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(应用化学专业论文)酶催化合成烷基糖苷和糖酯表面活性剂.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
山东轻工业学院硕f :学位论文 摘要 烷基糖苷和烷基糖酯属于多元醇型的非离子表面活性剂,可作为乳化剂、分 散剂、洗涤剂和皮肤营养清洁剂等,广泛应用于食品、化妆品、洗涤剂、医药、 纺织、印染、石油等工业领域,是新一代的“绿色产品。国内外有关专家称其 为世界级表面活性剂。 当前国内外大多采用化学方法反应合成烷基糖苷和糖酯。但化学方法多采用 酸作催化剂,合成反应在高温、高压下进行,条件较苛刻,产物颜色深,而且催 化反应选择性差,有很多的副产物生成,且三废多,环境污染大。 本课题采用a 一淀粉酶作催化剂,在淀粉水解过程中,脂肪醇作为糖配基与水 竞争反应合成烷基糖苷。研究了溶剂、反应温度、反应时间、反应物配比等条件 对转化率的影响。研究表明:温度在5 0 ,正己烷与水( v :v = 1 :1 ) 作溶剂,加入淀粉 质量与a 淀粉酶的比例为5 :2 ,l g 淀粉中加入5 i i l 】m o l 脂肪醇,反应6 8 , 时,转化率可 达到1 7 5 。经乙醚与正己烷( v :、,= 1 :1 ) 萃取和减压蒸馏进行提纯。性能测试表明其 泡沫细腻,具有稳泡作用。 采用n o v o z y m e4 3 5 脂肪酶在有机相中催化脂肪酸与葡萄糖反应合成糖酯。通 过变化不同的反应条件,对转化率的影响进行了研究。研究表明:温度在4 0 , 正己烷与水( v :v = 2 :1 ) 作溶剂,每l m l 水中脂肪酶含量为0 0 4 9 ,酸糖摩尔比为2 :1 时, 反应6 d , 时,糖酯转化率可达到9 1 以上。性能测试实验表明:本产品泡沫丰富, 且乳化性能较好。 本课题采用酶作催化剂,减少了废水废气废酸的排放,对环境友好;反应条 件温和,节约了能源,并且减少了产品中的无机盐杂质。产物单一,使得产品质 量和生产效率得到了很大提高。 关键词:0 【淀粉酶;脂肪酶;烷基糖苷:糖酯 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t a san e wg r e e np r o d u c t i o n ,a l k y l g l y c o s i d ea n da l k y ls u g a re s t e r ,t w oo ft h e n o n i o n i cs u r f a c t a n t ,w e r ec o m m o n l yu s e da se m u l s i f i e r , d i s p e r s a n t ,w a s h ,s k i nn u t r i t i o n c l e a n s e r , a n ds oo n ;w h i c hw e r ew i d e l ya p p l i e di ni n d u s t r ys u c ha sg r o c e r y , c o s m e t i c , w a s h ,m e d i c i n e ,s p i n ,p r i n t i n ga n dd y e i n g ,o i le t c m a n ye x p e r t sc a l l e di tw o r l d c l a s s s u r f a c t a n t t h ec u r r e n t s y n t h e s i sm e t h o d s o fa l k y l - g l y c o s i d ea n da l k y l - s u g a re s t e ra r e p r i m a r i l y c h e m i c a lm e t h o d sw h i c hu s i n ga c i da sc a t a l y z e ra n dw o u l dc a u s e e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n t h e s es y n t h e s i sm e t h o d sw e r ep r o c e e d e da tr i g o rc o n d i t i o n s s u c ha sh i g ht e m p e r a t u r ea n dh i g hp r e s s u r e ,w i t hs a t u r a t e dp r o d u c t s ,l o ws e l e c t i v i t ya n d p l e n t yo fo u t g r o w t h s t h i st h e s i sf o c u s e so ns y n t h e s i z i n go fa l k y l - g l y c o s i d eb y0 【- a m y l a s e i nt h e d e g r a d a t i o no fs t a r c hb y0 c a m y l a s e t h ef a t t ya l c o h o lc o m p e t e dw i t l lw a t e ra sg l y c o s y a c c e p t o r s ;g l u c o s ea n df a t t ya c i dw e r eu s i n gi nt h es y n t h e s i so fa l k y ls u g a re s t e rb y l i p a s eo fn o v o z y m e4 35 a sc a t a l y z e r t h i st h e s i ss t u d i e dt h ee f f e c to fr e a c t i o n c o n d i t i o n so nt h ec o n v e r s i o n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n v e r s i o no f a l k y l g l y c o s i d ec o u l dr e a c h17 5 u n d e rt h ec o n d i t i o no f5 0 。c ,n - h e x a n ea n dw a t e r ( v :v = 1 :1 ) a ss o l v e n t ,t h em a s sp r o p o r t i o no fs t a r c ha n d0 【- a m y l a s ei s5 :2a n dt h e r ea r e 5 m m o lf a t t ya l c o h o li ne v e r ylgs t a r c h ,t h er e a c t i o nt i m ei s6h o u r s b yt h ew a yo f e x t r a c t i o nb ya e t h e ra n dn h e x a n e ( v :v = 1 :1 ) a n dd e c o m p r e s s i o nd i s t i l ,w ep u r i f yt h e p r o d u c t t h ec a p a b i l i t yt e s ts h o w e dt h a tt h ef o a mo ft h ep r o d u c tw a s s l e n d e ra n dg r e a s y u n d e rt h et e m p e r a t u r eo f4 0 ,n h e x a n ea n dw a t e r ( v :v = 2 :1 ) a ss o l v e n t ,t h e r ea r e 0 0 4 9l i p a s ei ne v e r yl m lw a t e r ,t h em o lr a t i oo fa c i da n ds u g a ri s2 :1 ,t h ec o n v e r s i o n c o u l dr e a c hu p o n91 i n6h o u r s t h ec a p a b i l i t yt e s ts h o w e dt h a tt h ef o a mw a sr i c ha n d t h ec a p a b i l i t yo fe m u l s i f i c a t i o nw a sp r e f e r a b l e t h i st e c h n o l o g yr e d u c e dt h el e to fw a s t e w a t e r ,e x h a u s tg a sa n dw a s t ea c i d ,w h i c hc a nb eb e t t e rt oe n v i r o n m e n t t h ec o n d i t i o no f r e a c t i o ni sa l s om i l d n e s s ,e n e r g yi sc o n s e r v e d i td e c r e a s e dt h ei n o r g a n i ci m p u r i t yi n p r o d u c t ,t h eo u t c o m ew a ss i n g u l a r i t y ,t h ep r o d u c tq u a l i t ya n de f f i c i e n c yw e r ee n h a n c e d t h i sn e wt e c h n i q u ep r o v i d e db yt h es t u d yh a sb e e nn o t a r i z e da sc h i n e s e p a t e n t k e y w o r d s :伐一a m y l a s e ;l i p a s e ;a l k y l g l y c o s i d e ;s u g a re s t e r i v 学位论文独创性声明 本人声明,所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果,均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果,与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时, 署名单位仍然为山东轻工业学院。 做作者签名:薹童因 铷龇红 日期:丝! ! 年月旦日 日期:型年互月生日 山东轻t 业学院硕士学位论文 第1 章前言 表面活性剂素有“工业味精”之称,它是一类在很低浓度时能显著降低水的表 面张力的化合物 1 】。表面活性剂分子是由非极性的、亲油的碳氢链部分和极性的 亲水基团两部分构成,这两部分成不对称结构,因此表面活性剂是两亲分子,具 有又亲油又亲水的两亲性质。 我国表面活性剂工业始于2 0 世纪5 0 年代,长期以来主要用于生产合成洗衣 粉,随着市场竞争的加剧,生产商将重点转向了工业用表面活性剂。工业用表面 活性剂消耗量的增加,又带动了我国表面活性剂工业的迅速发展,特别是最近2 0 年,我国表面活性剂工业处于高速发展状态,随着科学技术的不断发展与社会的 不断进步,表面活性剂在社会中的地位同趋重要。 表面活性剂的种类繁多,用途广泛,目前世界上表面活性剂的品种已达数千 种,而且新型的表面活性剂还在不断地产生。表面活性剂主要按其结构来分类, 由于亲油基团是一定链长的烷基,种类不多,差别较小,简单可分为脂肪烃和芳 香烃两种,亲水基则种类繁多,差别较大,因此表面活性剂的分类以亲水基团的 结构性质为依据,以它在溶剂中能否电离出离子或电离出何种离子而把它分为阴 离子型、阳离子型、两性型和非离子型四种类型的表面活性剂。 在多元醇型非离子表面活性剂中,糖类脂肪酸酯和烷基葡萄糖苷是两类用途 最广的非离子表面活性剂。它们无毒,对皮肤无刺激作用,生物降解性好,具有 去污、乳化、洗涤、分散、湿润、渗透、扩散、起泡、抗氧、粘度调节、杀菌、 防止老化、抗静电和防止晶析等多种功能【2 】。在日化、食品和医药行业得到了广 泛的应用。 1 1 烷基糖苷 1 1 1 烷基糖苷的概述 我国是世界上人口最多的国家,家用洗涤剂、食品添加剂和化妆品等具有很 大的市场。目前,这些产品的生产多采用石油化工为原料的表面活性剂,存在着 起泡多,不易漂洗,对皮肤有刺激性等缺点。随着人们对表面活性剂的要求同益 提高,性能优良的烷基糖苷正是人们研究的热点。烷基糖苷( a p g ) 是一种新型非 离子表面活性剂,而且在高浓度无机助剂存在下溶解仍然良好【3 】,其主要原料是 淀粉及其水解物。淀粉具有优良的可生物降解性能,而且资源丰富,价格低廉, 因此,以淀粉为原料合成的烷基糖苷不仅具有表面活性高,起泡力强,去污性好, 配伍性极佳等优点,而且具有无毒,无刺激性,易生物降解等特征,被誉为世界 第l 章前言 级温和型表面活性剂1 4 1 。 1 1 2 烷基糖苷的结构及性质 烷基糖苷( a p g ) 是由可再生资源( 淀粉和油脂或它们的衍生物葡萄糖和脂肪醇) 为原料丽制得的非离子表面活性剂,具有高表面活性与离生物降解性5 1 ,其典型 的分子结构如图1 1 嘲: h r 网1 1 烷爨糖苷的分子结构 结构式中,r 为c 8 。c 1 6 的烷基,1 1 为平均聚合度。当r 3 0 0 肛m 的 占4 0 ,6 3 3 0 0 p , m 的占5 0 ,9 3 0 0 0 r m i n ,2 0 m i n ) 分离; 用n a c l 水溶液洗涤数次,取油相; 将油相用甲醇洗涤静置后取油相; 在8 0 9 0 。c 下真空干燥,得产品。 ( 2 ) 直接萃取法 王太山等8 7 】,采用加入丙酮稀释,过滤除酶和分子筛,向滤液 力h a n a c i 盐 水溶液除掉果糖,再加入萃取剂v ( 环己烷) :v ( 乙醇) :v ( 水) = 2 :2 :l 进行萃取。 ( 3 ) 薄层色谱法 薄层色谱分析是将吸附剂( 或载体) 均匀涂敷在一块光洁的玻璃板上形成薄层, 通过移动相( 展开剂) 流经玻璃板上附着的吸附剂( 固定相) ,再借助于吸附剂的毛细 管作用使展开剂沿薄层上升,同时溶解的试样也随展开剂逐渐上升,由于混合物 各组分对固定相、移动相相对吸附能力的不同而将其分离的方法。展开剂的选择 是薄层色谱法分析的难点,f r a n k ag a n s k 5 8 1 等利用v ( 氯仿) :v ( 甲醇) :v ( 乙 1 4 山东轻工业学院硕士学位论文 酸) :v ( 水) = 7 0 :2 0 :8 :2 作展开剂对产品进行了分析。周健等【8 8 j 则利用v ( 正己烷) :v ( 乙 酸乙酯) = 1 :1 作展开剂对甘露糖酯进行了分离纯化。+ 1 3 本课题选题的意义及主要研究内容 正如1 1 和1 2 所述,糖酯和糖苷是一种广泛用于食品、化妆品和药品中的 非离子表面活性剂,具有无毒、无色、无味、生物可降解等优良特性,是一种 极好的乳化剂且易于消化。此外,它们还具有抗肿瘤、抑菌、杀虫等功能。 酶作催化剂有着专一性、高效性等特点,用酶法合成糖酯避免了传统化学 方法转化率低、要求条件苛刻及糖易焦化等不足之处,降低了能耗,并且减少 了废酸、废水和废气的产生,对环境友好。 在糖苷合成方面,我们分别用p 半乳糖苷酶催化葡萄糖和脂肪醇、用p 淀 粉酶、a 淀粉酶催化淀粉和脂肪醇合成烷基糖苷的反应,并进行了综合对比。a 一 淀粉酶可以催化淀粉l ,4 糖苷键的水解,p 淀粉酶可以催化1 ,6 糖苷键的水 解,我们试图通过脂肪醇与水竞争参与其水解反应而达到合成糖苷的目的。而 d 半乳糖苷酶也是催化糖苷的水解,在一定条件下也可以利用其逆反应做糖苷 的合成。本课题最终选用廉价的0 【淀粉酶作催化剂,催化效率明显高于其他酶, 利用正交实验的方法对最佳条件进行了优化,并探索了如何对酶催化得到的转 化物进行分离。 在糖酯合成方面,我们选用n o v o z y m e 4 3 5 型脂肪酶作为催化剂,试图通过 利用有机溶剂体系中变化各个反应条件及不同底物的方式探索脂肪酶最适应的 条件来提高转化率,最大效率地发挥出酶的优势。最终我们对产品进行了红外 光谱表征,并进行了产品性能上的测试。 第2 章实验部分 2 1 材料与仪器 2 1 1 主要材料 1 十二醇 1 十四醇 1 十六醇 1 十八醇 淀粉 葡萄糖 蔗糖 月桂酸 薄层层析硅胶g f 2 5 4 氢氧化钠 叔丁醇 乙酸乙酯 正己烷 乙醚 丁酮- 2 1 2 丙二醇 无水乙醇 冰乙酸 三乙酸甘油酯 三氯甲烷 脂肪酶 固定化脂肪酶 仅淀粉酶 d - 半乳糖苷酶 p 淀粉酶 2 1 2 主要仪器 油浴恒温振荡器 三用紫外分析仪 电热恒温水浴锅 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 第2 章实验部分 天津市笛博化工有限公司 天津市笛博化t 有限公司 天津市笛博化工有限公司 天津市笛博化- 丁有限公司 天津市笛博化上有限公司 天津市广成化学试剂有限公司, 天津市科密欧化学试剂开发中心, 天津市远航化学品有限公司, 青岛海洋化工有限公司, 山东省化工研究院, 中国医药集团上海化学试剂公司, 天津市广成化学试剂有限公司, 天津市博迪化工有限公司, 天津市博迪化工有限公司, 天津市博迪化工有限公司, 天津市博迪化工有限公司, 莱阳市双双化工有限公司, 天津市博迪化工有限公司, 北京金龙化学试剂有限公司, 天津市天新精细化工开发中心, 赠送, 赠送, 北京双旋微生物培养基制品厂, s i g m a a l d r i c h , 北京奥博星生物科技有限公司。 h z 9 6 1 3 y 型江苏太仓市科教器材厂, z f i 型 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司, h h s 2 s 型上海天平仪器厂, 1 6 山东轻工业学院硕士学位论文 循环水式多用真空泵 s h b i i i 型郑州长城科工贸有限公司 调温电热套k d m 型山东省郓城永兴仪器厂, 玻璃点样毛细管华西医药大学仪器厂, 增力电动搅拌器j b 5 0 d 型上海标本模型厂, 电子分析天平f a 2 0 0 4 n 型上海精密科学仪器有限公司 2 2 酶催化合成烷基糖苷 2 2 1 合成方法 精密称取1 9 淀粉,放入2 5 0 m l 的锥形瓶中,并在瓶子上做好标记;加入一定体 积的水,并加热溶解淀粉;加入一定质量的脂肪醇( 空白实验不加脂肪醇) ,把相应 体积的叔丁醇、正己烷、乙腈、水分别放入己编号的锥形瓶中,然后加入一定质 量的酶;把已编号的锥形瓶放入恒温震荡箱中,进行反应。 2 2 2 转化率的测试1 9 0 】 ( 1 ) 标定碱性酒石酸铜溶液 葡萄糖标准溶液的配制 精密称取1 0 0 0 0 克经过9 8 1 0 0 的干燥至恒量的葡萄糖,加水溶解,定 容至2 5 0 m l ,备用。 碱性酒石酸铜溶液的配制 甲液:称取1 5 9 硫酸铜及0 0 5 9 次甲基蓝溶于水并稀释至1 0 0 0 m l ; 乙液:称取5 0 9 酒石酸钾钠及7 5 9 氢氧化钠,溶于水,加入4 9 亚铁氰化钠,完 全溶解后,稀释至1 0 0 0 m l ( 甲乙液均储存于橡胶塞容量瓶中) 。 标定碱性酒石酸铜溶液 吸取5 0 m l 的甲液和5 0 m l 的乙液置于1 5 0 m l 的锥形瓶中,加水1 0 m l , 玻璃珠2 粒,控制在两分钟之内加热至沸,趁沸用标准葡萄糖溶液以先快后慢的 速度滴加,并保持沸腾状态,至浅蓝色时,以每秒1 滴的速度继续滴加葡萄糖标 准溶液,直至蓝色刚好褪去即为终点,滴三次取平均值。滴定量为1 0 m l ,说明 5 0 m l 甲液和5 0 m l 乙液相当于葡萄糖的质量是0 0 1 9 。 ( 2 ) 反应溶液的滴定 反应一定时间后,取出锥形瓶,趁热抽滤,并用蒸馏水反复沈涤锥形瓶3 次, 滤液移入2 5 0 m l 容量瓶中并定容。 反应溶液的预测 吸取5 0 m l 的甲液和5 0 m l 的乙液置于1 5 0 m l 的锥形瓶中,加水1 0 m l ,玻 璃珠2 粒,控制在两分钟之内加热至沸,趁沸以先快后慢的速度滴加反应溶液, 并保持沸腾状态,至浅蓝色时,以每秒1 滴的速度继续滴加反应溶液,直至蓝色 刚好褪去即为滴定终点,滴定量为v l 。 反应溶液的测定 1 7 第2 章实验部分 同中操作,加玻璃珠后,滴加比v l 少l m l 的反应溶液后加热,使之在2 r a i n 内沸腾,沸腾后以2 秒l 滴的速度滴定直至蓝色刚好褪去为终点。消耗反应溶液 体积为m 2 ( 空白反应溶液的滴定体积为m 1 ) 。 ( 3 ) 转化率计算公式 底物为淀粉与脂肪醇,通过与空白试验对比,用分解出来还原糖( 假定统一 为葡萄糖) 的减少量来表示实验的转化率,计算公式如式2 1 : ( 唑一业) 2 5 0 刁= m im 2 1 0 0 式( 2 1 ) 式( 2 1 ) 中,业代表每毫升空白反应溶液含有的葡萄糖的质量; ,z 1 0 0 1 代表每毫升反应溶液含有的葡萄糖的质量; 聊2 1 代表反应前加入的淀粉的质量为l g 。 2 2 3 产品分离 本课题所得转化物由于成分复杂,大分子的糖和未反应的高碳醇比较多,故 选用萃取与减压蒸馏两种方法进行分离提纯。反应后取出锥形瓶,于2 5 0 m l 分液 漏斗中进行分液,分离出的下层水相再用正己烷与乙醚的混合液进行萃取2 遍, 分液后合并上层液,于8 0 。c 水浴中蒸馏出溶剂正己烷与乙醚,并回收。加入相应 量的携带剂t ,于1 8 0 。c 2 0 0 。c 下进行减压蒸馏,冷却后得到淡黄色产品。 2 2 4 产品分析 ( 1 ) 利用紫外吸收光谱分析其成分。 ( 2 ) 用k b r 压片法在傅立叶变换红外光谱仪上测定其红外光谱图。 2 2 5 产品性能测定 ( 1 ) 产品泡沫性能的测定 取一定量的产品,配制成o 1 5 浓度的溶液,并加热使其溶解,取溶液4 0 m l 于具塞量筒中,反复震荡5 次并记录泡沫高度,并每隔一段时间记录一次相应的 泡沫高度。 ( 2 ) 产品乳化性能的测定 取一定量的产品,配制成o 1 5 浓度的溶液,并加热使其溶解,分别取糖苷 溶液和液体石蜡各4 0 m l ,反复震荡5 次后静置,并丌始记时,分别记录下分离 出l o m l 油相和l o m l 水相所用的时间。 2 3 酶催化合成糖酯 2 3 1 脂肪酶酶活的测定方法( 用b p 6 3 法测定脂酶) 【删 1 8 山东轻工业学院硕上学位论文 ( 1 ) 原理 脂酶从甘油三醋酸酯中分解出醋酸,用标准氢氧化钠溶液滴定分解出来的醋 酸以确定脂肪酶的活性。 ( 2 ) 定义 一个脂酶单位相当于在实验条件下释放出1l am o l 醋酸所需的酶量。 ( 3 ) 试剂 底物溶液取5 9 m l 甘油三醋酸酯( c 9 h 1 4 0 6 ) 滴入9 0 m l 蒸馏水中,振摇,直 到甘油三醋酸酯完全溶解,然后用蒸馏水定容至1 0 0 m l 。 n a o h 溶液0 0 5 m o l l 。 ( 4 ) 操作步骤 如表2 1 所示,将5 0 m l 底物溶液移入一支可以调温的四口瓶内,边搅拌边 加热至3 0 。c ,加氢氧化钠溶液把p h 值调至6 2 - - 6 4 。然后加入o 1 9 脂肪酶,并 记时。在3 0 。c 温度下以中等速度搅拌此反应混合物3 0 m i n 。滴加氢氧化钠溶液, 使此时的p h 值保持在6 2 - - 6 4 。保温时间结束时读取氢氧化钠溶液的耗量。 同样方法测定空白值,只是这里用的是己在1 0 0 * c 水浴中钝化了4 m i n 的脂肪 酶。 表2 1 酶活的测定操作流程 土值空白值 底物溶液5 0 0 m l5 0 0 m l 降温至3 0 ,用氢氧化钠溶液把p h 值调至6 2 6 4 酶最 0 1 9 已钝化的酶 0 1 9 的质量 于3 0 。c 边搅拌边精确保温3 0 m i n ,用氢氧化钠溶液连续滴定 3 0 m i n 后读取氧氧化钠溶液的耗量 ( 5 ) 计算 按以下公式计算脂酶的活性: ! 旦二业ew 一! q = 甜g 式( 2 2 ) 一= 一li二二- 、 式( 2 2 ) 中,h - 一用于主值的耗量( m l ) 。 b 用于空白值的耗量( m l ) 。 5 卜5 0l am o l 醋酸等价于l m l 0 0 5 n 氢氧化钠溶液。 b 广_ 一固定化脂肪酶的质量( g ) 。 2 3 2 脂肪酸葡萄糖酯的酶法合成 1 9 第2 章实验部分 在1 5 0 m l 锥形瓶中,加入指定量的脂肪酸和葡萄糖,充分混合均匀,于预先 设定好温度的恒温振荡器中振荡1 0 m i n ,加入相应的脂肪酶或固定化脂肪酶,转 速为1 5 0 r m i n ,反应一定时间。恒定其他反应条件不变,变换温度、转速、反应 时间等反应条件,做几组平行对比实验,以找到最佳反应温度条件、酶的加入量 及最佳酸糖配比和溶剂等。 2 3 3 转化率的测定 过滤出固定化酶,终止反应,以酚酞为指示剂用0 0 5 m o l l 的氢氧化钠溶液 滴定反应体系中残留的脂肪酸,以脂肪酸的减少量计算酯化率,结果以酸的相对 转化率表示。 2 3 4 产物提取 以酚酞为指示剂,用l m o l l 的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸,然后向 反应体系中加入3 0 m l 萃取溶液,充分摇匀,转移到分液漏斗中,静置分层后分 离出提取液,水层继续用3 0 m l 相应的萃取溶液萃取,将提取液合并,减压蒸馏 出萃取溶液,即得到提纯产物。 2 3 5 薄层色谱鉴定 ( 1 ) 薄层板的制法: 平铺法。把薄层层析硅胶( g f 2 5 4 化学纯) 与蒸馏水调制成的浆液倒在载玻片 上。用手轻轻振动至平。薄层厚度约为0 2 5 m m ,室温晾干后,在7 0 。c 的烘箱内 活化2 小时。取出放冷后即可使用。 ( 2 ) 点样 用内径小于1 m m 的毛细管点样。点样前,先用铅笔在薄层板一端l c m 处轻 轻划一横线作为起始线,然后用毛细管吸取月桂酸和反应产物的样品溶液,在起 始线上小心点样,斑点直径不超过2 m m 。如果需要重复点样, 应待前一次点样 的溶剂挥发后,方可重复再点,以防止样点过大,造成拖尾、扩散等现象,影响 分离效果。因在同一板上点两个样,样点间距应在l c m 1 5 c m 为宜。待样点干燥 后,进行展开。 ( 3 ) 展开 薄层展开要在盖有表面皿的密闭的小烧杯中进行,加入展开剂的高度为 o 5 c m 1 0 c m ,把带有样点的板( 样点一端向下) 放入展开器内。注:使展开剂的水 平线务必在样点以下。当展开剂上升到离板的顶部约l c m 处时取出,并立即用铅 笔标出展开剂的前沿位置,待展开剂干燥后,在紫外灯下观察斑点的位置并用铅 笔标出。计算出各个斑点的r f 值。 2 3 6 红外光谱鉴定 获得提纯产物后,用k b r 压片法在傅立叶变换红外光谱仪上测定其红外光谱 图。 山东轻t 业学院硕士学位论文 2 3 7 产品性能测定 ( 1 ) 产品泡沫性能的测定 取一定量的糖酯产品,配制成o 1 5 浓度的溶液,并加热使其溶解,取溶液 4 0 m l 于具塞量筒中,反复震荡5 次并记录泡沫高度,并每隔一段时间记录一次 相应的泡沫高度。 ( 2 ) 产品乳化性能的测定 取一定量的产品,配制成0 1 5 浓度的溶液,并加热使其溶解,分别取糖酯 溶液和液体石蜡各5 0 m l ,反复震荡5 次后静置,并开始记时,分别记录下分离 出1 0 m l 上层油相和下层l o m l 水相所用的时间。 2 l 第3 章实验结果与讨论 第3 章实验结果与讨论 3 1 烷基糖苷试验结果 3 1 1 前期研究 我们首先用d 半乳糖苷酶进行了无溶剂下的糖苷合成实验,转化率几乎为o 。 通过加入少量的水跟有机溶剂,发现在存在有少量水的有机溶剂中反应具有一定 的转化率。 我们对几种脂肪酶催化糖苷的合成均无相应转化率,然后我们分别对0 【。淀粉 酶,b 淀粉酶,p 半乳糖苷酶进行了合成糖苷的初步测试,结果如表3 1 : 表3 1 溶剂对转化率的影响 p 半乳糖苷酶 a 淀粉酶 p 一淀粉酶 8 5 4 0 o 0 1 2 0 1 6 5 0 o 3 o o 0 o o 以上结果表明,d 半乳糖苷酶与旺淀粉酶都能催化合成糖苷且转化进度差不 多。不过从经济方面考虑,用o 【淀粉酶不仅是一种新的实验思路,更是经济实用 的实验方法。用正己烷作有机溶剂不仅可以更好的溶解脂肪醇,使其由固液反应 转变为液液反应,增大了其反应的碰撞界面,提高了反应进度,更使分离步骤简 化,解决了产物难以与酶进行分离的难题。 3 1 2 反应温度的选择 伐淀粉酶的最适反应温度是5 0 7 0 ,然而温度越高,溶剂正己烷就挥发越 多,我们从节能环保等方面考虑,选择5 0 作为最佳反应温度。如图3 1 : 山东轻t 业学院硕十学位论文 2 0 3 1 03 2 03 3 03 4 03 5 03 6 0 3 7 0 温度( k ) 图3 1 温度对转化率的影响 3 1 3 酶催化合成糖苷正交试验 我们使用6 因素5 水平表对q 淀粉酶催化合成烷基糖苷进行了正交试验,试 验因素和水平见表3 2 。实验结果见表3 3 。 表3 2 淀粉酶催化合成糖苷正交实验冈素水平表 冈 脂肪醇( a ) 时间( b ) 溶剂与水溶剂( d ) 醇的摩尔酶量( f ) 水素 ( h ) 配比( c )数( e ) ( g ) 尹(mm01) l十二醇25 :1 0正己烷l0 1 2十四醇41 0 :1 0乙醚20 2 3十六醇 61 5 :1 0乙腈30 3 4十八醇82 0 :1 0环己烷4o 4 5十二醇 1 02 5 :1 0 水 50 5 5 0 5 0 96一槲晕车毒 第3 章实验结果与讨论 k 1 l ( 2 k 3 k 4 4 0 7 2 2 1 1 6 2 2 1 3 1 0 6 2 9 6 2 7 6 2 0 5 2 0 3 3 3 1 1 2 3 1 6 6 4 1 9 1 2 5 2 1 2 6 5 2 7 5 1 7 8 1 9 2 6 5 2 8 o 3 0 3 5 o 3 0 2 k 5 1 2 01 8 01 8 23 4 3 6 8 优选方案为a 2 8 2 c 2 d 1 e 5 f 2 ;按照优选方案做出的实验结果: 实验转化率为:1 4 7 3 1 4 正交实验分析 2 4 山东轻工业学院顾十学位论文 由正交实验表的极差分析,我们可以看出:溶剂对反应的影响是最大的,这 是由于合适的溶剂可以很好的溶解脂肪醇,并且不会影响淀粉在水中的溶解度, 使得液液反应中粒子碰撞的几率增大,不良溶剂的加入会导致淀粉的析出;而且 反应所得的糖苷溶于有机相,使得反应向产物方向进行,从而增加了转化率。 影响反应的次要因素是脂肪醇和酶的加入量。本课题研究的主要原理就是利 用脂肪醇与水竞争参与与糖的反应,所以醇的加入量会直接影响到最终的转化率。 如果醇的加入量不够则会在与水竞争中处于劣势,从而转化率降低,脂肪醇太多 则会超过溶液的溶解度,浪费了原料。因此我们选择加大脂肪醇加入量,最后回 收未反应脂肪醇的方式来增加转化率。 溶剂的配比对反应的影响也很大,因为正己烷相溶解脂肪醇,而水相溶解淀 粉与酶,如果水或正己烷过多则会使水解大于醇解,不利于烷基糖苷的形成,而 水过少则会使淀粉酶无法充分与淀粉反应,正己烷过少则不能够充分溶解脂肪醇 和产物,也会使转化率降低。 反应时间也对反应有影响,反应时间过短,反应不充分;反应时间过长,则 在大量水存在的环境下,又会水解一部分糖苷,转化率降低。 脂肪醇的种类则对反应的影响不很大,说明在有机溶剂的存在下可以合成不 同碳链长度的烷基糖苷。 正交实验表明,温度在5 0 时,正己烷与水( v :v = 1 :1 ) 作溶剂,加入淀粉质量 与0 c 淀粉酶的比例为5 :2 ,l g 淀粉中加入5 m m o l 十二醇,反应6 小时,转化率最 高,可达到1 7 5 。 3 1 5 产品分离 ( 1 ) 萃取 分别用正己烷、乙醚、三氯甲烷为萃取剂,发现三氯甲烷相无法有效地萃取 出产品;乙醚作萃取剂时整个体系容易被乳化,难以进行分液;单纯使用正己烷 则需要等很长时间才能萃取出少量产品。由于乙醚在j 下己烷中溶解度远大于在水 中溶解度,所以我们用乙醚与正己烷混合溶液对反应液进行萃取,实验证明用乙 醚与正己烷体积比为1 :1 的混合溶液作萃取剂效果比较理想。 ( 2 ) 减压蒸馏脂肪醇 采用加入携带剂t 的方式来降低溶液的饱和蒸汽压,由于糖苷为不挥发组分, 根据拉乌尔定律可得p = p o 醉x 醇+ p o t x t ,携带剂加入过多会导致饱和蒸汽压过低, 容易产生暴沸,且产物中携带剂的残留量增加。不仅造成原料浪费,蒸馏时间拉 长,而且使得产品质量下降。如果加入量过少会使体系在较高温度下才能蒸馏, 导致产品颜色加深,分离效率下降。图3 2 测定了液态粗产品与携带剂不同体积 比进行减压蒸馏,实验结果表明,携带剂与样品量体积比为1 :4 ,蒸馏到1 4 8 时温度保持5 m i n 后继续以2 m i n 的速度上升至2 0 0 * ( 2 ,分离比较顺利。 镕3 口女验# * 与讨论 1 6 。7 7 。1 4 0 j 莲。1 2 0 j , 酬3 2 挑带剂告嚣刈饱利蒸汽j 1 、的影响 5 16 产品的分析 f 1 1 紫外吸收光谱分析 对分离的产物进行紫外光谱分析,如罔33 幽5 3烷基糖廿的紫外光谱 山上图可知l g o n m2 0 0 h m 有强吸收峰,而大于2 ( ) o n m 处无强吸收峰,说明产 物为饱和化台物或j 含有个双键的化物:2 5 0 h m3 0 0 n m 有个巾低强度的吸收 峰,醣明此产物中肯有醛幕,产物中含少量有淀粉分解出来的还原糖。 r 2 ) 红外光谱分析 山东轻t 业学院硕十学位论文 对产品进行红外光谱分析结果如图3 4 。 图3 4 十二烷基糖苷的红外光谱图 3 3 3 1c m 1 为糖的o h 伸缩振动吸收峰。 2 9 2 4c m 以为甲基或亚甲基上的c h 伸缩振动吸收峰。 1 7 4 7c m 以为还原糖中c = o 的伸缩振动吸收峰。 1 4 5 4c m d 为亚甲基上的c h 弯曲振动吸收峰。 1 0 5 7c m 。1 为糖苷中c o c 结构的c o 伸缩振动吸收峰。 ( 3 ) 产品质量的分析 本课题研究的烷基糖苷产品经山东省分析测试中心鉴定外观为淡黄色粘稠液 体,游离脂肪醇含量为1 9 ,平均聚合度为1 - 2 ,在2 0 的粘度为3 3 6 2 m p a s 。 详见附录1 。说明产品的质量达到国家标准要求。 3 2 糖酯实验结果 3 2 1 酶活的测定 经测定,所采用的n o v o z y m e4 3 5 型脂肪酶的酶活为3 5 0 9 u g 。 3 2 2 葡萄糖月桂酸酯实验结果与讨论 ( 1 ) 不同溶剂对反应的影响 溶剂的不同直接决定了反应的类型与状态,不同极性的溶剂对酶催化的影响 是不同的。图3 5 比较了在酶催化反应中常用的5 种溶剂:叔丁醇、丁酮 2 】、正 己烷、乙腈、无溶剂和丙酮。我们可以看出,正己烷由于其有适合的极性能够溶 解脂肪酸和糖酯且不破坏酶的结构,对糖则溶解度很低,使反应进行的更彻底, 具有较高的转化率。 2 7 第3 章实验结果弓讨论 7 0 6 0 5 0 邑4 0 槲 甚3 0 蛑2 0 1 0 0 234 56 溶剂 图3 5 溶剂对反应的影响 l 、叔丁醇;2 、2 丁酮;3 、正己烷;4 、乙腈;5 、无溶剂;6 ,丙酮 ( 2 ) 含水量对反应的影响 水对维持酶的构象起着重要作用,而且对反应平衡也有影响。在此实验中, 水的含量还直接影响到是否能形成微乳液。实验现象表明,当水含量过低时,固 定化酶无法充分分散丌,反应的转化率降低,使得反应体系不能够被很好的乳化, 从而不能更好的催化反应;水过量则会影响反应平衡。我们通过对水与有机溶剂 体积比例的调节如图3 6 ,发现最佳含水比例为v ( 水) :v ( 正己烷) = 1 :2 。此时转化 率可达到9 1 5 5 。 ( 3 ) 温度的影响 1 0 0 8 0 永 斟4 0 s 磐2 0 0 0 1 :1 0 1 :1 0 1 :53 :1 02 :51 :23 :54 :51 水与己烷体积比 图3 6 水与有机溶剂比对转化率的影响 山东轻工业学院硕士学位论文 图3 7 可知温度对转化率和初始反应速度的影响。酶催化反应对反应温度相 当敏感,温度过高会使酶蛋白失活,温度过低则反应速率降低,通过此实验我们 确定4 0 。c 是最佳反应温度。 0 0 3 5 c 0 0 3 0 皇 皇 褥0 0 2 5 幽 翅0 0 2 0 岖0 0 1 5 彀 屦0 0 1 0 3 1 03 2 0 温度 k 6 0 5 0 4 0 心 3 0 一 * 2 0 = 一 1 0 图3 7 温度对反应的初始速率和转化率的影响 ( 4 ) 反应时间 时间对转化率的影响如图3 8 所示。我们发现反应4 6 小时反应已经基本完 成,控制合适的反应时问不仅能最高效率的进行酯合成,而且时间过久,反应产 生的过量水及反应环境中的水蒸汽会产生副作用,使反应向逆反应方向进行。 6 0 拿5 0 槲 s 柏 辩 3 0 图3 8 不同时间下反应的转化率 ( 5 ) 底物比例 图3 9 说明适当增加脂肪酸与糖的摩尔比可以增加酸的反应的物质的量。但 第3 章实验结果与讨论 是当比例大于3 :1 时,脂肪酸已经达到过饱和,这些过量的不溶脂肪酸不能更好 的跟酶接触,从而会降低转化率。 4 0 邑3 6 籍 基 浆3 2 2 8 酸糖摩尔比 图3 9 底物的摩尔比对反麻的影响 3 2 3 葡萄糖油酸酯的合成 在对胃程酸酯研究的基础上,我嚣j 进一步对不饱和脂肪酸漓酸进行了条件探 索实验。在此类反应体系中合成油酸糖酯的转化率要大于月桂酸和硬脂酸( 如表 3 6 ) ,这是说唆油酸的结构更适合酶的锁钥结构。、漓酸作为不饱和脂肪酸对人体 健康具有重要意义。在传统的化学方法中由于双键容易被氧化而较难得到,而酶 催化条件温和,待到了不饱和脂肪酸酯,此结果也表骧n o v o z y m4 3 5 脂肪酶更容 易催化碳链较长的脂肪酸和糖。 ( 1 ) 溶剂对转化率的影响 4 0 下,1 0 m l 有机溶裁5 m l 水,酶量o 。2 9 ,反应时间6 小时,在不同溶剂 中不同酸糖摩尔比的相应转化率如下表3 4 表3 。4 滚翘与黢糖摩尔眈对转化率影l 囊 由上表可知,溶剂对转化率的影响很大,正己烷作溶剂由于能很好的溶解脂 肪酸且极性低,不容易破坏酶的结构,比其他几种溶剂更具有突出的优势。 ( 2 ) 温度对转化率的影晌 1 0 m l 正已烷,5 m l 水,0 2 ;脂肪酶,反应6 小时,反应温度对转化率的影 响结果见表3 。5 3 0 6 6 2筑融龟 3 8 2 3 8 2 5 9 7 2 7 l 0 3 8 0 2 5 2 9 l鼢卜心 6 9 5 醇烷啦 丁已酮叔正丁 山农轻t 业学院顶七学位论文 袭3 5 瀑度与酸耩摩尔比对转化率静影响 3 5 7 5 ,7 8 2 。o 8 l 。s 8 9 。4 4 1 3 l 91 8 9 2 3 8 9 8 8 8 6 4 5 7 9 。2 7 8 。3 8 9 3 粥。4 5 0 7 5 2 7 6 4 8 7 2 8 4 9 由上表可看出4 0 。c 对酶最适合,转化率最高,随着温度的增加转化率有所下 降。当酸糖摩尔比在2 :l 时转化率达到9 2 2 9 。 ( 3 ) 酶加入量对转化率的影响 在4 0 下,加入l o m l 正己烷,5 m l 水,反应6 小时,变化脂肪酶的加入量、 转化率的变化如图3 1 0 1 0 0 8 0 邑6 0 瓣 基4 0 辞2 0 0 0 00 10 2 0 30 4 酶加入量( g ) 图3 1 0 酶加入鬣对转化率影响 由图3 9 可知,加入o 2 9 脂肪酶反应转化率最高,随着更多量的脂肪酶的加 入,体系中水量不能够满足酶所需的必须水,使得反应转化率反而有所下降。 3 2 4 不同脂肪酸与糖反应 我们在4 0 下,正己烷( 1 0 m 1 ) 与水( 5 m 1 ) 作溶剂,酸糖反应比为l :l , 加入酶0 2 9 ,控制反应时间为2 小时,在均未反应完全的情况下,对各种脂肪酸 和糖反应的转化率,更熊反应出此酶针对不同底物的催化效率。测得如表3 6 。 第3 章实验结果与讨论 表3 6 不同的脂肪酸与糖反应比较 由表可知,蔗糖比葡萄糖转化率更高,其中不饱和酸的转化率明显高于饱和 酸的转化率,说明此酶对不饱和酸的催化更具有吻合性,催化效率更高。 3 2 5 产品的分离 通过对不同溶n - 正己烷,氯仿,丙酮,乙腈,叔丁醇,
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