（生物化学与分子生物学专业论文）新基因hs188881的生物学功能初筛.pdf

新基因h g 1 8 8 8 8 1 的生物学功能初筛 英文缩写 a m p k a n p l a g l l z 1 y n d l l i g f b p 4 3 a t b s a b 口 d a d m e m d m s o e b e d l a 心 i p t g k b k d l b n p 4 0 0 0 p a g e p b s 英文全称 a m p i c i l l l n k a n 锄v c i n 缩略语对照表 p l e i o m o 咄i ca d e n o m ag e r l e - 1 i k el z i n cf m g e rn r y n dd o m a i n c o m a i n i l l g1 1 i n 鲫l i n 1 i k e 伊o w t h 蠡犯t o r b i n d i n gp r o t e i n4 3 锄i n 0 1 ，2 ，4 埘a z o l e b o v ms e r u ma l b l 】r n i n b a p a i r d a l t o n d u l b e c c o sm o d i f i e de a 百em e d i u m d i m e 1 y ls l l l f o x i d e e t l l i d i u mb r o m j d e e n l y l e n e d j 删i i l et e t m c e t i ca c i d h o f s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y lt h i o p d - g a l a c t o s i c e 苷 k n o b a 辩 k i l o d a l t o n l u r i a b e r t a n i n o i d e n tp 4 0 o p t i c a id e n s 时 p o i y a c r y l 锄i d eg e ie i e c 仃i ) p h o 心s p h o s p h a c e - b 恤r e ds a l i n e 2 中文名称 氧苄西林 卡那霉素 多形性腺瘤样基因1 包含锌指和m y n d 结 构域的蛋白1 1 胰岛素样生长因子 结合蛋白4 氨基三唑 牛血清白蛋白 碱基对 道尔顿 达尔伯克( 氏) 基本培养基 二甲基亚矾 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 辣根过氧化物酶 异丙基p d 硫代半乳糖 千碱基( 对) 千道尔顿 l b 培养基 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 磷酸盐缓冲盐水 中国协和医科大学中国医学科学院硕士毕业论文 p c r p e g s d s 眦 t e t e 哐d t r i s x g a l p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c e m l 聚乙二醇 s o d i u md o d e c y ls u l f h c e 十二烷基硫酸钠 t r i s a c e t a t ee d t a 蛐r t r i s c le d l ab u l 强r n ，n ，n ，n 一t e t 阳m 出y l e m y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 h h y d r o x y i n e m y l a n l i n o m e m a n e 三羟甲基氨基甲烷 5 - b r o m o 4 c h l o m 3 i n d o l v l 5 溴- 4 一氯一3 吲哚一 b - d - g a l a c t o p y r 蜘o s i d e b - d - 半乳糖苷 新基因h s 1 8 8 8 8 l 的生物学功能初筛 摘要 在人类基因组计划完成后。面对众多的基因序列数据，如何对这些数据迅速进 行分析，揭示未知基因序列的功能，尤其是编码序列的功能，是后基因组时代面临 的重要课题。系统生物学的出现和反向生物学策略的运用为研究新基因的功能提供 了崭新的思路。本文对4 7 6 个功能不全的基因，采用生物信息学初选、酵母双杂交 筛选和免疫共沉淀验证的方式进行初步功能研究。 生物信息学的快速发展为快速初步分析基因的功能提供了可能，本文从国家人 类基因组北方研究中心功能基因组建立的全长基因t e a s y 载体亚克隆库的4 7 6 个 全长基因序列中选定了1 3 个基因，并将他们克隆到酵母表达载体，用酵母双杂交 技术进一步筛选。 本文采用的酵母双杂交系统库质粒基因是由5 0 0 个重要的已知全长基因组成， 提高了酵母双杂交的效率和准确度。本文在酵母双杂交自激活实验中发现，7 # ( a f 5 2 5 4 1 6 1 ) 基因自激活为阳性。其余的基因再单独与含5 0 0 已知基因组成的小库 杂交，经过筛选，本文得到了5 对蛋白结合的阳性结果。 针对这5 对阳性结果，本文将这些阳性基因克隆到哺乳动物细胞表达载体中， 进行免疫共沉淀实验，在哺乳动物细胞中确认他们的相互作用。实验结果是1 l # ( h s 1 8 8 8 8 1 ) 基因和两个蛋白p l a g l l 、z m 呵d 1 1 分别的免疫共沉淀实验都是阳性。 进一步，本文将1 l 群( h s 1 8 8 8 8 1 ) 基因截成1 1 5 4 a a 的1 1 d 1 ( d 2 4 3 c ) 和1 5 5 3 9 8 缸 的1 1 d 2 ( d 2 4 3 c ) 两段，分别克隆至哺乳动物细胞表达载体中，分别与p l a g l l 和z m y n d l l 进行的免疫共沉淀实验发现，1 1 d 1 ( d 2 4 3 c ) 与p l a g l l 存在相互 作用，而1 l d 2 ( d 1 5 4 n ) 与z m n o l l 存在相互作用。 根据p l a g l l 和z m n d l l 提供的功能提示：1 l # ( h s 1 8 8 8 8 1 ) 基因可能与肿瘤、 增殖、转录激活有关。本文为此进行了m t t 、细胞凋亡等相关的功能实验，目前实 验正在进行中。 总之，本文从4 7 6 个基因序列中，经过生物信息学初选，挑出1 3 个基因并与 5 0 0 已知基因的小库进行酵母双杂交筛选，得到5 对阳性结果；最后经过免疫共沉 淀的验证，发现1 1 # 口s 1 8 8 8 8 1 ) 的l l d l 片断与p l a g l l ( p l e i o m o r p l l i ca d e n o m a 6 ! 里堡兰墨垒查量! 里垦兰翌兰堕堡主兰兰垒墨 g e n e - l i k e1 ，多形性腺瘤样基因1 ) 基因结合，1 1 # 口s 1 8 8 8 8 1 ) 的1 1 d 2 片断与 z m 11 ( z i n cf i n g e r ，m 孙dd o m a i nc o m a i n i i 喀1 1 ，含锌指和m y n d 结构域蛋白 1 1 ) 结合。这些研究结果为进一步揭示新基因1 1 # ( h s 1 8 8 8 8 1 ) 的功能，提示了方向、 奠定了基础。 新基因h s 1 8 8 8 8 l 的生物学功能初筛 a b s t r a c t w i m 小ec o m p l g t e 舢匝a ng e n o m es e q u e n c en o wi nh a n d ，w ef a c e 协ee n o m o l l s c h a l l e n g eo fi n t e r p r e t i n g “a n dl e a m m gh o wt ou s et h a ti n f b n n a t i o nt ou n d e r 咖n d 也e 如c t i o n so fs e q u e n c e s ，e s p e c i a l l yt h ee x o n sw h i c hw ed i dn o tk n o we x a c yt h e e m e 唱e n c eo fs y s t e m sb i o l o 日a n d 血es t r a t e g yo fa m i b i o l o 跚g i v ean e w r o u t et os t u d y m en m c t i o n so f n e w g e n e s 1 1 1t h i sa n i c l e ，w ea i l a l y s e4 7 6e x 0 g e n e s n m c t i o f l s ，a i l dp i c ko u t1 3g e n e si n l e e n d n e n 、v ei n s e r t 血e1 3g e n e sr e s p e c t i v e l yi i l t o y e a s te x p r e s s i o nv e c o o r sa i l d m 锄m a j i a ne x p r e s s i o nv e c t o r s t w oh 蛳ds y s t e m sh a v eb e e nu s c dt oi d e n t i 匆n o v e lc o l n p o n e n t so fs i g n a l i n g n e t w o r k sa n dg i v e 也ec u eo fn e wg e n e s 如n c t i o n sb a s e do ni n t e r a c t i o l l s 谢md e f i n e d p a 栅p r o t e i n s o n eo f m ep f o t e 弧w _ h i c hc a n 词e r a c tw i l l le a c h 湘m u s t b ead e n n e d p r o t c i i l s 0 i l rt w o h y b r i ds y s t e m st a k el l i g ht l l r o u g h p u td n l gd i s c o v e r ys c r e e n i n g s t r a t e 百e st oi d e m i 命a g e n t sr e g u l a t i l 坞协ea c t i v i t yo fb i o l o g i c a l l yi m p o r t a n tt a 唱e t p r o t e i n s i nt h i sa n i c kw eu s el i b r a r yw h i c hh a s5 0 0d e f i n e dg e n e s a sa 矧斌t ，w ef i n d5 c o u p l e si n t e r a c t i o np r o t e i n s c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n i sac l a s s i c a lm e n l o do f d e t e c t i n gp r o t e i n - p r o t e i n i n t e m c t i o n s t h ek e yp o i n to f c o i m m u n o p r e c i p i 诅t i o ni st h ep m t e i l l si n t e r a c d o nh a p p e i l s mm 锄m a l i a nc e l l s t h er e s i l l tf o rt 1 1 i s p a ne x p e m e n ti sm a tw ed e m o n s 订a t e d 1l d l a no f1 1 # 哪s 1 8 8 8 8 1 ) ，1 - 1 5 4 a a ) c a nb i n dt op l a g l l ( p l e i o m o r p l l i ca d e n o m a g e n e - l i k e1 ) a n d1 l d 2 ( p a r to fl1 # 口s 1 8 8 8 8 1 ) ，1 5 5 3 9 8 a a ) c 眦b i n dt 0z m 1 1 ( z i n c 丘i l g e r ，帅d o m 血c o n t a i n i n g1 1 ) a c c o r d i n gt ot l l ef i l i l c t i o i l sf b u n da k e a d y ，i ti sp o s s i b l y1 1 撑( h s 1 8 8 8 8 1 ) i n v o l v e d i n t om ep a m o g e n e s i so fc a n c e r ，i n ot h ee e l lp r o l i 传r a t i o n ，a n di i 】_ t o 也e a n s a c t i v 8 t i o n a c t i v i t i e s w jt e s to l | rm i n k sb ym t t e x p e r i m e m a l li no n c ，f o l l o wt h en e ws t r 种e g i e sf o r 咖d yn e wg e n e s f l l n c d o n s ，w e d e m o n s h 眦e d1 l 撑饵s 1 8 8 8 8 1 ) c a l lb i n dt oe i t h e rp l a g l lo rz m y n d l l t h e s er e s u l t s 8 中国协和匡科走学中国医学科学院硕士毕业论文 谢l l d i r e c t t h e f i l n c t i o ns t i i d y o f l l 群( h s 1 8 8 8 8 1 ) 9 新基因h s 18 8 8 8 l 的生物擘功能初筛 月u百 人类基因组测序工作已经基本完成，并且错误率已经低于1 0 万分之一。据估 计编码蛋白的人类基因有2 0 0 0 0 2 5 0 0 0 个。已鉴定的基因有2 2 2 8 7 个，转录本3 4 2 1 4 个，包括1 9 4 3 8 已知基因，2 1 8 8 预测基因f 1 】。如何针对国内外未见报道的、功能 不清楚的完全“新”基因，进行药物靶点基因、疾病相关基因的筛选研究，以期发 现原创的、有自主知识产权的、有临床应用价值的新基因是一个激动人心而又紧迫 的课题。 人类重要功能基因的研究策略主要有两种：传统生物学策略，具体路线是： 生物活性斗蛋白质一基因啼细胞呻动物模型哼人体内功能及与疾病关联的研究路 线。反向生物学策略，具体路线有两种方式：a d n a 蛋白质专细胞斗动物模型 寸人体内功能及与疾病关联。b 疾病标本一d n a 致病基因或易感基因分析斗蛋 白质一细胞斗动物模型人体内功能及与疾病关联。反向生物学策略对新基因功能 研究初始阶段的技术路线如下： 人类新基因功能研究初始阿慷的通用流程图 这个研究策略中包含系统生物学的思想。系统生物学和人类基因组计划有着密 里堡垒墨壁苎兰! 嬖墨兰壁兰堡塑主兰些堡兰 切的关系。人类基因组计划的发起人之一，美国科学家莱诺伊胡德( l e r o yh o o d ) 就是系统牛物学的创始人之一。系统生物学是在基因组学、蛋白质组学等新型大科 学发展的基础上孕育产生的，是研究一个生物系统孛所有组成成分( 基因、m r n a 、 蛋白质等) 的构成，以及在特定条件下这些组分问的相互关系的学科【2 】。也就是说， 系统生物学不同于以往的实验生物学仅关心个别的基因和蛋白质，它要研究所 有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。 离开了数学和计算机科学，就不会有系统生物学。也许正是基于这一考虑，科 学家把系统生物学分为“湿”的实验部分( 实验室内的研究) 和“干”的实验部分 ( 计算机模拟和理论分析) 【3 】。“湿”、“干”实验的完美整合才是真正的系统生物 学。 本研究中的生物信息学研究就属于“干”的实验。酵母双杂交、免疫共沉淀等 实验属于“湿”的实验。 其中的生物信息学工具有快捷方便，处理数据量大的优势，但目前生物信息学 主要建立在数据库而不是实验的基础上，所以生物信息学非常适宜作为大量初筛的 工具，并需“湿”的实验的验证。 酵母双杂交系统是在酿酒酵母中研究蛋白质问相互作用的一种非常有效的分 子生物学方法。但以往采用组织文库进行的酵母双杂交筛选的方法有成本高、工作 量大、容易出现假阳性和假阴性的弊端。本文中采用的5 0 0 已知功能的全长基因组 成的c d n a 文库很大程度上解决了以上的问题。 本文正是在系统生物学思想的指导下，运用反向生物学策略对新基因功能进行 初始阶段的研究，最终希望能对一个有重要意义的新基因的发现和应用提供初始阶 段工作。 新基因h s1 8 8 8 8 1 的生牺学功能初筛 本研究进行的主要技术路线 中国协和医科大学中国医学科学院硕士毕业论文 本研究进行的主要实验流程 生物信息学初选基因 j l 基因亚克隆经p c r 、连接克隆至p g e m te a s y 质粒载体 jl s f i l 酶切、回收目的片断克隆至p g b 9 载体，测序确认 jl 单个基因p g b 9 质粒分别转酵母菌y 1 9 0 jl 自激活b g a l a c t o s i d a s e 活性检测 l 无自激活基因分别与已知基因库共转酵母菌y 1 9 0 上 s d - h i s r i 却l e u + 3 a t 营养筛选 j 上 b g a l a c t o s i d a s e 活性检澳0 上 酵母阳性克隆质粒提取 l 质粒电转入大肠杆菌t o p l 0 ，提质粒，测序 上 两两质粒共转酵母菌y 1 9 0 上 s d 1 i s t r p 。l e u 营养筛选 上 b g a l a c t o s i d a s e 活性检测 jl 质粒经s f i l 酶切、目的片断胶回收连接到p e f 或p c d e f 载体 新基因h s 1 8 8 8 8 1 的生物学功能初筛 阳性作用质粒两两共转 玎i k 2 9 3 t 细胞 j 上 免疫印迹蛋白表达检测 上 免疫共沉淀实验 l 免疫印迹检测 l 截短体基因经p c r 、连接克隆至p g e m te a s y 质粒载体 上 s 6 1 酶切、回收目的片断克隆至d e f 载体，测序确认 上 截短体两两共转 玎三k 2 9 3 t 细胞 上 截短体免疫印迹蛋白表达检测 上 截短体免疫共沉淀实验 j 上 截短体免疫印迹检测 l m 订等其他功能实验( 进行中) ! 璺堡查垦盐苎兰! 堕垦兰翌兰竺堡主兰些堡查 第一部分生物信息学遴选基因 生物信息学分析目的秘方法 1 基因来源 生物信息学分析的4 7 6 个基因来源于国家人类基因组北方研究中心功能i i r 组建 立的全长基因e a s y 载体基因库。 2 分析目的和原则 分析的目的：对全长c d n a 文库的基因功能进行分析研究。 分析原则：能进行酵母双杂交实验，酵母双杂交对杂交蛋白要求是存在于胞 质或胞核的蛋白，不能是分泌蛋白、跨膜蛋白，也不能含有d n a 激活结构域。 g e n b a n k 中没有注释或注释不完全的结构基因。 3 方法 本文辛要利用i n t e m e t 在线工具进行生物信息学分析。分析工具如下： 3 1 序列的跨膜结构预测和信号肽结构预测 序列的跨膜结构预测主要通过t e c h l l i c a lu n i v e r s i t yo f d e n m a r k 的n ec e n t e rf o r b i o l o g i c a ls e q u e n c ea n a l y s i s 的2 o 版n 俐m ms e r v e r 进行。 网址： 迫；巡! ，! 坠地：出垡：4 型s 巡i 堑旦坦坚必 。 序列的信号肽结构预测主要通过t e c h n i c a lu n i v e r s 姆o f d e n m a 谯的t h cc e m e r f o rb i o l o g i c a ls e q u e n c ea i l a l y s i s 的2 o 和3 o 版s i g n a l ps e r v e r 进行。网址： ! 丛! 卫；型螋璺坠：e ! 重坠：垂醚s 曼! ! i 量曼世墨i g h 垒! 型。 3 2 序列的相似性和文献检索 m r n a c d n a 、e s t 的检索主要通过n c b i ( n a t i o n a lc e m e rf o rb i o t e c h n o l o 日 i n f o r m a t i o nu s ) 的数据库进行。网址：丛p ；塑盥丑照世塑：堂：g q 坦l 墨王，分别 以核酸序列检索b l a s t n 库和以蛋白质序列检索b l a s t p 库，二者都主要检索其 中的n r 数据库( n o n r e d t l n d a l l td a t a b a s e ，非冗余数据库) 。 1 5 新基目如1 8 b s 8 1 的生物学功能初筛 基因组d n a 的检索主要通过u c s c 的b 1 a t 进行，网址 3 3m o t i f 、d o m a i 的分析 主要通过欧洲生物信息研究所( e u m p e a i lm o l e c u l a rb i o i r 曲珊a t i c sh t i m t e ， e m b l e b i ) 的h l t e r p m 软件进行。网址：逝；丛姻塑b i ：堑：然必投s b 型。 二分析过程 利用上述在线工具，按下列分析顺序和目的分析。 分析顺得到的基因 备注 分析方法目的 序数 l 序列的跨膜结构预测剔除有跨膜结构的基因 1 4 6 2 序列的信号肽结构预测剔除是分泌蛋白的基因 与现有的g e b a l l k 数据进 序列的相似性比对( 按行比对，包括人类和其他 3 m r n a c d n a 、e s t 、基因组物种，特别是已知功能的按顺 d n a 的层次进行)基因比对，确认基因的完序进 整性和是否是己知基因 9 0行分 如果与已知基因高度相似 析 或就是已知基因，则进行 4 序列的文献检索 相关文献查找。选择基因 功能不完全清楚的基因。 选取没有d 1 q a 激活结构 5 m o t i f 、d o m a i n 的分析 1 3 域的基因。 三分析结果 1 经跨膜结构预测和信号肽预测得到的胞内蛋白结果 ! 望堡童垦茎叁兰里垦兰登兰堕塑主兰些堕圭 在4 7 6 个基因中，经生物信息学跨膜结构预测和信号肽预测得到3 3 0 个可能序 列。剔除这3 3 0 个基因，得到1 4 6 个胞内蛋白基因。 2 ，序列的相似性和文献检索 经序列的相似性和文献检索。排除了5 6 个序列，剩下9 0 个基因序列。 3 m o t i f 、d o m a i n 的分析和亚细胞定位预测以及蛋白磷酸化位点和相互 作用位点的分析后得到的结果 经m o t i f 、d o m a i n 的分析和亚细胞定位预测以及蛋白磷酸化位点和相互作用位 点的分析等功能分析，最终确定了1 3 个基因。如下表： 生物信息学初筛的1 3 个基因基本情况表 ln 。1 c c 静s 吣nn c 2 8 4 4 ll o c u s i i n k5 7 0 3 7 u n i g e n e h s 1 5 1 4 4 l 仲h t e d l c y t 0 2 蛐e t i c7 p 2 ln m - 0 2 0 3 1 9 ；b c 0 3 5 3 5 3 s e q u e n c e 山目c r i p t i o ni 啪) o 吐l e t i c a lp r o t c i nd k f z p 5 6 4 0 0 4 3 m v h i k k g e i j o e e k e i l e v i g k g t v o e a g l l l s s k n v r v n c l d e n g m t p l m h a a y k g k l d m c k l 】l l r h g a d ，n c h o h e h ( y t a l m f a a l s g n l ( d i t w v m l e a g a e t d v v n s v g r l a a o m a a f v g o h d c v l l l n n f f p r e r l d y ：p q g l d k e p k l p p k l a g p l h l t l t n u i p v k i v m u v n e n p l l e 从l n 跹y r v m d l i c e k c m k q r d m n e v l a m k 瑚y l s c i f q k c r n f l k d g e p n t e i n n k l d t l i k s l l k g r a s d g f p v y q e k i l r e s i r k f p y c 队t l l q q l v r s i a p v e l g s d 阿a q u e n c e f s v l t q a i t ( 均v g f v d v e f c t l g e k o a s k r c s v c k m v i y c d o t c 0 k 1 h w 丌h k k i c k n l k d i y e k o o l e a a k e k r o e e n h g k l d v n s n c v n e b o p e a e v g i s o k d s n p e d s g e g k k e s l e s e a e l e g l q d a p a g p q v s e e d o m i n a n k y 血( 11 - 1 3 5 阻) - m y n dt y p e ( 3 2 0 - 3 5 7 嘲 p r e d i c t i o n n o 2 c c 协s l o nc m l 2 0 7k c h 0 n k2 8 3 3 7 7 h n l g e n e h s 1 2 8 6 7 6 哪。弘n e t i c1 2 a 1 3 1 3 他i - 把d 转q u 蚰c e 甄m _ 2 0 8 6 4 7 ，a k 0 7 4 7 3 3 ，a l 8 3 2 2 4 7 白e s c r i p l j 蛐里。c 2 9 3 3 7 71 1 ) 州b 髓 龆l 掣嘲nl o c 2 9 3 3 7 7 p r o t e nm a l l f a r s l r l c r w g a k r l g v a s l b a o r g v s f k j 正e k t a h s s l a l f r d d t g v k y g l v g l e s e u e c e 尹t k v a u q v e r f r e w a v v l a d t a v t s g r h v w e v t v 丘r s 0 0 f r i g v a d v d m s r d s c l g v d d r 新基因h s 1 8 8 8 8 l 的生物学功能初筛 n o j 3x n 2 2 9 3l o c u s l j n k1 5 0 8 1 9u n 睡e n eh s 8 4 0 6 3 ；c y t o 铲n e t i c 2 q 1 2 3 。 h t e ds e q i c e 讯邶9 7 9 5 4 ：a k 0 2 7 1 6 0 h e 刚p t i o n m y p 讪c t i c a l 畔i nl o c l 5 0 8 1 9 p r o t e n，c l e p i g r q s p j 也q a v v o l q p w a c w t h “t k d v f g s g h p l p g s l y s r a s l l 下姒l y s v 器s a l o p l g a h t ( 把s p g p g t g g p a l c c p g a v c t t 湖q c n c e ! 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l e t m e v p r r r f s d l t k s l o e c r l p h k s v l g l s j e d g e g w p d o m i n ；l j b xd 咖a i n f l 9 1 2 7 2 哪 ，p r e d l c n o n h o 7s m 3 4 3 41 0 c u s n k n i g e n e - c ”o 譬明e t r a 托d 秘q u e n c e| a f 5 2 5 4 1 6 1 m t q i q g t c n f m q e s v l d f d k p s s a i p t s q p p s a t p g s p v a s k e q n l s s q s d f l q e p l q a t l s s p v t c s s n a c w v t t d q a s s g s e t e f n 葛e t p e v f n v n a p l p p r i ( e q e i k e s p y s p g y n q l l s f t t a s t q t p p q c q l p s i h v e q t v h s q e t a q t n v f p r p l q p f v n s r g s v r g c t r g o i 也l t 。甜s y r s p g g y k g f d t y r g l p s i s n g n y s q l q f q a l 啦y s g a p y s q r d n f q q c y k r g g t s g g p ；u n s r a g w s d s s q v s s p e 砌) n e t p n s g d s g o g d s r s m v d v p v t n p a a t i l p v h v y p l p 2 s e q u e n c ei l o o m r v a f s a a r t s n l a p g l l r ) 0 p l v f d u l i 州l g e t f d l o l l 潞n c p v n g t y vf i f h m l k il l a v n v p i y v n l 刚e e v l 。v s a y a n d g a p d h e t as l 姒1 l o l f o g d 0 l w l r l h r g a l y o s s l w k y s t f s g l y o d d o m a i n p 代d i n i o n c o m p l e m e n tc i qp 加把i n ( 2 9 8 舶4 哪，t n f l i 鲰3 0 2 4 3 4 姐) n o 8a t l - 1 2 6i o c u 订i n k1 1 3 2 4 6 u n i g e h & 4 0 5 9 1 3 y t o 妒n e l i 1 2 p 1 3 3 l r 山f 甜。e q u 蛐轴m - 1 3 跗2 5 ，b c 0 0 9 9 2 5 驷曙c r i p t i o n l o c l l 3 2 4 6 h y p o t h e c a l p r a k i n b 0 0 0 9 9 2 5 j m a s a s t o p a a l s a e o a k v v l a e q a f s a p e n a v r m d e a r d n a c n d m g k m l q f v l p v a l q ， p m t e i n! i q q e v i k a y g f s c d g e g v l k f a r l v k s y e a q d p e i a s l s g k l k a l f l 跚啊l p p h g p 从g q u e n 驿b s v a a s “8 佃；l 几姗qd o m a 哪- 2 l 驰) m t d l c t l o n ， l m g p r k k s v k t c i m n n e l p e e m a d e t k d y m n q l s 眦v l c h i f r y l p l o d i m c m e c l s r k l ；k 队v t l y l r v v r v v d l c a g r w w e y m p s g 丌d a s f l t l l k k m p d v e o l y g l h p r y l e r r r v p r o t e j 字h e a f s i p g v l e a l q a c p n l v g v e t s h l e l v e s l w t y m p h v h i l g k f r n r n g a f p i p p e n k l k i p i g a k i q l l l h l v g v n v p e i p c l p m l 砌 u ，m k w v i u l t k p o p f k d f l c i s l r t f v m r | n c a g p t n s l k y v p l v t g l a s a r n l e h l e m v r v p f l g g u q h v v e d s w r s g g f r n l h t i v l 玲a c k n a l e v d l g y l n i t a a 刚也h e v r i o p s l s k d g v f s a u ( m a e l e f p p v - d o m i n 1 1 m pd c l l y d r o g 帆西e ，g m p 哪u c 协e ( 4 3 - 3 3 7 龃) ；c y c l i k ef - b o x ( 3 0 一7 5 船) p m l c h o ”； n 0 1 0a t 3 6 6 0 l l o c u s n k7 9 7 7 9 u n i g e n e h s 1 1 1 0 9 2 搿t o g e h e 畦c 譬q 2 3 r e l a t e ds t q u e n 扣m _ 0 2 4 7 2 4 ；n p - 0 7 9 0 0 0 ；b 删0 1 h c r i p t i o n 1 1 y p 劬吐i c a l 岫i nf l j 2 2 3 3 2 m n e s a p g t y v v r n p h s s e l p t l n f q d t v n t l t n s p a l p l e t s a c q d 肼s a n v q n a e g t k i w g e e a l k m d l d h m f y s t e v s v s s t e n a v s s d l r a o d v p v l s l s n s s e n a a s v i s y s g s a p j s v i v h s s q f s s v i m h s n a i 从m t s s n l r a f s d p a v s q s l k d d s k p e p d k v g r f a s r p k s i k e k k k t t s h t r g e i p e e s n y v a d p g g s l s k 兀n 1 a e e t s k i e t y l a k p a l p g t s t n s n v a 甲l c q l l v k i g n e a k r h l l g s k l f y k r o r r p k y q m q e e p l p o g l q d p e p s g d s p l g l c q s p m t e i n 范c m e m s e v f d d a s d q d s l d k p w r p y n 脚k k k s r q l k k m r k v n w r k e h o n r s p s h k c k y s e q u e n c ep a e l d c a v g k a p ( p k p f e e e e t k e m p k u q c e l c d g d k a v g a g n q g r p h r h l t s 耻型坠 c a k o f o s p s 几k m h m r c h r g e k p y o c k t c g r c f s v o g n l 0 姗r i h l g l k e f v c o y c n k a f t l n e l 乙h e r 珊t g e k r y h c q f c f q r l 7 l y l s t k r n h e q r h i 唧n g k g y a c f o c p k l c 靛t a a a l g m h o k k h l f k s p s q q e k i g d v c h e n s n p l e n q h f i g s e d n d q k d n i q l v e n v v | l j d o m _ j n p 删嘶n j c 2 h 2 咖( 4 1 6 郴8 a a 4 4 4 4 6 6 a a