沉默NET1基因.ppt

沉默NET-1基因对肝癌细胞生物学行为的影响,陈莉，王桂兰，秦婧，吴园园，朱建伟南通大学附属肿瘤医院病理科南通大学医学院病理学教研室,肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinomaHCC）是全球性的健康问题之一。我们南通启东是WHO确定的HCC高发研究现场。研究基于我们的首次发现NET-1在HCC组织中特定表达，并发现该基因参与HCC细胞的分裂增殖和癌发生、发展密切相关的细胞运动过程,探讨针对NET-1的siRNA抑制肝癌癌细胞株(SMMC-7721)中NET-1基因的表达，及该基因对癌细胞增殖、迁移、内吞的影响。,一、项目研究背景,NET-1与NET-2到NET-7一起统称为NET-X，它们是由Serru等于2000年在EST数据库中发现的7个新的含4次跨膜蛋白超家族(transmembrane4superfamily或tetraspanfamily,简称TM4SF)的成员。,NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1)定位于染色体1p34.1上，其mRNA全长为1297bp(基因库登记号码AF065388)，为TM4SF的成员之一，最近证实其为肿瘤相关基因。,1、NET-1siRNA表达质粒和myc-NET-1重组表达质粒的构建。2、细胞培养与转染。3、细胞内总RNA抽提及RT-QPCR检测NET-1mRNA。4、Westernblot检测NET-1蛋白表达。5、CCK-8法检测细胞增殖活性。6、流式细胞仪(FCN)检测各组细胞处于不同细胞周期中的比例与增殖指数。7、细胞划痕试验检测细胞二围空间的迁移能力。8、Transwell小室检测细胞三围空间的迁移能力。9、Capture-ELISA方法测量细胞内生物素标记的转铁蛋白水平。10、anti-uPAR标记的癌细胞伪足形成实验。,一、材料与方法,系统组织成人组织胎儿组织恶性组织第一组第二组第三组消化系统胃+NA*+食道+NANA小肠+NANA结肠+NANA直肠+NA+胰腺NA+肝+泌尿生殖系统肾+睾丸+宫颈+NA(halan细胞l)+宫体+NA+前列腺+NANA乳腺+NANA内分泌系统垂体+NANA甲状腺+NANA肾上腺+NANA淋巴造血系统造血细胞NA*淋巴结+NANA骨髓NANA脾脏+NANA胸腺+NANA神经系统脑+NA脊髓+NANA视网膜+NANA其他心+黑色素瘤+肺+NA肌肉+NA皮肤+NA胎盘+NANA*NA:现在未做检测；*白血病，淋巴瘤,1.检测人体组织中NET-1mRNA表达锁定研究目标HCC,二、结果,M1234567891011,LanesM:200ngof1kbsizeladder(NewEnglandBioLabs);Lanes1-3:NormalFetalLiverTissues;Lanes4-7:NormalAdultLiverTissues;Lanes8-11:LiverCancerTissues,转染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721细胞中NET-1mRNA的表达（RT-QPCR）以未处理组为1。NET-1-siRNA组和myc-NET-1组分别与未处理组相比(P0.05，p0.01)；NET-1-siRNA组与pU6H1-GFP组相比(P0.05，p0.01)；myc-NET-1组与pcDNA3.1/myc组相比(P0.05，p0.01),2、RT-QPCR检测转染NET-1siRNA和myc-NET-1细胞中NET-1mRNA的结果,3.NET-1蛋白表达在HCC组织中显著高于癌旁组织中。,-actin,NET-1,Lanes1,3,5,7canceroustissues;Lanes2,4,6,8:adjacentnoncanceroustissues,（1）随时间的延长NET-1-siRNA处理组细胞增殖明显减少；NET-1稳定表达组细胞增殖明显增多。,4.干扰NET-1可以抑制HCC细胞增殖,（2）NET-1-siRNA处理组细胞存在G0/G1和G2/M期阻滞，G0/G1和G2/M期细胞比例分别增加了17.04%和10.97%，S期细胞比例降低。NET-1稳定表达组细胞更快地进入细胞周期进程，G0/G1期细胞比例明显降低。,GFPsiRNA组,NET-1siRNA组,对照组,NET-1过表达组,5.干扰NET-1可以抑制HCC细胞迁移,在NET-1siRNA组中显著减少(p0.05）NET-1siRNA处理细胞后迁移能力明显下降。,转染48h后穿过Matrigel胶细胞数NET-1siRNA组（21.425.74）和pU6H1-GFP（45.608.25）差异有显著统计学意义（P0.05）；myc-NET-1组（64.806.14）和pcDNA3.1/myc（38.207.22）差异有显著统计学意义（P0.05）。,6.干扰NET-1可以抑制HCC细胞内吞,转铁蛋白(Tfn)内吞实验显示，NET-1siRNA组癌细胞的内吞能力明显下降。其他组间的内吞作用变化不明显。,未处理anti-NET-1兔IgGNET-1siRNAGFP-siRNA,7.干扰NET-1可以抑制HCC细胞侵袭伪足形成,NET-1siRNA处理细胞伪足形成细胞百分比明显减少(p0.01),NET-1siRNA处理细胞中以anti-uPAR标记的癌细胞伪足明显减少。,8.干扰NET-1可以抑制裸鼠HCC的生长,myc-NET-1,NET-1siRNA,9.NET-1表达与HCC临床病理因素和预后的研究,(1)NET-1表达与HCC临床病理因素密切相关。,NET-1基因蛋白表达与HCC临床病理因素的关系(76例),（2）Kaplan-Meier生存曲线,（3）Cox比例风险模型多因素生存分析,HCC转移、组织学分级，癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表达均具有独立的预后意义。风险分析提示这些因素增强时均能增加HCC病人的死亡风险(其风险比均1),三、讨论,本文通过构建NET-1siRNA和myc-NET-1表达质粒，并转染肝癌细胞SMMC-7721。研究发现NET-1基因参与肝癌细胞的增殖分裂活动，干扰肝癌细胞NET-1基因的表达，可以抑制癌细胞的增殖，使细胞生长受限，可以抑制细胞在二围、三围空间的迁移能力、癌细胞内吞能力和侵袭性伪足形成能力。相反，增加NET-1基因的表达，癌细胞表现为显著增生，更快地进入细胞周期，迁移能力提高。研究结果揭示了肝癌细胞中NET-1基因的功能，为肝癌的发生、发展机制增添了新的内容。NET-1表达与HCC临床病理因素和预后相关性的研究显示为NET-1表达与HCC的组织学分型、病理分级、脉管转移等临床病理因素密切相关。癌中NET-1高表达患者生存期明显减少、NET-1高表达具有独立的预后意义。NET-1高表达能增加HCC病人的死亡风险。,1.首次发现NET-1在肝脏良恶性组织中表达的特点。2.在HCC细胞中干扰NET-1表达，抑制癌细胞的迁移、侵袭、内吞和伪足形成的能力，并能抑制裸鼠HCC生长。提示NET-1可能在HCC细胞运动中发挥作用，是HCC细胞增殖相关蛋白。3.NET-1表达与HCC临床病理因素密切相关，是显著影响患者预后的独立指标，高表达患者死亡风险增加，具有显著的临床预后评估价值。4.已研制的NET-1多克隆抗体，可用于免疫组化、蛋白印迹等多种实验，具有临床推广使用的可