t i o n ) 、 植物固定( p h y t o s t a b i l i z a t i o n ) 等技术，现在通常提到的植物修复主要是指植物 萃取。 利用植物进行污染环境的治理不是一个新的想法。大约在3 0 0 年前，植物就 已经用来污水处理。1 8 8 5 年，b a u m a n n 第一次发现t h l a s p ic a e r u l e s c e n s 和v i o l a c a l a m i n a r i a 植物叶子里金属含量很高 r l 。之后，人们又发现硒镍镉铜锌等重金属 及类金属超富集植物。1 9 8 3 年c h a n e y 再次提出用重金属超富集植物萃取污染土 壤中重金属的方法i s 】。1 9 9 1 年，b a k e r 等首次利用重金属超富集植物z c a e r u l e s c e n s 对实验田中的锌和镉进行萃取【9 】。 第一章前言 作为重金属污染土壤植物修复技术的基础一重金属超富集植物，是一类对金 属元素的积累量超过一般植物1 0 0 倍以上的植物，这是b r o o k s 等在1 9 7 7 年首次 提出的概念 1 0 , l q 。因此，一种超富集植物必须积累超过：1 0p p mh g ；1 0 0p p mc d ； 1 , o o op p mc u 、c r 、c o 和p b ；1 0 ，0 0 0p p m n i 和z n 。目前，国际上已经发现超富 集植物约为4 0 0 种，广泛分布于植物界的4 5 个科，但大多数属于十字花科植物， 以超富集n i 的植物最多【1 2 1 。表1 1 列举了一些重金属超富集植物及它们的富集 能力。 表1 - 1 一些重金属超富集植物及它们的富集能力 t a b l e1 - 1s e v e r a lh e a v ym e t a lh y p e r a c c u m u l a t o rs p e c i e sa n dt h e i r b i o a c c u m u l a t i o np o t e n t i a l 在过去二十年里，植物修复技术取得不少进步，但是由于目前发现的重金属 超富集植物大都有生物量小、生长速度慢等缺点而导致修复效率低。通过常规杂 交或转基因技术把现有超富集植物的功能基因片断转移到生物量大、生长速度快 的普通植物体中使之具有超富集能力是一条可行的途径。因此，认识重金属超富 集植物的超富集生物化学机制是当前研究的首要任务。 1 2 重金属离子吸收和转移机制 与普通的植物相比，重金属离子进入超富集植物体内同样经过吸收转运、 富集转化矿化等生理生化过程，而且许多重金属离子进入植物体内的离子通道 与必需营养元素相同，这就决定了超富集植物必然具有独特的生理代谢过程保证 自身正常生长。金属离子由于自身所带的电荷决定了它们不可能自由跨越亲脂性 第一章前言 的细胞膜，所以离子从外界环境转移到细胞内部一定要通过具有转运功能的膜蛋 白，即转运蛋白，即跨膜转运蛋白是金属离子进入植物体内的关键介质。研究镉 如何被吸收进入植物细胞已有l o 多年了。很早之前人们就知道当镉过量时，必需 阳离子如z n z + 和c a 2 + 可以与c d 2 + 竞争进入植物体而减小镉的毒性【1 7 1 。因此，在2 0 世纪9 0 年代中期人们就开始研究植物吸收f e 2 + 、z n 2 + 等其它必需阳离子的体系， 并开始怀疑这些转运蛋白是否对c d 2 + 的吸收起作用【1 8 , 1 9 。可以确定的是c d 2 + 不是 必需金属离子，所以它不可能有自己特有的吸收机制。相反，c d 2 + 和其它必需金 属离子可以通过原有吸收阳离子的途径进入植物细胞。这可以以小麦蛋白l c t i 为证，至少它在融合酵母中表达说明了这个问题【2 0 1 。l c t l 参与c a 2 + 流入，并通 过辅助c d 2 + 的流入补偿了酵母细胞镉敏感的缺点。然而这个基因没有在拟南芥 ( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 中发现。将拟南芥的i r t l 在融合酵母表达发现也可以促 进z n 2 + 、m n 2 + 、c 0 2 + 和c d 2 + 的吸收。当拟南芥的i r t i 蛋白缺少稳定蛋白的f e 时， i r t l 在拟南芥体内过量表达促进了根部对z n 2 + 和cd ：2 + 的吸收【2 1 1 。这些实验都河接 地证明了i r t l 确实对镉吸收进入根部细胞起作用。 对于超富集植物而言，z n 的吸收过程研究相对较清楚。通过与酵母突变株 进行功能互补实验，l a s s a t 等瞄】在具有富z n 能力的zc a e r u l e s c e n 中克隆到 z n t l l ，z n t l l 编码z n 2 + 转运蛋白，属z i p 基因家族，缺z n 或z l l 供应充足条件下 均可以在根系和叶片中高量表达，表明其可能是组成型表达。对于不具有富- z n 能力的za l v e v l s e 而言，z n t l l 主要在缺z n 件下表达，供z n 时，表达明显受到 抑制。这种表达方式的不同很可能是造成菥莫属( t h l a s p i ) 植物富乙能力差异 的主要原因之一。a s s u n c a o 等【2 3 】的研究结果也表明z n 转运蛋白基因在z c a e r u l e s c e n 体内的表达量远高于za f v e l s e 。从l a s s a t 等【2 刁和a s s u n c a o 等1 2 3 1 的实验结果可以发现根系z n 转运蛋白基因的表达量与菥莫属植物富集z n 的能 力成正相关，初步验证了吸收过程是超富集植物富集重金属离子的首个限速步骤 的假设，而且这些基因在z n 从土壤吸收到植物体内起着直接作用。但目前还不 能肯定转运蛋白是否在超富集植物吸收其他重金属方面起到决定性作用。 1 3 木质部运输 木质部存在大量的有机酸和氨基酸，它们能够与金属离子结合，这种复合物 第一章前言 是重金属离子在木质部运输的主要形式。重金属由根系进入木质部至少需要3 个 过程：进入根细胞，由根细胞运输到中柱，装载到木质部。在内皮层由于凯氏带 的存在，使得共质体运输在重金属进入木质部的过程中起到主导作用。在共质体 运输中起关键作用的是膜转运蛋白，然而直到现在还没有在木质部中克隆到与重 金属离子运输相关的基因，这方面的研究，尤其是在研究超富集植物时应该引起 充分的重视。与普通植物相比，超富集植物能够高效、迅速地把重金属离子由根 系运输到地上部，而通过凯氏带是重金属离子进入木质部主要屏障之一，探明此 过程，将有利于提高植物修复的效率。 1 4 植物对重金属的解毒机制 植物对重金属的解毒机制复杂多样，包括：( 1 ) 细胞壁钝化，( 2 ) 跨膜运 输减少，( 3 ) 主动排外，( 4 ) 区域化分布，( 5 ) 螯合作用，( 6 ) 合成逆境蛋 白，( 7 ) 产生乙烯。其中最主要、最普遍的机制是通过诱导金属配位体的合成， 形成金属配位体复合物，并在细胞壁的钝化与区域化作用【2 4 】。 1 4 1 细胞壁的钝化和区室化作用 植物细胞壁残基对阳离子有高亲和力，可以影响重金属离子向细胞内扩散速 率和金属离子的吸收，从而提高金属的耐受力。白玉草( s i l e n ev u l g a r i ss s p h u m i l i s ) 是一种金属耐受型植物，b 血g e z i l 等【2 5 】研究发现白玉草吸收的重金属大 量富集在细胞壁表皮与蛋白或者硅酸盐结合。p o u l t e r 等 2 6 3 研究a n t t h o x a n t h u m o d o r a t u m 悬浮细胞和原生质体固p b 能力时发现，p b 浓度对从耐p b 细胞克隆分离的 悬浮细胞无太大影响，但原生质体的死亡率却明显上升；相应地，从p b 敏感细胞 克隆分离的悬浮细胞和原生质体对p b 极其敏感，表明细胞壁枷o d o r a t u m 抗p b 胁迫中起到重要作用。需要明确的是，细胞壁对金属的固定作用不是一个普遍的 抗金属毒害的机制，例如抗z n 和z n 敏感型菜豆的细胞壁物质表现出相似的亲和 力，同时细胞壁有一定的金属容量，而超富集植物能够在地上部富集大量的重金 属离子，暗示细胞壁不可能在超富集植物中起到重要作用。将金属离子排除体外 或转移到液泡里面是两条减小有毒金属在细胞溶质中浓度的有效途径，因此可能 对重金属耐受起着重要的作用。最近的研究表明，区室化作用与超富集植物富集 第一章前言 重金属离子的能力密切相关。就菥莫属而言，具有富集能力的zg e o s i n g e n s e 液泡 中n i 的含量要比不具有富集能力的z 口n 坦圪，p 高l 倍【2 7 】；f r e y 等【2 叼也证实z n 在z c a e r u l e s c e n s 中主要分布于表皮细胞液泡中。但区室化作用是否是超富集植物富 集重金属离子的一个普遍机理还需对新发现的超富集植物进一步研究才能确定。 1 4 2 植物络合素( p c s ) 植物络合素( p h y t o c h e l a t i n s ，p c s ) 溉删是植物体内一类重要的非蛋白质形 态的富含半胱氨酸能够结合金属离子的寡肽，被称成是第三类金属硫蛋白 ( m e t a l l i t h i o n e i n s ，m t s ) ，参与体内重金属的解毒过程。它首先是在酵母 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) 中被发现，最初被称为c a d ) ，s t i n s 【3 l 】，后来在单子 叶植物、双子叶植物、裸子植物、藻类3 2 1 以及多种真菌【3 3 朗、海洋硅藻3 5 1 ，还 有线虫【蚓等生物体中均发现了p c s 。p c s 3 7 】在结构上类似于常见的谷胱甘肽 ( g l u t a t h i o n e 丫- g l u c y s - g l y ，简写为g s h ) ，其一般通式为“一g l u c y s ) n g l y ( n = 2 1 1 ) 。此外，在一些物种中也发现如( 7 - g l u - c y s ) n 、( r - o l u c y s ) n - 7 - g l u 、 ( 丫一g l u - c y s ) n p a l a 、( 丫g l u c y s ) n - g