（化学工艺专业论文）二氨基型荧光剂的合成及性质研究.pdf

摘要 摘要 本论文概述了荧光现象、荧光分析的发展进程、荧光分析的原理和荧光分析的应用。 论文还详细介绍了荧光化合物的合成及性质研究，以及二氨基型荧光剂的合成及性质研 究。 本论文主要研究了二氨基型荧光剂的合成。本论文以4 一乙酰氨基苯甲醛为起始原 料，通过硝化反应，合成了4 一乙酰氨基- 3 - l i f t 基苯甲醛，然后由4 一乙酰氨基- 3 - ：i i f i 基苯 甲醛和2 一萘酚一步缩合反应得到了1 4 一( 4 一乙酰氨基一3 一硝基苯基) 一1 4 一俨二苯并 a ，胡 氧杂葸，再水解生成1 4 - ( 4 - 氨基一3 一硝基苯基) 一1 4 一伊二苯并 a ，胡氧杂蒽，最后通过 硝基的还原反应得n - 氨基型荧光剂，即1 4 一( 3 ，4 一二氨基苯基) 一1 4 一伊二苯并 a ，胡 氧杂葸。用红外光谱对产品进行了表征，初步推断了产品的结构。 本论文也研究了二氨基型罗丹明的合成。将4 一乙酰氨基一3 - ；f f j 基苯甲醛和3 一二乙 基氨基苯酚进行了一步缩合反应，得到了罗丹明衍生物，并用红外光谱进行了表征。 本论文还研究了二氨基酰亚胺型卟啉化合物的合成。本论文以5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 一四苯 基卟啉( t p p ) 为原料，三氟乙酸为溶剂，亚硝酸钠为硝化试剂进行硝化反应，得到5 一 ( 4 一硝基苯基) - 1 0 ，1 5 ，2 0 - 三苯基卟啉( 即单硝基苯基卟啉t p p n l ) ；将t p p n l 进行 还原反应得到5 一( 4 一氨基苯基) - 1 0 ，1 5 ，2 0 - 三苯基卟啉( 即单氨基苯基卟啉t p p n h 2 ) ； 以d m f 为溶剂，在氮气保护下，使t p p n h 2 分别与邻苯二甲酸酐和4 一乙酰氨基一5 一硝 基邻苯二甲酸酐反应，得到了两种新型的酰亚胺型卟啉化合物。用紫外可见光谱、红外 光谱、核磁共振氢谱和质谱对产品进行了鉴定和表征，确定了产品的结构。 关键词：荧光，荧光探针，二氨基型荧光剂，二氨基型罗丹明，酰亚胺型卟啉 a b s t r a c t a b s t r a c t t h es y n t h e s i sa n da p p l i c a t i o no ff l u o r e s c e i n sa n dd i a m i n o f l u o r e s c e i n sw a si n t r o d u c e d i nt h i st h e s i s t h e s y n t h e s i s o ft h ed i a m i n o f l u o r e s c e i nw a sm a i n l yr e p o r t e d i nt h i st h e s i s 4 - a c e t a m i d o 3 - n i t r o b e n z a l d e h y d e ( i i ) w a ss y n t h e s i z e df r o m4 - a c e t a m i d o b e n z a l d e h y d e ( i ) b y n i t r a t i o n 1 4 一( 4 a c e t a m i d o 3 - n i t r o p h e n y l ) 一1 4 一h - d i b e n z o a , l x a n t h e n e s ( i i i ) w a ss y n t h e s i z e d f r o mi ia n d2 - n a p h t h o li nt h ep r e s e n c eo f1 , 2 一d i c h l o r o e t h a n ew i t hp - t s aa sc a t a l y s t 1 4 ( 4 a m i n o 3 n i t r o p h e n y l ) 1 4 h - d i b e n z o a , x a n t h e n e ( i v ) w a ss y n t h e s i z e df r o mi i ib y h y d r o l y s i s t h et e r m i n a lp r o d u c t14 ( 3 ，4 一d i a m i n o p h e n y l ) 一14 - h - d i b e n z o a g x a n t h e n e s ( v ) w a s s y n t h e s i z e db yr e d u c t i o no f i nt h ep r e s e n c eo fs n c l z - 2 h 2 0 a l lt h ep r o d u c t s w e r e c h a r a c t e r i z e db yi r t h es y n t h e s i so ft h ed i a m i n o r h o d a m i n ew a sa l s os t u d i e di nt h ep a p e r t h er h o d a m i n e d e f t v a t i v ew a ss y n t h e s i z e df r o mi ia n d3 - d i e t h y l a m i n o p h e n o lb yo n e s t e pc o n d e n s a t i o n t h e c o m p o u n dw a sc h a r a c t e r i z e db yi r i na d d i t i o n ，t h es y n t h e s i so ft h ed i a m i n o i m i d ep o r p h y r i nc o m p o u n d sw e r es t u d i e d f i r s t l y ，5 - ( 4 n i t r o p h e n y l ) 1 0 ，15 ，2 0 一t r i p h e n y l p o r p h y r i n ( t p p n l ) w e r es y n t h e s i z e d f r o mt p p b y d i r e c tn i t r a t i o ni nt h ep r e s e n c eo ft f a a n ds o d i u mn i t r i t e t h e5 一( 4 一a m i n o p h e n y l ) 一10 ，15 ，2 0 一t r 。 i p h e n y l p o r p h y r i n ( t p p - n h z ) w a ss y n t h e s i z e db y r e d u c t i o no ft p p n t t h et w on o v e l i m i d e p o r p h y r i n sw e r es y n t h e s i z e df r o mt p p - n h 2a n dp h t h a l i ca n h y d r i d e ，a n d f r o m4 一 a c e t a m i d e 5 n i t r o p h t h a l i ca n h y d r i d ei nd m f s o l v e n tu n d e rt h en i t r o g e n t h e i rs t r u c t u r e s w e r ec h a r a c t e r i z e da n dc o n f i r m e db yu v - v i s ，i r ，1hn m r a n dm s k e y w o r d s ：f iu o r e s c e n c e 。fiu o r e s c e n c ep r o b e ，dia m in o riu o r e s c ein ， dia m in o r h o d a m ir e i m id e p o r p h y rin i i 关于硕士学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规 定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 舀) ，保密期至年月日为止： 学生签名：丝型垒导师签名： 护妒妒f 坷 第一章绪论 1 1 荧光现象 第一章绪论弟一早珀t 匕 荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波 长的入射光( 通常是紫外线或x 射线) 照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发 并发出比入射光的的波长长的出射光( 通常波长在可见光波段) ；而且一旦停止入射光， 发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 原子和分子发射的荧光是激发态电子跃迁到基态过程中所伴随的一种发光现象。荧 光可以在许多物质，如矿物、油、植物、食物、染料、玻璃、天然与人工晶体以及许多 有机、无机化合物中观察到。此种性质已被用来鉴定各种物质，称为荧光光谱学n ，。 1 2 荧光分析的历史和发展n 吨3 早在1 5 7 5 年，就有人在阳光下观察到菲律宾紫檀木切片的黄色水溶液呈现极为可 爱的天蓝色。1 8 5 2 年，s t o k e s 用分光计观察奎宁和叶绿素溶液时，发现它们所发出的光 的波长比入射光的波长要长，由此断定这种现象是由于这些物质吸收了光能并重新发出 不同波长的光线，而不是由于光的散射作用引起的。根据矿物“萤石”能发出这种光， s t o k e s 将这种光称为“荧光”。此外，s t o k e s 还对物质的荧光强度和浓度间的关系进行 了研究。从1 8 6 7 年，g o p p e t s r o d e r 采用桑色素为荧光试剂检测铝。到2 0 世纪初，人们 已经知道包括荧光素、稠环芳烃及曙红等在内的6 0 0 余种化合物有荧光。1 9 2 4 年， w a w w i l l o u s 进行了荧光效率的测定。1 9 2 6 年，g a v i l a 对荧光寿命进行了测定。2 0 世纪 5 0 年代前使用滤片式荧光计，只能测量荧光的总光度值。1 9 5 5 年，制成第一台荧光光 度计。2 0 世纪6 0 年代开始了真实荧光光谱、荧光效率和荧光寿命的测量。2 0 世纪7 0 年代引进了计算机技术、电视技术、激光技术、显微镜技术。8 0 年代，荧光分光光度计 大多配有微型计算机数据处理器，能对荧光光度值进行积分、微分、除法、减法和平均 等运算。 常规的荧光分析方法由于受到拉曼峰和散射光的背景干扰，影响到检测的灵敏度和 选择性。因此，荧光光谱分析的新技术新方法应运而生，诸如新型荧光剂的合成、稀土 第一章绪论 荧光探针法、激光荧光法、导数荧光法、光化学荧光法、时间分辨荧光法、全反射三维 荧光光谱法、偏振荧光光谱法、荧光免疫测定法、荧光反应速率法、荧光光纤传感器、 能量转移荧光分析、分子有序组合体微环境荧光分析等。这些方法和技术的应用加速了 各种新型荧光分析仪器的研制，使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发 展，极大地提高了荧光分析的灵敏度、选择性和特异性，应用范围也不断扩大。 1 3 荧光分析的原理n 吧3 1 。3 1 分子结构与荧光 化合物能够产生荧光的最基本的条件是它发生多重性不变的跃迁时所吸收的能量 小于断裂最弱的化学键所需要的能量；其次，在化合物的结构中必须有荧光基团如 = c = o 、n = o 、n = n 、= c = n 、= c = s 等。当这些基团是分子的共轭体系的一部分时，则 该化合物可能产生荧光。产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激 发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光量子 产率。荧光量子产率( 亦称荧光效率) 被定义为荧光发射量子数与被物质吸收的光子数 之比，也可表示为荧光发射强度与被吸收的光强之比。 大量事实表明，有机荧光试剂分子都含有发射荧光的基团，习惯称为荧光团。荧光 团必须含有共轭大冗键结构。共轭7 1 ；键达到一定程度才会发射出荧光，如苯，萘，苯并杂 环等，当然也与分子结构的其他因素有关。共轭体系越大，兀电子越容易激发，荧光越 易产生，荧光发射峰越向长波移动，多数情况下荧光量子产率增加。荧光强度大的有机 化合物绝大多数含有芳香环或芳香杂环，芳香环数越多，共轭体系越大，荧光越强。 西川泰治等口1 指出：具有刚性平面性结构才显示出荧光特性。对于具有强荧光的有 机化合物和荧光试剂，仅有大的共轭体系还不够，分子的共轭体系必须具备共平面的特 性并且还要具有一定程度的刚性。 1 3 2 荧光光谱和荧光激发光谱 使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过发射单色器照射 于检测器上，调节发射单色器至各种不同波长处，由检测器测出相应的荧光强度，然后 以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称为荧光发射光 2 第一章绪论 谱。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射 到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，所绘制的图即为荧光激 发光谱，又称激发光谱。 斯托克斯位移( s t o k e ss h i f t ) ：与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的 波长处。这是由于荧光总是从最低激发单线态回到基态时所发射的辐射，而激发过程有 可能将分子激发到高的振动能级或更高的电子能级上去。振动、热辐射等使分子失去能 量。即激发与发射荧光间的能量损失是斯托克斯位移产生的主要原因。其他如溶剂效应、 激发态分子的反应也会引起斯托克斯位移。 紫外一可见光区荧光的产生，是由第一电子激发态最低振动能级跃迁至电子基态的 各个不同振动能级所致，而与荧光物质分子被激发至哪个能级无关。因此，荧光光谱的 形状与激发光的波长无关。 物质的吸收光谱的第一吸收带的形状，决定于第一激发态的各个振动能级的分布情 况。跃迁的两个能级之间的差距越大，吸收峰波长越短。荧光光谱的形状决定于电子基 态振动能级的分布情况。电子基态的振动能级越高，两个能级之问的差距越小，则荧光 峰的波长越长。电子基态和第一电子激发态中能级的分布情况是类似的，所以荧光光谱 和吸收光谱的形状相似但却呈镜像对称关系。 1 3 3 溶液的荧光强度 溶液的荧光强度与该溶液的吸光强度及荧光物质的荧光效率有关。对于某一荧光物 质的稀溶液而言，每一平方厘米的截面上的荧光强度f 可用下式表示： f = 2 3 l o e c l 式中为荧光物质的荧光效率；i o 为每秒钟每平方厘米上入射光的强度；为荧光 物质的摩尔吸光系数；c 为荧光物质的浓度；l 为样品池的厚度。由上式可见，在入射光 强度与样品池厚度不变的条件下，某一荧光物质的稀溶液( e c l _ 0 0 5 ) 的荧光强度与该 物质的浓度成正比。 溶液的荧光强度还受到溶剂、溶液温度和p h 值的影响。溶液的荧光强度还会因荧 光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而降低，这种现象称为荧光猝灭。 1 4 荧光分析的应用“1 3 第一章绪论 1 4 1 无机化合物的定量分析 在紫外线照射下能发生荧光的无机物很少，但许多元素与有机试剂组成的络合物， 在紫外线照射下能发生荧光，由其荧光强度和标准曲线可测定该元素的含量。至于非金 属元素( 如氟、氯、溴、碘、硫等) 或过渡金属元素( 如铜、铁、钴、镍、汞等) 则可 用荧光猝灭法进行测定。 荧光分析法的灵敏度很高，一般为l ，较紫外一可见分光光度法高两、三个数量 级，与原子吸收光谱法相近。如采用激光时问分辨荧光法，灵敏度还可大大提高。例如： 测定海水中铀的检出限可达0 0 4 p g l ，测定铕的检出限可达2 p l 。 1 4 2 有机化合物的定量分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，易于吸光，其中庞大而结构复杂的化合物 在紫外线照射下都能发生荧光。如采用溶剂萃取、色谱法、电泳等方法预先加以分离而 后进行荧光分析，常可测定它们在试样中的低微含量。荧光分析与高效液相色谱法密切 结合，己成为该法的检测工具。 1 4 3 定性分析 荧光激发光谱和荧光光谱可作为定性分析的一种手段，用以鉴定有机络合物。根据 试样的图谱和峰波长与已知样品进行比较，可以鉴别试样和标准试样是否同一物质。对 于复杂混合物中的同分异构体，室温荧光光谱的波带太宽，难于鉴别，但如果冷却至7 7 k 的低温，可获得高分辨率的荧光光谱，足以检测复杂混合物中的个别分子。此法曾用于 原油中各种三环杂氮化合物的鉴别。近年来还采用同步扫描荧光法及1 - - 4 级的导数荧 光光谱来鉴别多组分荧光物质。 1 4 4 芳基的鉴定 光离解反应常生成自由基，但自由基存在的时间很短，难于鉴定。随着激光荧光法 的发展，建立起皮秒脉冲激光荧光法，可用于卤素芳族化合物的光离解反应的研究并用 以鉴别所生成的自由基。在某一波长的皮秒激光脉冲的激光诱导下，卤素芳族化合物发 生光离解反应，c - x 键分裂而生成自由基，用较第一种激光脉冲延迟数十皮秒的另一 波长的皮秒激光脉冲进行激发，并绘制荧光光谱，可以对这些自由基进行鉴定。 4 第一章绪论 1 5 荧光化合物的合成及性质研究 j a m e s 等n3 介绍了以氟化硼作为缩合试剂来制备荧光素和酚酞的方法，其优点是反 应温度较低，反应时间较短。荧光素的制备方法是：以苯( 1 0 0 9 ) 为反应溶剂，将邻苯 二甲酸酐( 6 0 9 ) 、间苯二酚( 5 0 9 ) 和氟化硼( 8 9 ) 的混合物加热回流3 h 。这样可得到 不溶于苯的红色固体。除去苯，用常规方法即可提纯该固体。其二乙酸酯衍生物的熔程 为2 0 3 2 0 5 。酚酞的制备方法是：除了不使用苯之外，其他的制备步骤与荧光素的制 备步骤类似，即：将邻苯二甲酸酐( 0 7 5 m 0 1 ) 、苯酚( 1 5 m 0 1 ) 和氟化硼( 5 0 9 ) 的混 合物小心加热1 h 。反应之后分离得到粗酚酞，产率为7 2 。 荧光素与酚酞的结构不同，表现出的荧光性质有明显差异。在结构上荧光素比酚酞 多一个氧桥( 一o 一) ，荧光素在碱性溶液中荧光很强，而酚酞在碱性中呈红色无荧光， 这是由于前者因氧桥把两个苯环固定在一个平面上具有刚性共平面的缘故。荧光素衍生 物常作为生物及医学研究中的分子探针，就是基于这类分子的荧光团有很强的荧光发射 能力和其发光特性随环境变化的特点。荧光素结构具有内酯、两性离子、醌式、单阴离 子和双阴离子五种形式，内酯无色，两性离子形式黄色，醌式双阴离子呈红色，它的各 种形式的平衡状态、离解及荧光和吸收光谱性能均被详细研究悔。1 。 梅明华等n 纠合成了三种含萘但链长不同的多胺类化合物，研究了它们在不同p h 条 件下的荧光光谱，发现它们的荧光强度与p h 值间有着强烈的依赖关系，因此这类化合 物可用作测定溶液p h 值的荧光探针。他们在所合成的化合物溶液中分别引入了不同的 核苷磷酸盐( a t p 、a d p 、a m p ) ，发现：所研究的化合物如n 一( 2 一氨乙基) 一n7 一 2 一 ( 1 一萘甲基) 氨乙基 ) 乙二胺，其荧光可被不同的核苷磷酸盐所猝灭，以 s t e m v o l m e r 常数( k s v ) 或猝灭常数( k o ) 作为评估猝灭能力的标准表明，分子尺寸 的匹配和化合物中基团的空间的合理排布是化合物和核苷磷酸盐间能发生相互作用的 重要根据，而猝灭强烈地依赖于这类化合物间的相互作用。因此可利用化合物荧光强度 的改变来识别各种不同的核苷磷酸盐。这为设计新型的荧光化学敏感器提供了一种可行 的思路。 c 6 0 是一种很好的电子受体。c 6 0 与电子转移现象相关的最显著的性质之一是：它能 够有效地引导迅速的电荷分离和进一步缓慢地电荷重新结合。在c 6 0 一电子供体二价物 中，供体卟啉和c 6 0 组成的体系最为著名，被广泛应用。f l ( 荧光素) 具有两个活性基 团：羟基和羧基，可以将f l 和不同的电子供体和受体相连接。因此，f l 经常作为电子 供体或受体，以及人工光合成模型中的敏化剂。基于上述原因，f l c 6 0 体系可能是人 5 第一章绪论 工光合成研究的很好的模型。为了探究这种可能性，j i n gb i n g w e n 等n 3 1 合成了两种新型 的f l c 6 0 二价物( 如图1 1 所示) ，并且两种二价物的荧光猝灭表明：发生了从f l 到c 6 0 的分子内的光引导电子转移( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，缩写为p e t ) 过程。 “o n o f f 试剂，是一种本身没有荧光性，但与被分析物反应后可生成荧光性复合 物或衍生物的荧光性试剂。在这些试剂中，有一种利用光引导电子转移机制起作用的试 剂，通常被称为“p e t 试剂”，譬如：d a f 2 是一种用于测定n o 含量的二氨基型荧光 剂，其已广泛用于痕量分析。p e t 试剂的分子由荧光团和反应性基团组成，它们分别为 电子供体和受体。m a k io n o d a 等n 邮研究了具有电子供体和受体的苯并呋咱复合物中，空 间位移对荧光量子产率的影响。他们研究发现：减小空间位移，由p e t 过程引起的分子 内猝灭的数值就会增加；抑制p e t 过程，例如乙酰化，荧光就会恢复，而与空间位移无 关。这一结论也适用于具有其它类型的接受电子的荧光团的复合物。因此，对于有用的 荧光性“o n o f f ”p e t 试剂，用较短的空间位移将供体和受体连接以获得荧光量子产率 上较大的不同( 即本身无荧光性或弱荧光性，而与被分析物反应之后荧光性就很强) ， 这一点是非常必要的。 m e 图1 - 1 两种新型的荧光素一c 二价物 f i g 1 一lt w on o v e lf l c 6 0d y a d s h 2 c h 2 0 在荧光测定中，荧光素是应用最为普遍的染料之一n 引。它具有很高的荧光量子产率 和一定的水溶性。通过邻苯二甲酸酐和问苯二酚的一步缩合反应，可以较容易得到荧光 素。功能化的荧光素可以由取代的邻苯二甲酸酐和问苯二酚一步缩合反应得到，但是形 成的是两种区域同分异构体的混合物( 如图1 2 所示) 。在某些情况下，如果x 取代位 是极性基团例如羧基或硝基，那可通过分级结晶将两种同分异构体的混合物分离6 1 引； 6 第一章绪论 但是，如果x 取代位是极性较小的基团，那么两种区域同分异构体的分离将十分困难。 j i a og u a n s h e n g 等叫介绍了有区域同分异构体的纯的5 一和6 一溴荧光素以及5 一和6 一 碘荧光素的合成方法。他们以4 一溴邻苯二甲酸酐和间苯二酚为主要原料，合成出纯的 5 一溴荧光素二乙酸酯( 如图l 一3 所示) ；以4 一溴邻苯二甲酸酐和l ，6 一萘二酚为主 要原料，合成出纯的5 一溴萘并荧光素二乙酸酯( 如图l 一4 所示) ；以4 一碘一2 一硫代 苯甲酸酐和问苯二酚为主要原料，合成出纯的5 一碘硫代荧光素( 如图l 一5 所示) ：以 4 一碘一2 一硫代苯甲酸酐和2 ，4 一二羟基氯苯为主要原料，合成出27 ，77 一二氯一5 一碘硫代荧光素( 如图1 6 所示) 。其中，硫代荧光素因含有磺基而具有较好的水溶性， 所以最具有应用价值。 b h oo h h o + + h h h e a tt oc a 2 0 0 - - - - - - - - - o f8 5 。cw i t hc h 3 s 0 3 h 图1 - 2 区域同分异构体的合成 f i g 1 - 2s y n t h e s i so fr e g i o i s o m e r s a c ，o2 3 t i m e s h 。 a c 图卜35 一溴荧光素二乙酸酯的合成 f i g 1 - 3s y n t h e s i so f5 一b r o m o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e 7 a c 爨0一p 第一章绪论 b + o ( 1 ) 2 0 0 。c ，1 2 h ( 2 ) a c 2 0 ，r e f l u x ，2 h ( 3 ) r e c r y s t a l l i z ef r o m h a c , 2 02 - 3 t i m e s a 图1 - 45 一溴萘并荧光素二乙酸酯的合成 f i g 1 4s y n t h e s i so f5 一b r o m o n a p h t h o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e + + c l h 图1 - 55 一碘硫代荧光素的合成 f i g 1 5s y n t h e s i so f5 - i o d o s u l f o f l u o r e s c e i n ! 1 2 竺型! ! 竺2 旦：! ! 竺：! ! k ( 2 ) p r e c i p i t a t eb ya d d i n g hc o n t r o l l e dv o l u m eo fh 2 0 图1 - 627 ，77 一二氯一5 一碘硫代荧光素的合成 f i g 1 6s y n t h e s i so f2 7 - d i c h i o r o 一5 一i o d o s u l f o f l u o r e s c e i n a c 文献报道的合成纯溴代罗丹明衍生物的方法需要长时间的高温反应，这往往产生复 杂的混合物业0 | 。j i a og u a n s h e n g 等心门报道了一种清洁、微波辅助昭2 2 硝的方法，合成出了 无同分异构体的纯4 一溴代罗丹明衍生物( 如图1 7 所示) 。与这类化合物典型的热合 成方法相比较，他们将“1 5 0 微波辐射l o m i n ”设定为标准。微波加热后，把四氯苯 醌加入到反应体系中，然后在2 5 。c 下将混合物搅拌至少1 0 m i n ，以确保中间的缩合反应 产物完全氧化。总之，采用微波加热的方法合成类似的化合物比如荧光素和吨染料( 以 氧杂葸为基体的染料) 具有很大的应用可能性。 8 尘岛 旦尝鉴时哪器器 第一章绪论 r 2 n o h + ( 1 ) h e a t ( 2 ) o x i d i z e 图卜7 纯4 一溴代罗丹明衍生物 f i g 1 - 7p u r e4 - b r o m o r h o d a m i n ed e r i v a t i v e r 2 诸如荧光素和罗月明的氧杂葸染料，由于它们的高灵敏性，高量子产率，低能量激 发和发射波长以及生物的混溶性，而被广泛应用于敏感探测方面。一个典型的例子是， 利用1 ，2 ，4 一苯三羧酸酐与取代的间苯二酚( 或3 一氨基苯酚) 的缩合反应来制备荧 光素和罗丹明染料8 别。然而，这种方法的缺点是形成两种区域同分异构体的混合物， 它们的分离很困难。纯的区域同分异构体荧光探针广泛应用于生物领域，例如：标记生 物分子，d n a 测序，定位活细胞中的蛋白质，探测蛋白质中特殊的功能化基团以及测 定细胞内的离子浓度等阻引。纯的区域同分异构体比对应的其同分异构体混合物具有更好 的可重现性。w a n gz h i q i a n g 等比别在温和的酸性条件下，通过一步缩合反应，得到了五 种新型的活性5 一羧基一磺基罗丹明，在标记蛋白质方面，这些活性荧光染料优于已知 的荧光性罗丹明染料。他们预想：将缩合反应中的缩合作用和氧化作用结合为一步反应 来完成。为此，他们借鉴了文献报道比0 1 的三氟乙酸( t f a ) 在n ，n 一二甲基甲酰胺( d m f ) 中应用的方法，即缩合作用和氧化作用在温和的酸性条件下( v t f a ：v d m f = 1 ：1 0 ) 进 行。氧化作用在大气中即可进行，不需要再加入其它的氧化剂。他们还研究发现，在一 步缩合反应中，没有生成其它的荧光化合物。以3 一二甲基氨基苯酚为例( 如图1 8 所示) ，具体方法为：将4 一羧基2 一磺基苯甲醛( 2 5 0 m g ；l m m 0 1 ) 和3 一二甲基氨基 苯酚( 2 4 m m 0 1 ) 溶解在1 0 m ld m f 和l m lt f a 的混合溶剂中。在大气环境下，将反 应混合物在8 0 。c 搅拌1 2 h 。待反应混合物冷却后，将其倒入2 0 0 m l 乙醚中，收集沉淀， 并用柱层析分离纯化，用三氯甲烷和甲醇的混合溶剂进行洗脱，配比从1 0 ：1 到3 ：l 。 他们将合成的新型活性染料应用于标记生物分子中，如：标记抗生物素蛋白。在弱碱性 ( p h = 8 5 ) 溶液中，这些染料的琥珀酰亚胺基酯与抗生蛋白链菌素反应可得到对应的 荧光共轭物。这些染料的荧光共轭物的荧光强度高于已知荧光染料共轭物，其中有两种 荧光共轭物适合作为商用t a m r a 和t e x a sr e d ( t a m r a 和t e x a sr e d 是两种著名的荧 9 第一章绪论 光标记染料) 抗生蛋白链菌素共轭物的替代品。总之，这些5 一羧基一磺基罗丹明作为 纯的区域同分异构体荧光标记试剂，可广泛应用于生物领域和细胞测定中。 h o h ， 图1 - 85 一羧基一磺基罗丹明 f i g 1 85 - c a r b o x y - s u l f o r h o d a m i n e f 如 n c h 3 通过功能化可将功能基连接到荧光素和罗丹明这类氧杂葸荧光团的苯甲酸环上。上 文中已提到，用适量的间苯二酚或者3 一氨基苯酚与邻苯二甲酸酐进行酸催化缩合是制 备荧光素和罗丹明的典型方法。这个反应得到的产品是两种同分异构体的均等混合物， 这两种同分异构体分别是在苯甲酸环上的5 一和6 一上发生取代反应而得到的。对于荧 光素的羧酸衍生物，其同分异构体混合物的结晶分离方法已有文献报道吼1 8 1 。c a r o l y n 等瞳6 1 介绍了纯的羧基和磺基取代的氧杂蒽荧光团同分异构体的合成及分离方法。他们用 磺化的间苯二酚和邻苯二甲酸酐反应生成荧光素( 如图1 9 所示) ，用间苯二酚和4 一 磺基邻苯二甲酸发生缩合反应生成荧光素一5 ( 6 ) 一磺酸的摩尔比1 ：1 的同分异构体的混 合物( 如图1 1 0 ) ，并介绍了分离方法。他们通过对荧光素一6 一磺酸进行x 射线衍射结 构测定，确认了它的结构排列方式。被分离的同分异构体在草酰氯活化下变成荧光黄磺 酰氯，而二氯亚砜使酚式羟基转化成氯原子。他们发现：二卤荧光素可以通过3 一卤苯酚 和邻苯二甲酸酐( 或其类似物) 在酸催化下缩合而成，并且在路易斯酸或钯催化下与简 单的胺类反应而转化成罗丹明：在适当的条件下37 ，67 一二卤荧光素与胺类缩合可以 产生纯的罗丹明缩化物同分异构体的混合物；它们都可以通过分级结晶而分离。这种工 艺可以应用于纯净的羧基取代的罗丹明的同分异构体的合成路线中。他们采用反应性强 的二溴荧光素作为一种较不稳定的可利用的二溴荧光素缩化物的模型，该二溴荧光素可 以通过3 一溴苯酚和邻苯二甲酸酐酸催化缩合而成( 如图1 一1 1 ) 。他们采用类似的方法 合成出了3 ，67 一二溴一5 ( 6 ) 一羧化物( 如图1 1 2 ) ，在吡啶和乙酸酐中选择性 的结晶将析出纯的6 一同分异构体吡啶筠盐，产率1 5 ；将母液进一步重结晶又会析出 1 0 第一章绪论 纯的5 一同分异构体，产率1 1 。 b h h + z n c l ， - - - - - - - - 二= - - 1 9 0 h 图1 - 94 一磺基间苯二酚和邻苯二甲酸酐的反应 f i g 1 - 9r e a c t i o no f 4 - s u l f o r e s o r c i n o lw i t hp h t h a l i ca n h y d r i d e b + h h 0 3 o o h o o h 图1 - 1 0 问苯二酚和4 一磺基邻苯二甲酸的反应 f i g 1 10r e a c t i o no fr e s o r c i n o lw i t h4 - s u l f o p h t h a l i ca c i d ro h 图 f i g 1 1 1r r o h + 图1 - 1 23 ，6 一二溴一5 ( 6 ) 一羧化物的合成 f i g 1 1 2s y n t h e s i so f 3 67 一d i b r o m o 一5 ( 6 ) 一c a r b o x y l a t e s b r 关于合成氧杂蒽和苯并氧杂葸的方法文献报道很多，比如：氨基甲酸酯的环酰化反 第一章绪论 应1 ，2 一羟基芳香醛和2 一四氢萘酮之间的环缩合反应例，以及苯甲醛和乙酰苯分子内 的苯基一羰基的偶合反应例等等。然而这些方法存在着诸多问题，譬如：产率低，缺乏 实用性，反应时间较长( 1 6 小时至5 天) ，需要使用有毒的有机溶剂，需要加入过量的 催化剂，需要使用特殊的仪器设备以及苛刻的反应条件等等。k h o s r o p o u r a r 等啪1 报道 了一种高效、快捷和操作简单的方法( 图1 - 1 3 ) ：以p - t s a 作为催化剂，分别采用了 两种反应条件( 一种使用溶剂，一种不使用溶剂) ，通过一步缩合反应将2 一萘酚和烷基 醛( 或芳香醛) 合成为1 4 一烷基或芳基一1 4 一一二苯并 a 胡氧杂葸。他们发现：在 2m 0 1 的p - t s a 催化剂存在下，将醛( 1 0 m m 0 1 ) 和2 一萘酚( 2 o m m 0 1 ) 在1 2 5 下加 热，6 分钟内即有产物苯并氧杂蒽生成( 图1 - 1 3 ，方法b ) 。该反应操作简单，无需有 毒溶剂或惰性气体保护。不过，如果不使用催化剂的话，该反应则不能进行。方法b 除了高效和操作简单之外，还给我们介绍了一种快速、绿色和低成本的合成同类化合物 的操作方法。方法a 为本论文中合成苯并氧杂葸型荧光剂提供了文献依据。 r c h o + 2 h 旦：! 坠 c i c h 2 c h 2 c i o r n e a tc o n d i t i o n s 方法a ：在1 0 t 0 0 1 的对甲苯磺酸存在下，1 ，2 一二氯乙烷作溶剂，回流条件下进行反应 方法b ：在2 1 的对甲苯磺酸存在下，无需溶剂，1 2 5 下进行反应 图1 - 1 3 苯并氧杂蒽的合成 f i g 1 - 1 3s y n t h e s i so f b e n z o x a n t h e n e s 1 6 二氨基型荧光剂的合成及性质研究 近年来，荧光的微观显像作为在活细胞中探测生物分子的方法得到迅速发展卜蚓。 荧光探针是生物显像的必要工具，具有高灵敏度、实时侦测和操作简便的特点。荧光探 针按物质种类可分为有机荧光探针即分子荧光探针和离子荧光探针。它们因具有特殊的 光物理性质、不同的荧光量子产率和荧光寿命等而被用来探测生物分子。迄今为止，人 们已经研究发展了大量的侦测生物分子的荧光探针，但是大部分都不是靠理论而是由经 验获得的。现在已经发现的荧光素衍生物的的荧光性质可以由分子内的光引导电子转移 1 2 第一章绪论 ( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，缩写为p e t ) 机制来控制，并且已经成功地根据p e t 机 理设计和合成出了新型的荧光探针。 以前人们只知道n o 是有害气体，其实，n o 作为一个胞内和胞外的生物信使分子 在人类生理上扮演着十分重要的角色。内源性的n o 产生于n o 合酶，这种酶可以将l 精氨酸和分子氧气转化成l 一瓜氨酸和n o n 引。医学和生物学的研究发现，n o 涉及到许 多生理功能，譬如：n o 与超氧负离子0 2 一结合生成o o n o 一，然后进入病变细胞分解出 高活性的自由基o h 、n 0 2 ，从而杀死病变细胞；心血管系统的血压，中央和周边神经系 统的神经传递和免疫抵御。诣。3 9 。1 9 9 8 年，美国的三位科学家( i g n a r r olj ，m u r a df 和 f u c h g o t trf ) 由于对“n o 作为心血管系统的信号分子 的出色研究成果，荣获1 9 9 8 年诺贝尔医学奖。还有许多疾病也与n o 的产生有关n 叫。例如，血管中n o 的不足容 易患上动脉硬化症，糖尿病，蜘蛛网膜下的出血，局部缺血和休克h “4 3 1 。另外，在受到冲 击期间，脑中过量的n o 容易引起神经伤害，往往还会引起神经衰弱和癫痫性的突然发 作h 引。因此，要想了解n o 在有机体处于健康态和病态机能中所起的作用，监测n o 的 产生就具有重要的意义。 然而，n o 的低浓度和易分解的性质使得它的直接测定非常困难。化学发光、电子 旋转中介现象( e l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e ，缩写为e p r ) 和电化学方法都可以用来直接测 定n o 。然而，当这些方法应用于复杂的动力学生物系统时，在操作步骤、测定的灵敏 度和选择性方面经常存在一些缺点。 因此，人们研究合成出一系列二氨基型荧光剂来测定n o 。最早的有2 ，3 一二氨基 萘( 2 ，3 - d i a m i n o n a p h t h a l e n e ，缩写为d a n ) ，基于：n o 被氧化为n 0 2 ，n 0 2 与n o 反 应生成的n 2 0 3 再与水作用生成n 0 2 和n 0 3 ，2 ，3 一二氨基萘与n o z - 反应生成萘三唑， 荧光增强，激发波长和发射波长分别为3 0 0 n m 和4 1 6 r i m ，检出限为i o nm o l l h 5 。 k o j i m ah 等n 刚研究了一系列用于测定n o 的二氨基型荧光剂d a f s ( 如图l 一1 4 所 示) 。它们本身不是荧光剂，但在氧气存在的情况下，通过与n o 进行反应，可转化为 高荧光性的三唑形式。在d a f s 中，4 ，5 一二氨基型荧光剂( d a f 2 ) 表现出对n o 的高 灵敏性和专一性。d a f 2 对n o 的检出限为5 nm o l l ( 反应式如图1 1 5 所示) ，与n o 反应后荧光量子产率增加了1 0 0 倍以上，因而被应用于活细胞中n o 的测定和显像。 d a f 2 很可能不与n o 直接反应，而是与n o 的氧化产物n 2 0 3 反应，生成了三唑型荧 光剂产物d a f 2 t 。在中性溶液中，d a f 一2 不与n o 的其它氧化形式反应，例如n 0 2 。 和n 0 3 ，也不与其他的反应性氧源反应，例如0 2 ，h 2 0 2 和o n 0 0 。，这表现出了对 n o 测定的专一性。他们将具有膜渗透性的d a f 2 二乙酸酯形式d a f 2d a 移入到 1 3 第一章绪论 经过活化的老鼠主动脉平滑的肌肉细胞中，在细胞内酯酶作用下，酯键被水解，产生 d a f 2 ，然后这种新型的荧光探针即可对n o 进行快速的生物显像。 h hh c h h d a f 6 图1 - 1 4 二氨基型荧光剂 f i g 1 - 14d i a m i n o f l u o r e s c e i n s n o ，0 2 o h h 图1 - 1 5d a f - 2 和n o 的反应 f i g 1 1 5r e a c t i o no f d a f 一2w i t hn o o h a c 一般认为，二氨基型荧光剂结构上可以分为二氨基部分( 反应部位) 和氧杂葸部分 ( 生色团) 。在有氧的条件下，芳族的连位二胺能够捕获n o 从而生成对应的三唑化合 物。由于光引导电子转移机制( p e t ) ，功能基团的电子供体能力的变化引起了荧光的转 移。k o j i m ah h 7 1 等认为：这种p e t 机制也可以应用于罗丹明生色团，将二氨基部分引入 到罗丹明上可能克服上述问题。以n ，n 一二乙基一3 一氨基苯酚和乙酰氨基一硝基邻苯 1 4 第一章绪论 二甲酸酐类化合物为原料，他们设计合成出二氨基型罗丹明( 如图卜1 6 ) ，用来测定n o 的含量。d a r - 1 和d a r 2 的合成产率分别为4 2 和7 7 。d a r m 的吸光率和荧光性 质与d a r 1 和d a r 2 几乎是一样的。d a r m 的对n o 的检出限为1 0 nm o l l ，它的灵 敏度是d a r 1 的1 4 倍。因为d a r m 具有长波激发，高的光稳定性，在p h4 以上不 依赖于p h 等特点，所以它是一种新型的n o 荧光探针。 e t 2 d a r - 2 图1 - 1 6 二氨基型罗丹明( d a r s ) f i g 1 - 16d i a m i n o r h o d a m i n e s ( d a r s ) + e t 2 y ex i a o y i n g 等h 踟介绍了一种可以消除脱氢抗坏血酸( d h a ) 和抗坏血酸( a a ) 干 扰d a f 2 对n o 测量影响的新方法。这种影响：当在干冰上被冷冻时，初始溶液中的 n o 仍然能扩散并能够与相接触的d a f 2 冷冻块反应，但混杂的化合物譬如d h a 却不 能。他们将微升量的含有n o 的溶液冷冻块和d a f 。2 的溶液冷冻块相互接触3 0 分钟， 结果n o 与d a f 2 反应形成荧光产物d a f 2 t 。他们对该产物进行了表征，使用荧光光 谱