（化学工程专业论文）竹叶黄酮类物质的提取和分离纯化研究.pdf

摘要 本文首先综述了黄酮类物质的分类、生物活性、各种理化性质和显色反应等， 并对国内外文献中黄酮类物质的提取、纯化、分离和分析过程的研究进展进行了 概述和比较。 实验中，在浸取方面，主要比较了水、乙醇溶液和正丁醇水两相系统这三 种浸取溶剂在不同浸取条件下( 温度、浸取时间等) 得到的总黄酮得率的大小。 总黄酮含量分析采用酸性条件下氯化铝显色的可见光分光光度法。 乙醇溶液是目前国内普遍使用的浸取剂，而正丁醇水两相系统则可以看成 是一个浸取萃取耦合的体系，机理可能是正丁醇在进入水相时，被分离成无数 的小液滴，作为乳化液分散在水相料液中，形成水包油体系，同样地，水相进入 正丁醇相中也形成了油包水体系，这些油包水和水包油微粒是浸取的体积单元， 溶质透过油膜向膜内相扩散完成传递过程，最后乳化相破乳得到产品，由实验数 据可知，两相浸取中，总黄酮的浸取得率与常用的乙醇溶液相比稍小，却实现了 浸取和萃取过程，达到了粗黄酮类物质的初步分离，是一种值得研究的萃取系统。 而水作为浸取剂，达浸取平衡时浸取得率约为乙醇溶液的8 0 ，相比较之下， 水是一种更为洁净和廉价的浸取剂，而且叶绿素不溶于水，在后续处理中免去了 去除叶绿素的麻烦，也是其的一大优点。 粗提物醇沉后采用液液萃取方法，对水浸取的粗提物进行了初步纯化。主要 是使用极性由小至大的各种有机溶剂连续抽提( 石油醚一乙酸乙酯一正丁醇一水 的四部位法) ，从而将亲脂性的成分和亲油性的成分分开。然后详细地对竹叶粗 提物液液萃取纯化后的成分用硅胶板进行了展开剂的选择，发现了乙酸乙酯：丙 酮：水：乙酸系统对该混合物具有较好的展开性能，再用硅胶柱层析对液液萃取 纯化后的粗提物进行了分离。 关键词：竹叶，黄酮，两相浸取，液液萃取 a b s t r a c t i n 也eb e g 蛳n g ，w eg e n e r a i l yd i s c l l s st t l e c l a s s i 丘c a t i o n ，v a r i o u sp h y s i c a la i l d c h c m i c a lc h a r a c t e r so fn a v o n e si nt 1 1 i sp a p e la n dm er e s e a r c hw i l i c hf o c u s e do n e x 仃孔t i o n ，p l l r i f l c a t i o n ，s e p a r a t i o na j l da n a l y s i sp m c e s so f n a v o n e sa r ei n _ t r o d u c e da n d c o m p a r e d i nt t l ea s p e c to fe x t r a c t i o n ，w ec o m p a r et h ct o t a le x _ a c t i l l gy i e l d s 姗o n gn l r c e d i 髓r e n ts o l m i o i l s ( w a t e r ，e t h a n o ls o l u t i o na n dm en 山u t y la l c o h o l w a t e r 帆o - p h a s e s o l v e n ts y s t e m ) f o re x t r a c t i o nb yc h a n g et h ee x t r a c t i n gc o n d i t i o n s t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o wt h a tt h ee m a n o ls o l u t i o no b t a i n e dm eh i g h e s ty i e l d 协s o m ec o n d “i o n s t h ee x t r a c t i o n p e r f o m l a n c eo fw a t e r a l s ol l a sa g o o dr e s u l t t h ee x 打a c t i o n p e r f 0 h n a n c eo ft h et 、v o - p h a s es o l v e n ts y s t e mi sb e t t e rm a i lt t l ep l l r es 0 1 v e n t s ，们t 1 1t 1 1 e h i 曲e s te x t m c t i o ny i e l do b t a i n e da tt h ea p p a r e n tv o l u m em t i oo f1 ：1 nm e a n st h a tm e i n t e 伊a t i o no fl e a c h i n ga n dl i q u i d _ l i q u i de x t r a c t i o nc a ni n c r e a s et h ee x t r a c t i o ny i e l d s i g n m c a t l t l y a f i e rt h a t ，w et r yt op r o b ei n t ot h ed i 脏r e n c eo fm e c h a n j s mb e t w e e nt h e e x 仃a c t i o n sw i t ht h e n - b u t y la 】c o h o l w a t e rt 、v o p h a s e s o l v e n ts y s t e ma i l dt l l eo n e p h a s es o l u t i o n a f c e rt 1 1 a t ，w ed e c i d e dt ou s et h cw a t e ra st h ee x t r a c t i l l gs o l u t i o n ，a n d p u r et h c n a v o n e s e x t r a c t i n g w i t l lw a t e r b yl i q u i d - l i q u i d e ) m a c t i o na n dc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y k e y w o r d s ： b a m b o ol e a v e s ，n a v o n e s ，t w o p h a s es o l v e ms y s t e m ，l i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n 浙江大学硕士学位论文 1 1 竹类资源简介 第一章文献综述 1 1 1 我国的竹类资源 我国位于世界竹子分布的中心地区，竹类资源非常丰富，利用竹子的历史可 追溯到五、六千年前。竹子在我国文化发展史上起了重要作用【l 】。我国现有竹林 6 0 0 0 多万亩，占森林面积的4 左右，其中毛竹面积3 6 0 0 多万亩，每年生产商 品竹材6 0 0 一7 0 0 万吨，占世界商品竹材的1 3 左右【2 】。 我国竹类植物自然分布区很广，南至海南岛、北至黄河流域、东至台湾、西 至雅鲁藏布江下游，约相当于北纬1 8 。一3 8 。和东经9 2 。一1 2 2 。长江以南地 区的竹种最多，面积最大，生长最旺【3 】o 1 1 2 竹子的利用现状 竹子全身都是宝，是当今世界最具有使用价值的植物之一。竹材是竹林的主 产品，竹材工业利用主要有：竹浆造纸、竹质人造板、竹家具和日用品、竹工艺 品等。竹产工业是我国轻工业中一个独具特色的组成部分，也是地方工业的一个 重要经济部门。近些年来，在改革开放大潮的推动下，我国的竹材工业迅速发展。 据有关资料统计，1 9 9 0 年我国竹产业总值约5 5 亿多元，其中竹产工业产值约1 5 2 0 亿元，外贸出口超过1 5 亿美元【4 】。 竹笋作为食物在我国已有2 5 0 0 多年的历史，近年来更是受到有识之士的推 崇，竹笋作为食品具有下列优点：营养丰富、无污染和残毒、低脂减肥、美味可 口、具有一定的保健作用。竹笋的种类繁多，有开发利用价值、可形成生产规模 的不少于3 0 种。全国可产竹笋面积在2 0 0 万公顷以上，年产鲜笋1 2 5 万吨以上。 以竹材、竹笋和其他竹产品为原料可以生产多种多样的天然食品。竹笋和竹笋制 品、竹子食用菌、竹木糖醇和竹叶饮料是目前我国着重开发的食品【“。 在竹子的综合利用中，竹叶的开发明显滞后，基本上还处于原始的初级阶段：绝 大部分自然落叶、腐烂后成为优质的有机肥；在某些地区作为冬春季的牛羊青饲 浙江大学硕士学位论文 料；近年来有部分竹叶、竹屑用作竹子食用菌的培养基原料。竹叶是一类相当 大的潜在资源。 竹子的成分研究，以往多注重于型材和笋的组成，近年来逐渐趋向于营养和 保健作用的研究。日本发现刚竹的竹汁中存在微量的锗和硅，具有通便作用，能 使人的血色好转。从箬竹属四种竹叶中均提得多糖体b 硼f 0 1 i na 、b 两种，能提 高正常和荷瘤动物的y 一球蛋白含量，对s 。艾氏实体瘤有定的抑制科们。国 外从箬竹叶中提取多糖用于治疗食道癌、胃癌等1 1 种晚期癌症，竹叶多糖对晚 期癌的恶液质有防治功效：毛竹笋入药对艾氏腹水瘤和肉瘤有抑制作用，是较好 的营养防癌物【7 j 。 竹子的医疗作用早已为我国人们所认识，淡竹叶和淡竹沥是中医一味传统的 清热解毒药【b l 。本草求真日：“竹叶据书载，凉心缓脾、清痰止咳，为治上焦 风邪烦热、咳逆喘促、呕秽吐血、一切中风惊痫等症，无非因其轻能解上、辛能 散郁、甘能缓脾、凉能入心、寒能疗热故耳”。竹沥具有镇咳、祛痰、清肺热等 功效，对其化学成分的研究表明其中除含氨基酸、糖类之外，还含有愈创木酚、 甲酚、苯酚、甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸等酚酸类组分州。 根据中药学的原理，清热解毒药的主成分多为黄酮和酚酸组分。近年来我国 植物研究工作者分别在散生和丛生竹叶中检出了黄酮成分1 0 】。 1 2 黄酮类物质介绍 1 2 1 概述 黄酮类化合物广泛存在于自然界，是一类重要的天然有机化合物。其不同的 颜色为天然色素家族添加了更多的色彩。这类含有氧杂环的化合物多存在于高等 植物及羊齿类植物中。苔类中含有的黄酮类化合物为数不多，而藻类、微生物、 细菌中没有发现黄酮类化合物的存在。黄酮类化合物的存在形式既有与糖结合成 苷的，也有游离体。 黄酮类化合物如此广泛分布于植物界中，而且生理活性多种多样，引起了国 内外的广泛重视，研究进展很快。仅截至到1 9 7 4 年为止，国内外已发表的黄酮 类化合物共1 6 7 4 个( 主要是天然黄酮类，也有少部分为合成品，其中苷元9 0 2 浙江大学硕士学位论文 个，苷7 2 2 个) ，并以黄酮醇类最为常见，约占总数的1 3 ，其次为黄酮类，占 总数的1 4 以上，其余则较少见。至于双黄酮类多局限分布于裸子植物，尤其松 柏纲、银杏纲和风尾纲等植物中。截止到1 9 9 3 年统计，黄酮类化合物总数己超 过4 0 0 0 个。 1 2 2 黄酮类化合物的基本骨架： 黄酮类化合物原主要指基本母核为2 一苯基色原酮类化合物，现在则是泛指 两个具有酚羟基的苯环( a 一与b 一环) 通过中央三碳原子相互连结而成的一系 列化合物。 o o 色原酮2 一苯基色原酮c 6 c 3 c 6 1 2 3 黄酮类化合物的分类： 根据中央三碳链的氧化程度、b 一环联接位置( 2 一或3 位) 以及三碳链是 否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类。 表格1 1 黄酮类化台物的分类 名称三碳链部分结构 黄酮类( f l a v o n e s ) 审 o 黄酮醇( n a v o n o i ) 取h o 浙江大学硕士学位论文 二氢黄酮类( n a v a n o n e s ) 卒 。 二氢黄酮醇类( f l a v a n o n o l s ) o l ll 洲 o 花色素类( a n t h o c y a l l j d i n s ) 斌h 黄烷一3 ，4 一二醇类( f l a v a n 一3 ，4 一d i o l s )o i ij 丫入o h o h 双苯吡酮类( x a n t h o n e s ) 卒 。 黄烷一3 一醇类( f l a v a n 一3 一o j s ) 娥h 异黄酮( i s o n a v o n e s ) 礅 o 二氢异黄酮类( i s o f l a v a n o n e s ) 砷 o 查耳酮类( c h a l c o n e s ) v o 6 浙江大学硕士学位论文 二氢查耳酮类( h y d r o c h a l c o n e s ) v o 橙酮类( a u r o n e s ) 联 高异黄酮类( h o m o i s o f l a v o n e s ) 耻 o 此外，尚有由两分子黄酮或两分子二氢黄酮，或一分子黄酮及一分子二氢黄 酮按c c 或c o c 键方式联接而成的双黄酮类化合物。另有少数黄酮类化 合物结构很复杂，如水飞蓟素为黄酮木脂体类化合物，而榕碱及异榕碱则为生物 碱型黄酮。 天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置 及联接方式不同，可以组成各种各样的黄酮苷类。组成黄酮苷类的糖类主要有： 单糖类：d 一葡萄糖、d 一半乳糖、d 一木糖、l 一鼠李糖、l 一阿拉伯糖及d 一 葡萄糖醛酸等。 双糖类：槐糖、龙胆二糖、芸香糖、新橙皮糖、刺槐二糖等。 三糖类：龙胆三糖、槐三糖等。 酰化糖类：2 一乙酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖等。 1 2 4 黄酮类化合物的生物活性1 2 j ： 1 2 4 1 对心血管系统的作用 芦丁、橙皮苷、d 一儿茶素、香叶木苷等有维生素p 样作用，能降低血管脆 性及异常的通透性，可用作防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂。 浙江大学硕士学位论文 h 。、硭h 。r u “n 。s e 、m 8 c 2 h 5 c o o - c h 2 0 o ho 立可定 另据报道，槲皮素等黄酮类化合物对由a d p 、胶原或凝血酶引起的血小板 聚集及血栓形成也有抑制作用。这与一些含有黄酮类成分的活血化淤类中草 药的作用机制可能有某些程度的内在联系。 1 2 4 2 抗肝脏毒性作用 从水飞蓟种子中等到的水飞蓟素、异水飞蓟素及次水飞蓟素等黄酮类物质经 动物试验及临床实践均证明有很强的保肝作用。临床上用以治疗急、慢性肝炎、 肝硬化及多种中毒性肝损伤等疾病均取得了较好的效果。另外( + ) 一儿茶素近 来在欧洲也用作抗肝脏毒性药物，对脂肪肝及因半乳糖胺引起的中毒性肝损伤均 有一定效果。 1 2 4 3 抗炎作用 黄酮类化合物，如芦丁及其衍生物羟乙基芦丁、二氢槲皮素以及橙皮苷一甲 基查耳酮等据报道对角叉菜胶，5 一h t 及p g e 诱发的大鼠足爪水肿、甲醇引发 浙江大学硕士学位论文 的关节炎及棉球肉芽肿等均有明显的抑制作用。金养麦中的双聚原矢菊苷元有抗 炎、祛痰、解热、抑制血小板聚集与提高机体免疫功能的作用，临床用于肺脓肿 及其他感染性疾病。 据报道，黄酮类化合物的抗炎作用可能与前列腺素生物合成过程中的脂氧化 酶受到抑制有关。 此外，羟乙基芦丁及棉花皮苷对胃溃疡似有治疗及预防作用。 1 2 4 4 雌性激素样作用 染料木素、金雀花异黄素( 5 ，7 一二羟基一4 一甲氧基异黄酮) 、大豆素等 异黄酮类物质均有雌性激素样作用，这可能是由于它们与己烯雌酚结构相似的缘 故i 。5 1 。 h o o r 2 h o r 1 = r 2 = h 大豆素 r 1 = o h ，r 2 = h ，染料木素 r 1 - o h ，r 2 = c h 3 ，金雀花异黄紊 1 2 4 5 抗菌及抗病毒作用 己烯雌酚 o h 木犀草素、黄芩苷、黄芩素等均有一定程度的抗菌作用。近来还有槲皮素、 桑色素、二氢槲皮素及山柰酚等抗病毒作用的报道1 6 】。 1 2 4 6 泻下作用 如中药营实中的营实苷a 有致泻作用。 1 2 4 7 解痉作用 异甘草素及大豆素等具有类似罂粟碱解除平滑肌痉挛样的作用。大豆苷、葛 根黄素等葛根黄酮类成分可以缓解高血压患者的头痛等症状。 此外，有些黄酮类化合物具有止咳、祛痰平喘作用，其平喘作用与分子中的a 、 b 一不饱和酮结构有关。还据报道，有些黄酮类化合物对环核苷磷酸二酯酶具有 一定程度的选择性抑制作用，且多数黄酮苷元的抑制作用要比黄酮苷强 。7 】。 由于黄酮类化合物在植物界中分布很广，甚至在人类日常生活中用到的粮食、蔬 菜以及水果中也有相当大的含量。因此有的学者认为，黄酮类化合物与仅在有限 浙江大学硕士学位论文 数量植物中分布的生物碱类不同，不大可能期望它们具有显著的生理活性。但近 期分子生物学的研究结果显示某些黄酮类化合物有着显著的生理活性【。8 】。 1 2 5 黄酮类化合物的理化性质及显色反应”i 不论在黄酮类化合物提取分离方面还是在其结构测定的研究方面，黄酮类化 合物的理化性质及其颜色反应都发挥着谱学技术所替代不了的作用。 1 2 5 1 性状 黄酮类化合物多为结晶性固体，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末。游离的 各种苷元母核中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则 无光学活性。苷类由于在结构中引入糖的分子，故均有旋光性，且多为左侧。黄 酮类化合物的颜色与分子中是否存在交叉共轭体系及助色团( 一o h 、o c h 3 等) 的种类、数目以及取代位置有关。以黄酮为例来说，其色原酮部分原本物色，但 在2 一位上引入苯环后，即形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭 链延长，因而出现颜色。一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄黄色， 查耳酮为黄橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，因不具有交叉共轭 体系或共轭链短，故不显色( 二氢黄酮及二氢黄酮醇) 和显微黄色( 异黄酮) 。 显然，在上述黄酮、黄酮醇分子中，尤其在7 一位及4 一位引入一0 h 及一 0 c h 3 等助色团后，则因促进电子移位、重排，而使化合物的颜色加深。但一o h 、 一o c h 3 ，引入其他位置则影响较小。 花色素及其苷元的颜色随p h 不同而改变，一般显红( p h 8 5 ) 等颜色。 1 2 5 2 溶解性 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态( 营或苷元、单糖苷、双糖苷或三 糖苷) 不同而有很大差异。 一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机 溶剂及稀碱水溶液中。其中黄酮、黄酮醇、查耳酮等平面性强的分子，因分子与 分子间排列紧密，分子间引力较大，故更难溶于水；而二氢黄酮及二氢黄酮醇等， 因为非平面性分子，故分子与分子问排列不紧密，分子间引力降低，有利于水分 子进入，溶解度稍大。 浙江大学硕士学位论文 x o r h o r = h ，二氢黄酮 r = o h ，二氢黄酮尊花青素 至于花色苷元( 花青索) 类虽也为平面性结构，但因以离子形式存在，具有 盐的通性，故亲水性较强，水溶度较大。 黄酮类苷元分子中引入羟基，将增加在水中的溶解度；而羟基经甲基化后， 则增加在有机溶剂中的溶解度。例如，一般黄酮类化合物不溶于石油醚中，故可 与脂溶性杂质分开，但川陈皮素( 5 ，6 ，7 ，8 ，3 ，4 一六甲氧基黄酮) 却可 溶于石油醚。 黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶度即相应加大，而在有机溶剂中的溶解 度则相应减小。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中：但难溶或不 溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长，则水溶度越大。 另外，糖的结合位置不同，对苷的水溶度也有一定影响。 1 2 5 3 酸碱性 ( 1 ) 酸性 黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、 甲酰胺及二甲基甲酰胺中。 由于酚羟基数目及位置不同，酸性强弱也不同，以黄酮为例，其酚羟基酸性 强弱顺序依次为： 7 ，4 一二0 h 7 或4 o h 一般酚o h 5 - o h 此性质可用于提取，分离及鉴定工作。 ( 2 ) 碱性 y 一毗喃环上l 一氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性，可与 强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，加水后即可以分解。 黄酮类化合物溶于浓硫酸中生成的盐，常常表现出特殊的颜色，可用于鉴别。某 些甲氧基黄酮溶于浓盐酸中显深黄色，且可与生物碱沉淀试剂生成沉淀【2 0 】。 。，。l 浙江大学硕士学位论文 1 2 5 4 显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及y 一吡喃酮环有关。有关的 显色反应见表1 1 。 表格1 2 黄酮类化合物颜色反应 黄酮黄酮醇二氢黄酮查耳酮异黄酮 可见光下灰黄灰黄无黄色无 紫外光下红棕或黄亮黄或黄无棕黑紫或灰黄 棕绿 n h 3 可见光黄黄无黄或橙红无 紫外光黄绿或暗 亮黄无或灰黄 暗红或紫紫或灰黄 紫 行 a l c l 3可见光 灰黄黄无黄或黄橙无 紫外光黄绿黄或绿黄绿或蓝橙黄 臼 碳酸氢钠亮黄黄棕或蓝绿或灰黄红或橙灰绿 浓硫酸深黄或橙深黄或橙橙到红 洋红或橙 黄 色 红 盐酸+ 镁粉黄至红红到紫红紫或蓝 无 黄 盐酸+ 锌粉 红 紫红紫红 无无 盐酸+ 钠粉一 红 黄到淡红红淡黄粉红 力( 硼酸化钠无无洋红 无无 醋酸镁亮黄亮黄亮蓝亮黄亮黄 柠檬酸 绿黄 亮绿黄 无黄无 氢氧化钠溶液 黄深黄黄到橙橙到红黄 1 3 植物提取中常有的几种杂质的处理1 植物提取中往往伴随着一些杂质的产生，这些杂质常给分离工作带来很大麻 烦，而要除去它们有时是很困难的。由于杂质性质不同，除去的方法也不相同， 下面对常见的几种杂质的除去作一些简要介绍。 浙江大学硕士学位论文 1 3 1 鞣质 鞣质是一种有涩味的，能与生物碱和蛋白质产生水不溶性沉淀的多酚性化合 物，能溶于水和酒精，不溶于苯、氯仿等有机溶剂，因此水或酒精提取液中常杂 有大量的鞣质，对提取亲水性成分往往影响很大。除去鞣质的方法大致有下列几 种： ( 1 ) 明胶沉淀法：样品水溶液加4 明胶水溶液，至沉淀完全，过滤，滤液减 压浓缩至小体积，加3 5 倍酒精，使过量明胶沉淀，然后过滤除去沉淀。如果 明胶尚未除尽，可将滤液浓缩后，再用酒精沉淀一次。也可以将加明胶沉淀后的 混悬液，于水浴上加热，不断搅拌沉淀逐步凝结，将上清液倾出，减压浓缩， 再按前述方法除去过量明胶。 ( 2 ) 生物碱沉淀法：常用的是咖啡碱，其他生物碱及吡啶也可用。样品水溶液 加入1 5 咖啡碱水溶液至沉淀完全，过滤，滤液用氯仿振摇，除去过量的咖啡 碱( 要注意水溶液中其他成分能否被氯仿提出) ，即得除去鞣质的水溶液。 ( 3 ) 醋酸铅沉淀法：试液中加入饱和醋酸铅水溶液至沉淀完全，鞣质被沉淀出 来。此法缺点是缺乏专一性，除了鞣质以外，其他许多物质也能被沉淀，也可用 其他金属盐作沉淀剂。 ( 4 ) 氨水沉淀法：将含有鞣质的乙醇液，加氨水调节到合适的p h 至沉淀完全， 过滤即可。 1 3 2 叶绿素 叶绿素是植物中普遍存在的绿色色素，叶中含量最高，能溶于一般有机溶剂， 较难溶于水。用水提取时，水提取液中的叶绿素可用苯或氯仿抽提除去。如用酒 精提取，酒精浓缩液加水，放置冰箱，叶绿素常可沉淀出来。如果叶绿素不能析 出，可用苯或汽油抽提除去。如果生物碱与叶绿素共存，可用酸水处理，生物碱 进入酸水，叶绿素不溶。用铅盐法也可除去叶绿素。 叶绿素能溶于碱水，有时可用碱水处理，除去叶绿素。但这只是有效成分不溶于 碱或对碱稳定时才能采用。 浙江大学硕士学位论文 1 3 3 油脂、蜡和树脂 一般在提取之前，先用石油醚和苯提取，把这些物质除去。如果不预先处理， 直接用酒精提取，提取液蒸去大部分酒精后用石油醚或苯抽提可除去油脂和蜡 等。 1 3 4 蛋白质 用有机溶剂提取时，蛋白质不会被提出。用水提取时，蛋白质可以用酒精或 甲醇沉淀除去，也可用铅盐除去，或者水提液加热煮沸，使蛋白质变性沉淀出来， 也是一种简便的方法。 1 3 5 无机盐 用有机溶剂提取时，无机盐一般不会被提出来，但有些无机盐( 如硝酸钾) 能溶于甲醇或乙醇。 少量无机盐一般不影响分离，有时水提液中有大量无机盐，一般可将水提液 蒸于，加无水酒精或甲醇提取有机成分。如果有效成分溶于水，不溶于酒精就不 能用这种方法。如果有效成分溶于乙酸乙酯，氯仿等则可用它们来萃取水液，无 机盐留在水液中。 1 3 6 糖和淀粉 用有机溶剂提取时，淀粉不会被提出，用丙酮、甲醇、乙醇等极性溶剂提取 时，有时会带出少量糖。许多植物的根含有大量的糖和淀粉，若用水提取时，水 提液中含有大量的糖和淀粉，可将水液蒸干，用无水酒精处理，糖和淀粉不溶， 可被除去，若有效成分溶于乙酸乙酯、氯仿等，则可用它们萃取水液，将有效成 分提出。 1 4 竹叶黄酮组成的特点 张英2 2 1 等选择桂竹作为研究对象，从中分离、纯化和鉴定了2 1 种黄酮类化 浙江大学硕士学位论文 合物，其中2 0 种是黄酮，未发现黄酮醇和其他黄酮类化合物( 除1 种从紫外光 谱看类似二氢黄酮) 。这与李升峰等【2 3 】对1 8 种散生竹的黄酮类化合物组成所作 的定性扫描结果相同。 挂竹黄酮中数量较大的是荭草苷和异荭草苷类，除了本犀草苷、牡荆苷和洋 芹苷外，还含有相当种类和数量的含有4 一o h 的黄酮。文献中【2 3 】也提到1 3 种 散生竹中有含4 o h 黄酮的存在。桂竹中检出的1 0 种含有4 一o h 的黄酮中， 除了两种3 ，4 ，7 一三羟基一黄酮一7 一糖昔以外，其余8 种的结构中既无c 3 和 或c 5 一o h ，也无a 环和或b 环邻二羟基，在常规的比色法测定时不显色，故 导致所得到的总黄酮数值低于实际含量。 1 。5 黄酮类化合物的精制 1 5 1 溶剂萃取法 1 5 1 1 液液萃取技术简介 液液萃取是种从溶液中提取和纯化物质的传统的化工单元操作，其方法是 选择一种溶剂使混合物中欲分离的组分溶解于其中，其余组分则不溶或少溶而获 得分离。它已广泛地应用于原予能、湿法冶金、化工和医药等工业部门。利用溶 剂萃取技术从发酵液中提取抗生素也已有四十多年的历史。液液萃取具有选择性 好、处理量大、设备较简单、易放大并可连续操作等优点。近年来，随着科学技 术的发展，许多新的液液萃取技术相继出现，如：双水相萃取、反胶团萃取、液 膜分离、膜萃取和超临界萃取等等。与精馏、吸附与离子交换、结晶等分离操作 比较，溶剂萃取的优点为：( 1 ) 两相可变的物理一化学因子多，利于实现多组分 的分离；( 2 ) 不依赖于组分的挥发度，能分离挥发度相近的物质；( 3 ) 两流动相 便于实现多级连续逆流操作：( 4 ) 能耗低：( 5 ) 操作条件温和，可以减低药物活 性的破坏。上述优点决定了萃取技术的生命力。 一般采用萃取的情况：( 1 ) 溶质a 在原溶剂中的溶解度很小而萃取剂b 又 为易挥发组分时。( 2 ) 恒沸物或沸点相近组分的分离。( 3 ) 需分离的组分不耐热， 蒸馏时易分解、聚合或发生其他变化。 萃取剂的选择：萃取法是根据溶剂在原溶液和萃取剂中的相对溶解度差别对 浙江大学硕士学位论文 溶质进行分离的。 ( 1 ) 选择性好。即萃取剂应对溶质的溶解度大而对稀释剂的溶解度小，即萃取 剂的选择性系数要大，这样对传质分离有利。 ( 2 ) 萃取相与萃余相易分离。萃取后形成的萃取相与萃余相是两个液相，此二 液相应易于分层。对此，一是要求萃取剂与稀释剂之间有较大的密度差；二是要 求二者之间的界面张力适中。界面张力过小，则分散后液滴不易凝聚，对分层不 利；界面张力过大，则又不易形成细小的液滴，对两相的传质不利。 ( 3 ) 萃取剂的回收。萃取相与萃余相经分层后常用蒸馏方法脱除萃取剂以循环 使用，因此，要求萃取剂s 对其他组分的相对挥发度大，且不形成恒沸物。 1 5 1 2 液液萃取技术在黄酮粗提物精制中的应用 利用黄酮类化台物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精 制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝 h 素等脂溶性色素。而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉 淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还 可以收到分离苷和苷元和极性苷元与非极性苷元的效果。 吕丽爽口4 1 等将乙醇提取物浓缩后，加入缓冲液，利用等电点沉淀法去除蛋 白质，再用乙酸乙酯萃取。最后用石油醚沉淀得到纯度为9 5 6 的产品，收率为 1 4 4 。但该工艺路线较为复杂，操作困难，工业化生产不易。 中国科学院华南植物研究所的魏孝义2 5 1 等人用6 0 乙醇提取植物中的原花青 素，减压浓缩后加入4 5 倍量的丙酮沉淀，上清液经减压浓缩干燥即得到含原 花青素6 7 左右的产品，收率为5 5 。 张英等研究的工艺，它是以竹叶为原料，将竹叶洗净、烘干、破碎，用2 0 4 0 体积百分浓度的甲醇或乙醇为溶剂回流提取，提取液浓缩后物理除杂，再用 丁醇或戊醇液液萃取，萃取液减压浓缩后再进行下一步的纯化工艺f 2 。 冯宝树f 2 7 1 等人通过稀乙醇溶液浸液提取为基础，采用吸附性树脂进行分离去杂， 并结合使用少量的溶剂萃取和少量的聚酰胺精制，便可得到山楂总黄酮含量高于 8 0 的产品，并具有无毒害，成本低的优点。 浙江大学硕士学位论文 1 5 2 碱提取液沉淀法 黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故 可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便 易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷提取都应用了这个方法。现以从槐米中提取芦丁 为例说明该法的操作过程。槐米加约6 倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳 至p h 8 9 ，在此p h 条件下微沸2 0 3 0 分钟，趁热抽滤，残渣再用4 倍量的水 煎一次，趁热抽滤。合并滤液，在6 0 7 0 的条件下，用浓盐酸将合并滤液调 至p h 为5 ，搅匀后静置2 4 小时，抽滤。用水将沉淀物洗至中性，6 0 干燥得芦 丁粗品，用沸水重结晶，7 0 8 0 干燥得芦丁纯品1 2 引。 曾文辉等在用热水提取黄酮，浓缩后，醇沉除去果胶等杂质，选取黄酮， 再转换为水相作介质，利用黄酮易溶于水的特性，用碱液溶解黄酮，除去杂质， 酸沉淀得粗黄酮，再用乙醇溶解，冷水重结晶，最后8 0 真空干燥至恒重得黄 酮。 1 5 3 炭粉吸附法 主要适用于苷类的精制工作。通常，在植物中的甲醇粗提物中，分次加入活 性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸干炭 末，依次用沸水、沸甲醇、7 酚水、1 5 酚醇溶液进行洗脱。对各部分洗脱液 进行定性检查。通过对b a p t i s i al e c o n t e i 中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄 酮苷类可用7 酚水洗下。洗脱液经减压蒸发浓缩至小体积，再用乙醚振摇除去 残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。 1 6 黄酮类化合物的分离一柱色谱法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外 也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。 浙江大学硕士学位论文 1 6 1 硅胶柱色谱 硅胶是一种常用的极性吸附剂，其主要有优点是惰性、吸附量大和容易制备 成各种类型的硅胶。硅胶的结构是无定形的，为多孔性物质，分子中具有硅氧烷 的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的 含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸 着的水分增加而降低。若吸水量超过1 7 ，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但 可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅胶加热至1 0 0 1 1 0 时，硅 胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至5 0 0 时，硅胶表面的硅 醇基脱水缩合转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活性，就不再有吸 附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温 度进行( 一般在1 7 0 以上即有少量结合水失去) 。 硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种 弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的 碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。 此法应用范围最广，主要适用于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度 甲基化( 或乙醚化) 的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于 分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。供试硅胶中混存的微量金 属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。 沈阳药科大学的陈宗等【3 0 】对淡竹叶的提取物溶剂萃取初步分离后，分别用 氯仿一甲醇作为洗脱系统，用硅胶柱对乙酸乙酯相和正丁醇相进行分离，再用乙 醇等重结晶，得到化合物5 ，4 一二羟基一3 ，5 一二甲氧基一7 一b d 一葡萄 糖氧基黄酮和牡荆苷。 1 6 2 聚酰胺柱色谱 聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物质，色谱常用的是聚己内酰胺，其结构 浙江大学硕士学位论文 协t 弋且n i i h 2h zh z i 如下： l - j “ 浙江大学硕士学位论文 可用柱层析或纸层析法进步分离。张英等采用制各型的单向纸层析法对聚酰胺 层析后的较纯的黄酮进行纯化后得到几种黄酮单体。 1 6 3 葡聚糖凝胶( s e p h a d e xg e l ) 柱色谱 对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：s e 口h a d e x g 型及 s e p l l a d e x l h 2 0 型。用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是： 分离游离黄酮时，主要靠吸附。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离 酚羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。在洗脱时，黄酮 苷类大体上是按分子量由大到小的顺序洗出柱体的。 吉林农业大学刘可越等【3 2 】对垂柳叶中的有效成分进行研究，7 0 的丙酮水 提取物蒸去丙酮，水液部分用乙醚提取得固体后，上s e p l l a d e x l h 2 0 柱，以水 一乙醇溶剂系统梯度洗脱，得到八个缠分，其中一组分为黄酮类物质槲皮素。 1 6 4 活性炭柱色谱 活性炭是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用 乙醇洗，再以水洗净，于8 0 干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选 用颗粒活性炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂并装柱，以 免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性 炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱， 而有机溶剂则较强。例如以醇水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增 加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附 力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族 物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。 1 6 5 氧化铝柱色谱 氧化铝可能带有碱性( 因其中可混有碳酸钠等成分) ，对于分离一些碱性中 草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、 内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如 浙江大学硕士学位论文 异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中的碱性杂质可用水洗至中性，称为中 性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，不适用于酸性成分的分离。用 稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化 铝颗粒表面带有n 0 ”或c l 一的阴离子，从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性 成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝，用于柱层析的， 其粒度要求在1 0 0 1 6 0 目之间。粒度大于l o o 目，分离效果差，小于1 6 0 目， 溶液流速太慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在l ：2 0 5 0 之间， 层析柱的内径与柱长比例在1 ：1 0 2 0 之间。 在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每半1 小时内流 出液体的毫升数与所用吸附剂的重量( 克) 相等为合适。 1 7 高效液相色谱在分离分析黄酮类化合物中的应用 高效液相色谱具有分离效能高，分析速度快，样品用量少等优点，特别适用 于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。例如生化物质、药物、离子型化 合物及天然产物。黄酮类作为重要的天然产物成为现代h p l c 最早分析的样品之 一。八十年代以来，h p l c 在黄酮类中的应用获得了飞速的发展【3 4 1 ，其中反相 高压液相色谱( r p 一 玎，l c ) 扮演着中心角色口”。 黄酮类分析中以c 1 8 柱应用最为普遍，过去主要用于分析极性较大的苷和 苷元，现亦用于低极性的苷元，其次是c 8 柱。甲醇一水和乙腈一水体系一直是 优选的流动相。近来来，p i e 钍a 对丙醇一环醚( t h f 或二氧杂环己烷) 水体系 在药用植物提取物黄酮类分析中的应用做了一系列研究0 5 “】，证明此体系在许多 情况下比传统的甲醇( 乙腈) 一水体系优越。 采用制各柱和半制备柱、用h p l c 来分离和制备黄酮单体是最为先进和有效 的方法，但需要相当的设备和标准品。所以应用方面仍然受到很大的限制。张英 1 等采用聚酰胺柱色谱分离，纸色谱纯化，然后用紫外光谱和质谱等来鉴定黄酮 结构，仅用田l c 辅助检测分离过程中单体的纯度。而秦燕【4 2 l 等建立了h p l c 测定银杏黄酮提取物中的三种黄酮类化合物含量的优化方法。他们先把用浓硫酸 或浓盐酸黄酮苷水解后稀释，由反相h p l c 测定黄酮含量。但是酸性溶液对仪器 存在很严重的腐蚀问题，对仪器影响很大。 浙江大学硕士学位论文 第二章总黄酮的浸取 根据同实验室孙国金h 卅的研究得出，各影响因素对浸取影响大小依次为： 溶剂 温度 粉末粒径，搅拌速率。所以我们主要考察不同溶剂对竹叶黄酮浸取效 率的影响。 乙醇溶液是目前国内普遍使用的浸取剂，而正丁醇水两相系统则可以看成 是一个浸取萃取耦合的体系，是一种值得研究的萃取系统。相比较之下，水的 渗透浸润性能很好，若作为浸取剂则是种洁净和廉价的浸取剂。所以本文主要 比较水、乙醇溶液和正丁醇水两相系统这三种浸取溶剂在不同浸取条件下( 浓 度、温度、浸取时间等) 得到的总黄酮得率的大小，为竹叶黄酮类物质的浸取选 取较优的浸取剂。 2 1 原料和装置 2 1 1 原料和试剂 竹叶：2 0 0 3 年秋季采自浙江新昌 竹叶经自然风干，粉碎后筛分，选取6 0 一8 0 目的竹叶粉末，密封置阴暗干燥处 供以后实验用。 自来水、去离子水、芦丁( 芦丁是黄酮类物质的一种，又称芸香苷，购于杭州华 东医药公司，实验中应用芦丁标准品配置标准溶液来测定黄酮类物质的总含量。) 表2 1 主要试剂表 试剂分子式分子量生产厂家 无水乙醇c 2 h 5 0 h 4 6 0 7 上海振兴化工一厂 氯化铝a 1 c 1 3 1 3 3 5上海振兴化工一厂 醋酸酐 ( c h 3 c o ) 2 0 1 0 2 0 9 杭州化学试剂有限公司 冰醋酸c 2 h 4 0 2 6 0 0 5 杭州高晶精细化工有限公司 正丁醇c 4 h 9 0 h 7 4 1 4 杭州高晶精细化工有限公司 浙江大学硕士学位论文 2 1 2 实验仪器 5 0 l 恒温槽( 上海实验仪器厂) f z l 0 2 植物粉碎机( 河北黄骅齐家务科学仪器厂) 电子天平 u c 0 1 0 紫外分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) 可见分光光度计 g s1 2 2 电子恒速搅拌器( 上海电子管十一厂) 2 1 3 实验装置 固液萃取装置，采用恒温槽进行恒温，圆底烧瓶内搅拌提取，见图2 1 。 图2 l 竹叶浸取装置图 2 2 实验方案 2 2 1 溶剂提取 有机溶剂提取法，这是大多数情况下采用的方法。溶剂提取法是选择适当溶 剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。一般而言，植物成分中，萜类、甾 体等脂环类及芳香类化合物因为极性较小，易溶于水及含水醇中；至于酸性、碱 性及两性化合物，因为存在状态( 分子或离子形式) 随溶液而异，如溶解度将随 p h 而改变。但是，从药材中提取活性成分时，由于存在多种成分间的相互助溶 作用，情况要复杂得多。因此，从药材中提取活性成分很难有一个固定的模式。 通常须根据提取要求、目的成分及杂质的性质差别以及溶剂的溶解能力来确定。 一般，可将固体药材按极性递增方式，用不同的溶剂，如石油醚或汽油( 可提出 浙江大学硕士学位论文 油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类化合物) 、氯仿或乙酸乙酯( 可 提取游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元等中极性化合物) 、丙酮或乙醇、 甲醇( 可提取出苷类、生物碱盐以及鞣质等极性化合物) 及水( 可提取氨基酸、 糖类、无机盐等水溶性成分) 一次进行提取。得到的各个馏分经活性测试确定有 效部位后再做进一步分离。另外，也可以将药材直接用乙醇、含水乙醇或含水丙 酮提取，提取液浓缩成膏，拌以硅藻土等辅料，减压干燥成粉后，再用上述的不 同溶剂进行分步处理。 2 2 2 浸提溶剂的选择 由目前文献报道来看，水、碱液、乙醇溶液等适用于极性较大，水溶性基 团占优势的黄酮类物质。丙酮，乙酸乙酯等适用于极性小，脂溶性基团占优势的 黄酮类物质。 在目前国内外的研究过程中，乙醇溶液是国内外普遍使用的竹叶黄酮浸取 剂，而正丁醇水两相系统则可以看成是一个浸取萃取耦合的体系，在浸取过程 中有可能达到浸取一萃取的两个过程，达到黄酮类物质的初步分离，是一种值得 研究的萃取系统。相比较之下，水的渗透浸润性能很好，若作为浸取剂则是一种 洁净和廉价的浸取剂。所以本文主要打算比较水、乙醇溶液和正丁醇水两相系 统这三种浸取溶剂在不同浸取条件下( 温度、浸取时间等) 得到的总黄酮得率的 大小。 2 2 3 分析方法的确定 目前在植物成分定量分析中，国内主要采用的是比色法和高效液相色谱法。 比色法是根据比尔定律，以选定的标准样品，做出标准曲线，由吸光系数与溶液 浓度成正比的特性，测出溶液的吸光度从而求出溶液浓度。 其中常用的测定黄酮的分光光度法有紫外分光光度法，n a n 0 2 、a l ( n 0 3 ) 3