（分析化学专业论文）后向光散射分析技术开发及其在生化分析中的应用.pdf

酣师献学硕士做后向光散射分析技术磁及其在生化分舯眦用 后向光散射分析技术的开发及其在生化分析中的应用 学科专业：分析化学 指导教师：黄承志教授 研究方向：生物光分析化学 研究生：王永红( 2 0 0 1 3 0 4 ) 内容摘要 共振光散射技术( r l s ) 自其建立以来，因操作简便和灵敏度高已广泛应用 于研究分子的聚集行为及生物大分子和药物分析等领域，但存在选择性差的缺 点。本文在普通r l s 技术的基础上，设计了后向光散射( b a c k w a r d r e s o n a n c e l i g h t s c a t t e r i n g , b r l s ) 信号检测装置，通过检测后向的共振光散射信号，实现了对生 物大分子的高灵敏及高选择性分析。 在p h 3 5 0 的酸性介质中，萘铬绿与蛋白质发生静电作用产生以3 4 2 0 r i m 为 特征峰的共振光散射( r l s ) 增强光谱。在此波长下，蛋白质的浓度与增强共振 光散射强度( z f f p l s ) 呈线性关系，据此建立了痕量蛋白质的共振光散射分析法， 方法成功地应用于尿样中总蛋白质分析。 在p h2 9 0 , 离子强度为0 0 0 3m 时，在阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲 铵( c t m a b ) 存在下，q t - 蛋白质相互作用产生的粒子富集在h z o c c l 界面上 时，会在3 7 6 n m 产生b r l s 特征峰，增强的b r l s 信号，与h s a 和b s a 浓度 成正比例关系，据此建立了灵敏测定蛋白质的分析方法。 在p h 3 0 0 ，铝离子和水相中d n a s 的结合能够产生增强的共振光散射信号， 舢( i l j ) d n a s 这种二元复合物还可以结合c c h 溶液中的t e t t a p h c n y l p o r p h y r i n f f p p ) ，形成新的三元复合物t p p - a i ( i i i ) - d n a s 并富集在界面上。该复合物4 6 9 n m 产生强烈增强的b r l s 信号，并且局r l s 正比于c t d n a 和i s d n a 的浓度，可用 于灵敏的测定核酸，方法的检出限在皮克级。 在p h6 8 0 ，三辛基氧瞵( t o p o ) 的存在下，c i i ( i i i ) 的水解物和核酸、肝素、 黄原胶等生物大分子在h 2 0 c c l 4 界面上发生共吸附，形成较大的散射颗粒，增 强的i b l u s 正比于生物大分子的浓度，据此建立了生物大分子的分析方法，发展 了新类型的散射分析探针。 关键词：共振光散射技术后向共振光散射技术蛋白质核酸肝素黄原胶 聚合铬液液界面 文后向光散射分析技术开发及其在生化分析中的应用 d e v e l o p m e n t o fb a c k w a r dr e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g t e c h n i q u e s a n dt h e i r a p p l i c a t i o n s i nb i o c h e m i c a l a n a l y s i s m 柏o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y r e s e a r c h ：b i o c h e m i c a ls p e c t r o s c o p ya n a l y s i s s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rc h a n g z h i h u a n gp o s t g r a d u a t e ：y 0 n gh o n gw a n g ( 2 0 0 1 3 0 4 ) a b s t r a c r s i n c er e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g 限l s ) t e c h n i q u e i s d e v e l o p e d ，f o r i t sr e m a r k a b l e c h a r a c t e r i s t i c so fs i m p l eo p e r a t i o na n dh i g hs e n s i t i v i t y , t h i st e c h n i q u eh a sb e e ne x t e n s i v e l ya p p l i e d i nt h e i n v e s t i g a t i o n s o fm o l e c u l a r a g g r e g a t i o n b e h a v i o ra n dt h e a n a l y s e s o f b i o l o g i c a l s u p e r m o l e c u l a ra n dp h a r m a c e u t i c a l sa n ds oo n i nt h i sc o n t r i b u t i o n , b a s e do nt h ec o m m o n r l s m e t h o d ，w ee s t a b l i s h e dan e wb a c k w a r dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g0 3 r l s ) t e c h n i q u e ah i g h l y s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ea s s a ym e t h o do fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e si sp r o p o s e db a s e do nt h e m e a s u r e m e n t so fb r l ss i g n a l sa tw a t e r t e t r a c h l o r e m e t h a n eo - 1 2 0 c c l 4 ) i n t e r f a c e a tp h3 5 0 , t h es t a t i ci n t e r a c t i o no fn a p h t h o c h r o m eg r e e n 州g ) w i t hp r o t e i n so c c u r sa n d r e s u l t si ng r e a t l ye n h a n c e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) s i g n a l sc h a r a c t e r i z e db yap e a l 【a t 2 7 7 0 n ma n d3 4 z o m n i tw a sf o u n dt h a tt h ee n h a n dr l si n t e n s i t y ( a ，r l s ) 砒3 4 2 0m n i s p m p e n i o n m t ot h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n s ，a n dan e wm e t h o df o rt r a c ep r o t e i n sw a se s m b l i s h e d a c c o r d i n g l y t h er e s u l t so fd e t e r m i n a t i o n sf o ru r i n es a m p l e s w e l l gi na g r e e m e n tw i t ht h ed e s i r e d v a l u e s a tp h 3 0 0 ，t h ei n t e r a c t i o no fa l u m i n u mo i d w i t ht h ep h o s p h a t eg r o u po fd n a si na q u e o u s s o l u t i o nc a nr e s u l ti ne n h a n c e dr e s o n a n c ol i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) s i g n a l s t h eb i n a r yc o m p l e xo f a i ( m ) - d n a st h e ni n t e r a c t s w i t ht e t r a p h e n y l p o r p h y r i nf f p p ) i nt e t r a c h l o r e m e t h a n e ，f o r m i n ga t e r n a r yc o m p l e x o ft p p - a i ( i i i ) - d n a s i tw a so b s e r v e dt h a tg r e a t l ye n h a n c e db a c k w a r dr e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g ( b r l s ) s i g n a l s o c c n l _ sw i t hm a x i m u m p e a k a t4 6 9 姗w h e nt h et e m a r yc o m p l e x o ft p p - a i ( i l i ) - d n a sw e r ea b s o r b e dt ot h el i q u i d l i q u i di n t e r f a c e i tw a s f o u n dt h a tt h ee n h a n c e d b a c k w a r dr e s o n a n c e g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t y ) i si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n 仃a t i o no fc a l f t h y m u sd n a ( c t d n a ) a n d f i s hs p e n ud n a ( f s d n a ) t h el i m i t so fd e t e c t i o n ( 3 a ) a i nt h e 文后向光散射分析技术开发及其在生化分析中的应用 p i c o g r a m l e v e l a tp h2 9 0a n di o n i cs t r e n g t ho 0 0 3 m ，i nt h ep r e s e n c eo fc a t i o n i cs u r f a c t a n t , w es t u d yt h e i n t e r a c t i o no f p r o t e i n s w i t h q u e r c e t i n ( o i ) t h e r e s u l t e d s p e c i e s o ft h e i n t e r a c t i o n ，w h e n c o n c e n t r a t e da th 2 0 c c l 4i n t e r f a c e ，g e n e r a t ee n h a n c e db r l ss i g n a l sc h a r a c t e r i z e da t3 7 6 0a m w h i c hw e r ef o u n dt ob ep r o p o r t i o n a lt oh u m a ns e n l mm b u m i n ( 1 i s a ) a n db o v i n es e l u ma l b u m i n 0 3 s a ) i n t h er a n g eo f0 8 - 1 2 5 0n g m la n d1 8 - 1 2 5 0n g m lr e s p e c t i v e l y l i m i to fd e t e r m i n a t i o n ( 3 0 ) o f 7 4 6a n d1 8 4 p g m l a l ea v a i l a b l ef o r t h et w o p r o t e i n s a ip h6 8 0 ，i t h ep r e s e n c eo ft o p o ，t h ei n t e r a c t i o no fh y d r o l y z e dc r ( i i i ) w i t ht h ec a l f t h y m u sd n a , h e p a r i n x a n t h a ng u mi na q u e o u ss o l u t i o nc nr e s u l t i ne n h a n c e db a c k w a r d r e s o n a n c el i g h t s e a t t e f i n gf b g t s ) s i g n a l s p l l e nt h et e r n a r yc o m p l e xw e r ea b s o r b e d t ot h e l i q u i d l i q u i di n t e r f a c e ，i tw a s o b s e r v e dt h a tg r e a t l ye n h a n c e db r l s s i g n a l so c c u r sw i t hm a x i m u m p e a ka t 3 7 8n l n w ef o u n dt h a tt h ee n h a n c e di n r mi si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no f b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s t h el i m i t so fd e t e r m i n a t i o n ( 3 0 ) a r e0 8 5n gm l 一，1 6 5n gm l 一，a n d 2 9 0n gl i l l f o rc t d n a , h e p a r i ns o d i u m , a n dx a n t h a ng u m ，c o r r e s p o n d i n g l y w ee s t a b l i s h e dn e w a s s a y m e t h o da n dd e v e l o pn e wr l s p r o b e k e y w o r d s ：r r o n a n c et i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) ( b r l s ) t e c h n i q u e ；p r o t e i n s ；n u c l e i c a c i d s ； w a t e r t e t r a c h l o r o m e t h a n e0 a ：o c c h ) i n t e r f a c e t e c h n i q u e ；b a c k w a r dl e s o n a l c et i g h ts c a t t e r i n g h e p a r i n ；x a n t h a ng u m ；h y d m l y z e d c r o a l ) ； 酶师献学耻做后向光散射撕技术开发及其在生化分析中的鲫 缩写符号对照表 砒馘绪论 第一章绪论 1 1 1 光散射概述 1 1 1 光散射现象 在自然界中经常会发生各种各样色彩缤纷、绚丽多姿的光现象。如晴朗的天 空是蔚蓝色的，旭日是红色的，朝霞和晚霞是彩色的等。这些光现象是由于大气 分子和悬浮在大气中的微小粒子对太阳光散射的结果。由于介质的不均匀性，使 得光偏离原来传播方向而向侧方散射开来的现象，称为介质对光的散射，即当一 束光通过光学不均匀介质时，在入射光方向以外的各个方向可以观察到光强的一 种光辐射现象。当强度为如，波长为a 的光通过介质时，在其电磁场的作用下， 介质粒子中的电子产生强迫振动，形成具有一定振动频率的偶极振子，振动着的 偶极振子向外辐射电磁波，即散射光。光散射的实质就是光波的电磁场与介质分 子的相互作用过程。 光的散射与介质的不均匀性密切相关。理论上说，各向均匀的纯物质的气体 或液体的散射光强应为零，因为在其中任意选定一个小的散射体积元，总可找到 另一个相对应的散射体积元，使得两者在观察点的散射电场恰好因干涉而完全抵 消。然而，事实上，由于分子处于不停的无规则运动状态，纯物质的气体或液体 的内部各种性质总是围绕着其平衡值随时间和空间涨落，所以我们可以观察到纯 物质的气体或液体的散射。但是，以光波波长为尺度来衡量，纯净气体、液体与 固体都可看作均匀介质，因为在光波波长范围内这些介质密度的统计平均是均匀 的。如果介质是光学不均匀的，例如溶胶，分散相与分散介质折光指数相差较大， 则产生的诱导偶极矩不同，次级辐射波不能抵消，这就出现光散射现象n 在均 相介质中，如果分子热运动引起密度或浓度的局部涨落，将使折光指数或介电常 数也发生局部变化，则次级波不能抵消，也会出现光散射，大分子溶液的光散射 就是这个原因。 1 1 2 光散射的分类 光散射现象可根据散射粒子的性质、散射光的波长和检测方向等进行分类。 删文绪论 1 按散射粒子的性质可将光散射分为： a 丁达尔( t y n d a l l ) 散射，由非均匀相分散体系中的悬浮粒子所产生的光散 射。如光与乳浊液、悬浮液和胶体溶液作用时发生的光散射。 b 分子散射，分子散射是由于分子热运动造成局部密度涨落而引起的，它 比丁达尔散射要弱得多。 2 根据入射光与散射光波长的关系，光散射分为： a 弹性散射( e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) ，又称为经典散射或静态光散射，如 r a y l e i g h 散射。 b 准弹性散射( q u a s i e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) ，又称为动态光散射。 c 非弹性散射( i n e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) ，如r a m a n 散射。 3 根据信号检测方向和激发方向的关系，如图1 所示，可分为【叫： a 前向散射( f o r w a r dl i g h ts c a t t e r i n g ) ，检测方向和激发方向夹角小于9 0 度。 b 直角散射( t i g h t - a n g l el i g h ts c a t t e r i n g ) ，检测方向和激发方向成9 0 度。 c 后向光散射( b a c k w a r dl i g h ts c a t t e r i n g ) ，检测方向和激发光方向之间的角度大于 9 0 度。 1 2 光散射技术的应用 图1 散射示意图 1 2 1 光散射技术发展 光散射现象自从发现以来，经过不断的完善发展，已经在物理【2 】、化学、生 2 一文 绪论 物1 3 1 、天文学【4 t5 】以及气象学1 6 j 上得到广泛的应用。早在1 8 6 9 年，英国剑桥大学 的j t y n d a l l 率先研究了自然光通过金溶胶颗粒时的散射现象。1 9 4 4 年，d e b y e 利用散射光强测得稀溶液中的高分子的分子量【7 1 。1 9 4 8 年，z i m m 提出了著名的 z i m m 作图方法，将浓度和散射角度通过外推法合二为一，从此光散射成为测定 高分子分子量的一种经典方法。1 9 6 9 年，t y n d a l l 引进了一种新的方法1 8 1 用来研 究金溶胶散射粒子悬浮液。1 9 5 1 年，钱人元、施良和等人开始了中国的光散射 研究，采用正八角形溶液池( 可测4 5 。、9 0 。、1 3 5 。的散射光强) ，表征了若干 高分子样品【9 1 。自1 9 6 0 年激光器出现后，光散射技术日趋成熟。1 9 8 1 年，应琦 宗等人【1 0 】设计制作了一台小角激光光散射仪，用以测量大分子的分子量。近年来， 随着电子技术和计算机技术的飞速发展使得激光光散射已经发展成为高分子和 胶体科学研究中一种常规的测试手段。除此之外，光散射技术还可以用于，分子 回转半径、形状和大小的测定i n ：缔合聚合反应过程动态行为的研列1 2 】；研究 分子自身的性质( 诸如分子超极化度、展示分子内分散初步情况【1 3 】、缔合物与构 象转变的关系【1 4 】) 以及分子间相互作用【1 5 1 等方面。 光散射光谱还能够提供有关细胞组织的结构和功能信息1 1 q 7 1 。多重光散射技 术和多角光散射( m a i s ) 技术应用于研究毛细管柱的填充固定相【墙】，以及研究稠 密的多分散胶体悬浮液中的粒子尺寸【1 9 】，蒸气光散射测定( e l s d ) 已经用于毛 细管电泳和高效液相色谱1 2 1 】分析物的气溶胶转化分析中。 1 2 2 共振光散射技术的建立 通常来说，散射光在分光光度法和荧光光度法的光谱测定中是一种重要的干 扰源，需采取如低温冷冻和场分辨技术加以避免或降低其干扰阎。为了避免实验 光谱数据中的一些误导，在生色团( e h r o m o p h o r e ) 的几何排列中采用数学方法 分离散射和吸收部分【2 3 矧。然而，通过测定普通的荧光分光光度计获得的信号而 建立共振光散射技术( r l s ) ，已经很大程度上改变了它在光谱测定方法中的位 置了陋l 。 1 9 9 3 年，p a s t e m a c k 和c o l l i n g s 等为代表的美国科学家把r l s 技术广泛地应 用于物理化学领域，并取得了很大的成功。他们研究了金属配合物1 2 6 1 、卟啉类化 合物1 2 7 - 3 a 1 、和叶绿素的聚集等 3 9 , 4 0 l ，1 9 9 6 年，黄承志等发现增强的r l s 信号在 一定的范围内和加入的核酸浓度成正比关系，应用该方法进行了核酸的定量测定 3 酬撇做绪论 【4 1 ，4 2 】，此后，它在分析化学中的应用得到了迅速的发展。该的优点就是方法的仪 器简单、操作方便。同时它的灵敏度又高，检出限通常可以达到纳克级。 1 2 3 共振光散射技术在分析化学中的应用 r l s 技术的建立，成为了解复杂体系的化学、生理及药理活性、体系中分子 聚集体状态，表征蛋白质、核酸等生物大分子与小分子探针作用机理的重要手段 之一，与紫外可见吸收光谱、荧光光谱和圆二色光谱互为补充，对建立高灵敏的 蛋白质、核酸和临床药物分析方法具有重要意义。目前，该技术已经广泛应用于 无机离子、蛋白质、核酸和药物等的测定中。 无机离子的分析方法一般为经典的分光光度法和荧光光度法，实验证明r l s 技术可以用于无机离子的含量测定，在这个领域，刘绍璞教授做了大量的工作。 目前，见报道的离子有：h g ( i i ) 4 3 枷 、s c ，) 【4 7 侧、m o o ) t 5 m 2 1 、o r ( v 0 t 5 圳、c d o r ) 【5 鄂、s i ( w ) 5 6 5 7 、a g ( i ) t 船1 、p d ( 1 i ) 5 9 1 、a u ( i i i ) 1 6 0 】、p 0 4 ( i i i ) 【6 1 1 、和a ( r ) t 6 2 l 等1 1 种离子。 表面活性剂一般具有亲水性的极性基团和亲油性的非极性基团，它在工业生 产和人们的日常生活中占有十分重要的地位。但是。如果表面活性剂进入人体， 还会提高肝脏合成胆固醇的速度，刺激体重增加，因此研究它们对内分泌的毒性 具有很重要的意义。测定表面活性剂一般有滴定法、分光光度法、荧光光度法、 离子选择性电极法等。目前，已经报道的r i s 方法测定的表面活性剂有： 7 _ , e p h i o 舯l 、c n 正a b 【抖6 q 。 生化药物的分析方法主要有传统的分光光度法和荧光光度法。目前为止，已 见报道的用r l s 方法进行测定的生化药物有：维生素b 1 【盯删、盐酸小檗碱陋, 7 0 l 、 肝素钠【7 1 , 7 2 、粘多糖【7 3 , 7 4 、氨基糖苷类抗生素【祁l 等。 核酸作为重要的遗传物质，是化学、生物学、医学等领域诸多学科最为活跃 的研究领域之一，而核酸的含量测定是研究核酸的基础。目前，核酸含量的测定 以分光光度法【雄删和荧光光度法【8 6 j 使用较多，为了进一步研究和发展新的高灵 敏度、高选择性和简便快捷的测定方法，成为分析工作者的新任务。近年来，共 振光散射方法作为一种新的核酸分析与测定方法，因其灵敏度高，且操作简便， 得到了越来越多的研究和应用。已经报道的r l s 方法测定核酸的分析探针有； 醌亚胺类、碱性三苯甲烷类、和金属配合物、无机酸介质、阳离子卟啉类、酞菁 4 酬文绪论 类染料、阳离子表面活性剂、以及小的纳米微粒等【8 7 - 1 2 8 1 。 蛋白质是生命现象的物质基础，它的定量测定是生命及其相关学科中经常涉 及的内容，也是临床诊断疾病及检查治疗效果的重要指标。测定蛋白质含量常用 分光光度法和荧光光度法【1 2 9 1 4 ，但这些染料结合法费时、操作复杂，且灵敏度 不很高。r l s 方法用来测定蛋白质，进一步提高了测定的灵敏度，并且较少了操 作过程，并且拥有更为广阔的探针范围。已经报道用于蛋白质分析的探针试剂有： 阴离子卟啉、酸性染料、无色的大阴离子、阴离子表面活性剂、以及纳米微粒等 1 4 2 - 1 8 1 】。 纳米粒子，一般是指尺寸在i - 1 0 0n m 间的粒子，是处在原子簇和宏观物体 交界的过渡区域，从通常的关于微观和宏观的观点看，这样的系统既非典型的微 观系统亦非典型的宏观系统，是一种典型介观系统，它具有表面效应、小尺寸效 应和宏观量子隧道效应，而且其光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的 性质都有显著不同。纳米粒子具有良好的光学性能，常用作生物染色剂和免疫标 记物，如胶体m 纳米粒子在免疫学中作为探针。通常的方法是将免疫球蛋白【1 s 2 、 蛋白质a 【瑚1 、凝集素 i s 4 1 等吸附在a u 纳米粒子表面上，形成a u 标记的探针。 纳米粒子用于细胞染色和发光生物标记比普通的荧光或有机探针具有明显优势 1 8 5 , 1 8 6 。由于纳米粒子具有大的比表面积，有高的表面化学活性，对周围环境的 变化十分敏感，因此，可作为对颜色、气体、光、电等各种性能敏感的传感器 【1 8 7 1 s g 。姚刚发现金纳米粒予可以灵敏的测定蛋白质 1 7 i ，许金钩等证明纳米粒子 可以作生物大分子的光散射探针【1 7 7 , 1 1 3 】，蒋治良等用r l s 来表征新的纳米微粒 1 9 0 - 1 蚴，近年来，r i s 技术已经成功用于a u 、a g 、p d 等纳米粒子的表征【1 9 3 - 2 0 2 1 。 i 3 共振光散射新技术开发及其分析应用 1 3 1 倍频散射和二级散射散射技术 刘绍璞教授课题组在研究离子缔台物的散射光学过程中，发现它们在入射 光波长的1 2 和2 倍处也能产生强烈的倍频散射和二级散射，将它们作为一种光 谱现象和分析技术进行研究，并认为这是由于共振瑞利散射产生的共振非线性散 射。他们的这一研究工作丰富了光散射分析的研究内容，并且利用倍频散射和二 级散射建立了测定金属离子如h g ( i i ) 、s e ( i v ) 、c d ( i i ) 、z n ( i i ) 、m “v ) 、c r ( ) 5 酬黼眦文绪论 的分析方法 2 0 3 - 2 0 9 1 ，该方法还可以用于生物大分子的测赳2 1 0 , 2 0 8 , 1 9 2 , 。 1 3 2 三维光散射光谱 在具有3 d 扫描功能的荧光光度计上，除了可以得到共振光散射光谱图外， 还可以得到二级散射( s l s ，k 。= 2 入曲和反二级散射( a s l s ，k 。= o 5 入。以及拉曼散 射光谱图。1 9 9 9 年，黄承志等利用三维散射光谱图研究了水的三维散射光谱图， 讨论了耐尔蓝和d n a 作用产生的各种光散射信号图的机理，并用于灵敏测定 d n a l 9 0 i 。 1 3 3 共振光散射成像研究 以4 8 8n i e t 氩离子激光器作为激发光源，本课题组研究了t p p s 4 在蛋白质模 板上的聚集。溶液中的聚集粒子发出的共振光散射信号可以用普通的显微镜观察 到，经电荷耦合装置( c h a r g e - c o u p l e dd e v i c e ，c c d ) 收集，获得的图像经过分析， 发现在焦平面上的聚集体发光点数和溶液中的蛋白质浓度成正比例关系，该方法 的检出限达到1 0 p g m l ，并且用于人血清中蛋白质含量测定【2 1 1 1 。 1 3 4 流动注射共振光散射联用技术 流动注射是一种非均匀非平衡状态下的在线进样技术，它所提供信息的广泛 性是均匀和平衡体系无法得到的，并且可以用较简单的设备实现分析工作的自动 化，提高工作效率，并具有操作灵活且重现性好的特点，因此得到了广泛的应用。 本身具有高灵敏度的r l s 技术可以与流动注射的快速分析和它的高精度相结合， 使之成为一种更有效的痕量分析技术。 1 3 5 液液界面全内反射一共振光散射技术 对于溶液本体的光散射分析技术，由于它的研究对象主要集中于水溶液中， 对油溶性试剂的使用带来不便，如果加入表面活性剂或者碱溶液助溶，又会使体 系复杂化，同时也限制了研究具有互不相溶的主客体之间的相互识别。而且由于 散射体系的信号与其吸收光谱、颗粒大小、形状、浓度以及相对折光指数等都有 密切的关系，因此r l s 信号容易受到溶液中其它粒子的干扰。 为了弥补上述的不足之处，我们实验室开发了一种新的基于液液界面的全内 反射一共振光散射技术( t i r r l s ) 。该技术是通过组合普通荧光分光光度计的 6 西南师范大学硕士论文绪论 样品室，基于分析物在水四氯化碳界面上的吸附，将分析物萃取到液液界面上， 从而达到富集样品和脱离水相中的干扰，因此它的灵敏度和抗干扰性相比于r l s 有很大的提高。目前为止，t i r r l s 技术已经成功用于药物分析、蛋白质分析、 核酸分析等方面 2 1 2 - 2 1 5 , 7 0 1 。 1 4 后向光散射技术 1 4 i 光散射光谱用于皮肤癌变的检测 皮肤癌变已经变为一个世界性的问题。根据癌症统计评论( a n n u a lc a n c e r s t a t i s t i c s r e v i e w ) 2 1 6 】，在美国1 9 9 8 年大约有4 2 0 0 0 例黑色素瘤( m e l a n o m a ) 皮肤癌， 在2 0 0 0 年这个数字跳到了4 7 7 0 0 例【2 1 7 1 ，在2 0 0 0 年大概死亡了7 7 0 0 例，非黑色 素瘤癌症在所有诊断的癌症中约占4 0 1 2 埔1 ，在这些癌症患者中，每年引起的死 亡人数大约为1 5 0 0 例。光散射光谱能够提供有关细胞组织的结构和功能信息 2 1 9 冽，而光学成像和光谱测定在生物医药中的一个重要应用就是进行在线和无 损分析，因此光散射成像可以用来检测人类上皮细胞中早期癌症变化，比如上皮 细胞核的发育异常或者形成肿瘤等。上皮细胞核的变化是发育异常的重要标志 【2 2 1 磁l ，诊断标准主要包括细胞核增大、细胞核的尺寸和形状发生变化，以及染 色质浓度的增大。由于人类8 5 的癌症起源于上皮细胞，并且绝大多数癌症在早 期阶段是容易被治疗的，因此早期癌症测定是非常重要的。 活组织的细胞结构特征在生物医疗科学中是一个重要的问题。原位活体细胞 中定量信息的提取，能够用于研究活体中生物物理过程，并监测细胞中物质的形 态变化和生理学变化。在目前，这些信息只能通过组织切除或者组织切片获得， 然后通过显微技术和流式细胞计来探测细胞的内部结构，但是应用这些技术到原 位测定是不可能的，因此有必要发展光谱手段来进行相应的研究。 组织的后向散射光可以分为两个部分，单重散射( s i n g l e - s c a t t e r i n g ) 和多重散 射光( m u l t i p l ys c a t t e r e dl i g h t ) ，通过后向散射光谱变化可以得到细胞核的尺寸变化 和折光指数变化。单重散射产生相应的有效信息，而多重散射光产生较大的散射 背景，单重散射被淹没在生物组织的散射背景中，为了研究单重散射成分，首先 需要把它从散射背景中提取出来，而偏振的激发光可以做到这一点，该技术已经 用于研究1 3 腔上皮细胞的形态变化 笠3 , 2 2 4 , 2 4 5 1 。它的工作原理是线性偏振激发光照 7 文绪论 ，型嗣 ：h 口互蜀o f b d 1 0 扭o 恼i d ，m p k 图2 偏振光散射光谱仪测定系统装置示意图 b a c k m a n 等提出偏振光散射技术进行原位活体细胞的探测。人体表面排满了 富含细胞的上皮细胞层，穿过上皮细胞层的光被各种尺寸的细胞器官散射，比如 线粒体和细胞核 2 2 6 1 ，他们的折光因子比环绕细胞核的细胞质要大。细胞核比光 的波长要大一点6 1 0 u r n 0 5 u r n ) ，前向散射光占主要部分，在后向也有适量的散 射光i 蕾7 】。为了检测含有异常结构的上皮细胞的变化，必须区分下层组织的上皮 细胞层的反射光。由于在组织中的穿透深度完全超出了上皮细胞层的厚度，由上 皮细胞核的后向散射光通常非常小，容易被淹没在下层组织的散射背景中。为了 分析这些后向散射成分，背景必须扣除。他们已经研究了后向散射光有一个波长 依靠的振动成分 2 2 0 1 ，它的周期性随着细胞核的增大增长，并且它的量和细胞结 构或者上皮细胞核的密度有关。通过分析振动成分的频率和数量，可以得到上皮 细胞核的尺寸分布，从而达到诊断的目的。图3 是用原位光散射光谱区分上皮细 胞的异常发育和正常发育。 如图4 所示是b a c k m a n 等提出了基于光散射光谱的成像技术装置示意图 嘲，它能够原位( i ns i r e ) 反映活体组织的较宽表面上皮细胞核的结构变化而不 8 酬擗文 绪论 需要组织切除，并且成像能够直接区分上皮细胞核的单重后向散射信号和多重散 射光。进一步分析单重后向散射信号能够提供关于上皮细胞核的尺寸、多态度 ( d e g r e eo fp l e o m o r p h i s m ) 、染色度( d e g r e eo fh y p c r c h r o m a s i a ) 、染色质的总量等定 量信息，这些结果可进行l f 每床诊断。该技术在临床使用有很大的前途，并且作为 一个生物医药的研究工具去研究细胞核的动态变化过程以及癌症和其他疾病的 变化过程，尤其重要的应用是可以检测早期的癌症以及宫颈癌和口腔癌的癌症前 期。 图3 光散射光谱区分发育正常和发育异常的上皮细胞 图4 偏振的光救射光谱成像装置示意图光路传输包括弧光 灯光源。聚焦消色透镜，宽带偏振片，窄带波长选择滤光片， 光束分裂器和一个平面镜光路收集部分包括延迟透镜系统，角 度选择孔径，旋转分析偏振片和c c d 此外，c o n n c y 等报道了用近红外光谱进行口腔癌变检测的光学系统【2 2 9 l ， 9 文绪论 r o n i n ga n dr i e c h 研究了通过计算机模拟癌变，癌变的特征主要表现在颜色、形 状、尺寸，以及基于对称性的其他方面f 圳。w a l l a c e 等讨论了用分光光度计特征 选择研究估测皮肤损伤的颜色变化【2 3 l 】。值得注意的是w a n g 等通过散射反射光 谱成像技术【2 3 2 1 ( d i f f u s er e f l e c t a n c es p e c t r o s c o p i ci m a g i n g , d r s i ) 进行快速和无损 分析，他们采用斜角入射，其优点是可以收集上层组织的信息而不用穿透较深的 组织 2 3 3 1 ，这一点是相当重要的。由于皮肤癌变信息表现在皮肤组织的上层，而 更深层的信息仅仅只会增加背景噪音，另外，斜角激发的d r s i 对于散射现象是 灵敏的，并且能够从同一介质分离出吸收现象，该技术被应用于多光纤阵列模式， 它能够得到组织表现的空间信息，他们把d r s i 技术和成像技术结合起来，通过 电脑辅助工具去测定临床中未知癌变的测定【捌，他们的研究同时指出，散射反 射光谱和所收集的方向和位置有关系。 1 4 2 后向光散射技术在其他领域的应用 1 用于海洋监测悬浮颗粒物质 光学后向散射法具有线性好、量程大，能实现实时连续测量等特点，是目前 国际上广泛采用的测量悬浮颗粒浓度的方法。利用这种技术可以研究悬浮颗粒粒 径大小、表面性质( 粗糙度和光通透性) 、颜色深浅等物理性质对光学后向散射 法的影响【拼】。 图5 b b 2 f 传焙器测定后向光散射和叶绿素荧光计呈立体交叉型构造 西南师范大学硕士论文绪论 美国w e tl a b s 开发的e n v i r o n m e n t a lc h a r a c t e r i z a t i o no p t i c s ( e c o ) 系列工 具用来测定天然水的生物光学和物理参数【w 2 】。他们开发了一种新的传感器一 b b 2 f ，它可以测定4 7 0 r i m ( 蓝光) 和7 4 0 h m ( 红光) 处1 4 0 度的光学后向散射 强度和叶绿素的荧光。它作为生物地球化学传感器，满足了自动测量平台的需求。 它作为一个强有效的工具用来测定天然水的生物发光，具有体积小、多种输出以 及精确度高和稳定性好等特点，已经成为广大科学研究和环境监测应用的首要选 择。 2 用后向散射光进行大气监测以及农业中的研究 激光雷达通过测量大气中自然出现的少量颗粒的后向散射，可以检测风速、 探测紊流、实时测量风场等，同时用于低层大气的后向散射特征研究 z 3 s - 2 3 7 1 。 同时，分析植物物理参数对后向散射特征的影响及其随极化而变化的规律，以及 这些特征在整个作物生长周期中的变化规律【2 3 睨4 1 1 。 3 反射后向散射探针 o o b a no p t i c s ，i n c 设计并制作的反射，后向散射探针的结构示意图6 所示m 】， 该装置由六根激发光纤和一根发射光纤组成，可以用于多种用途：测定固体表面 的反射和荧光，或者液体和固体粉末的荧光或者后向散射光，可以进行紫外一可 见区的检测，或者可见光一近红外测定。探针头可以根据不同的需求选择不锈钢 的或者塑料的。 图6 反射后向散射探针为美国海洋光学有限公司开发设计， 可用于多种测定，并且适用于多种波段测定 文 绪论 4 后向散射用于表面和界面研究 由于表面现象在了解纳米体系、以及和气相或者液相相接触表面的结构，动 力学以及表面反应都是重要的谋题，一般使用常见的方法比如低能电子衍射或者 俄歇电子能谱( 1 0 we n e r g ye l e c t r o nd i f f r a c t i o no ra u g e re l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ) 等高 度复杂的方法。k u h n k e 等在超高真空中应用热氮原予散射( t h e r m a lh e l i u ma t o m s c a t t e 血g ) 作为一个非常好的灵敏的工具来进行表面和被吸附物的结构和动力学 研究。氮原子散射是一种非破坏性的方法，在一个氮原子散射仪器中低能的单色 氨光束是氦气通过一个1 0 微米的小孔进入真空中膨胀后产生。光束直接进入表 面，散射光束的检测和传播方向有关，由于它们的低动能，光束中的氮原子在顶 端样品层原子表面几埃处被反射，导致了该方法的绝对表面灵敏度。通过散射光 束的能量分析能够得到在高精确度的表面低能振动和散射之间的关系【2 4 2 冽，该 方法在许多方面和本体中的中子散射很相似。 图7 ，热氮原子散射( 左) 和和频产生示意图( 右) 图8 和频产生光谱装置图 酬文 绪论 界面过程经常发生在稠密的气体或者液体表面，界面信号被淹没在来源于我 们所感兴趣的界面以上和界面以下的强烈的本体信号。二次谐波产生( s e c o n d h a r m o n i cg e n e r a t i o n ) 以及和频产生( s u m f r e q u c n c yg e n e r a t i o n ) 是新的非线性光学 技术( n o n l i n e a ro p t i c a lt e c h n i q u e ) 1 2 4 5 , 2 4 6 , w 4 。方法的优点是能够高度专一性的获得 各种界面的光谱信息而不受本体相的光谱信息干扰。 5 后向散射应用于散射系数的测定 o i s h i l 2 4 7 首先研究了海水的后向散射系数和在1 2 0 度后向角之问的特殊关 系，他们基于米氏散射计算了海水中颗粒物质的体积散射函数( v o l u m es c a t t e r i n g f u n c t i o n ，v s f ) 以前的人们对于v s f 的计算，认为在1 2 0 度的测量数