天然药物化学黄酮类.ppt

天然药物化学黄酮类,黄酮与生物碱为来自于植物的两大类天然产物。已知化学结构的黄酮类物质至少有4000余种，黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如槐米中的芦丁和陈皮中的橙皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。,由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定，有扩张冠状血管、增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性。护肝，解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎，肝硬化。,自然界中以黄酮醇类最为常见，约占总数的三分之一，其次为黄酮类，占总数的四分之一以上，其余则较少见。至于双黄酮类多局限分布于裸子植物，尤其松柏纲，银杏纲和凤尾纲等植物中。,第一节基本结构和分类一、基本母核结构,一、基本母核结构,泛指两个苯环（A环与B环）通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物。,基本骨架：C6-C3-C6,存在形式,在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,二氢查耳酮类（Dihydrochalcones）,黄烷-3，4-二醇类（Flavan-3,4-diols）,查耳酮类（Chalcones）,二氢黄酮醇类（Flavanonols）,二氢异黄酮类（Isoflavanones）,二氢黄酮类（Flavanones）,异黄酮类（Isoflavones）,黄酮醇类（Flavonol）,黄酮类（Flavones）,三碳链部分,名称,名称,三碳链部分,黄烷-3-醇类（Flavan-3-ols）,橙酮类（Aurones),双苯吡酮类（Xanthones),第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（一）黄酮类flavones,黄酮黄酮醇,母核：,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,木犀草素（luteolin）黄芩苷抗菌作用，存在于菊花等植物中,（一）黄酮类flavones唇形科、爵床科、菊科等,代表化合物：,黄芩,来源于唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的根。功能主治消热燥湿，泻火解毒，止血，安胎。用于湿温、暑温胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦渴，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。,黄芩苷（贝加灵）,本品为中药黄芩的主要有效成分，有消炎抗菌、退黄、降谷丙转氨酶(ALT)及抗过敏的作用。临床用于急性、慢性迁延性和慢性活动性肝炎，也可用于肾炎、肾盂肾炎及过敏性疾病。,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（一）黄酮醇类（flavonol）存在于木本植物的花与叶中,槲皮素用于治疗气管炎抗炎及止咳祛痰作用,用于治疗毛细血管脆弱引起的出血病，并用作高血压的辅助治疗剂。,3芸香糖芦丁（Rutin）（芸香苷）,槐米,来源于豆科植物槐（SophorajaponicaL）的干燥花蕾，有凉血止血、清热泻火之功能。其干燥成熟果实称槐角，有润肠通便、止血凉血的功能。,芦丁,具有抗炎作用；维生素P样作用，具有维持血管抵抗力、降低其通透性、减少脆性等作用。主要用于脆性增加的毛细血管出血症，也用于高血压脑病、脑出血、视网膜出血、出血性紫癜、急性出血性肾炎、再发性鼻出血、创伤性肺出血、产后出血等的辅助治疗。,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（二）二氢黄酮（醇）类flavanoes（flavanononls）存在于芸香科、豆科等,二氢黄酮二氢黄酮醇,第一节基本结构和分类二、结构分类,橙皮素,橙皮苷,二、结构分类,（二）二氢黄酮（醇）类flavanoes（flavanononls）,菊科水飞蓟属植物水飞蓟CarduusmarianusL.，的全草及瘦果。对急性或慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝、胆管炎均有良好疗效,水飞蓟素,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（三）异黄酮（isoflavones）、二氢异黄酮（isoflavanones)类,母核：,异黄酮,二氢异黄酮,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,大豆素,大豆苷,葛根素,（三）异黄酮（isoflavones）、二氢异黄酮（isoflavanones)类,大豆异黄酮,大豆异黄酮是一种植物雌激素，系由大豆等豆类植物中提出.大豆异黄酮对低雌激素水平者，表现弱的雌激素样作用，可防治一些和激素水平下降有关的疾病的病症，如更年期综合征、骨质疏松、血脂升高等；对于高雌激素水平者，表现为抗雌激素活性，可防治乳腺癌、子宫内膜炎，具有双向调节平衡功能。,葛根,为豆科植物野葛Puerarialobata（Willd）ohwi的根。解肌退热，透发麻疹，生津止渴，升阳止泻。用于外感表证。用治外感表证:发热重，恶寒轻，头痛鼻干，口微渴苔薄黄之证，用于麻疹不透。故可用治麻疹初起，表邪外束，疹出不畅。用于热病口渴，阴虚消渴。本品甘凉，有生津止渴之功，用治热病津伤口渴。,葛根素具有改善心脑血管循环、降低血糖、抗高血压及动脉硬化、提高机体免疫力等多种生物活性，还具有提高视力、迅速醒酒及雌激素样作用。作为新型的天然功效因子，葛根素在食品工业、医药工业、日用化工工业等方面具有重要的作用。我国于1993年批准葛根素注射液作为新药用于临床治疗心脑血管疾病，商品名为普乐林。,葛根素,葛根素独特的植物雌激素功效能减轻因衰老和雌激素水平下降导致的各种症状，如乳房下垂、皮肤起皱、皮肤活力下降、白发等，因此被用于制造丰乳霜、眼霜、护肤霜等。,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（四）查耳酮（chalcones）、二氢查耳酮（dihydrochalcones）类,母核：,查耳酮,二氢查耳酮,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,在酸性条件下，2-OH查耳酮转变为无色的二氢黄酮，碱化后，转为深黄色的2-OH查耳酮，二者可相互转化。,2-OH查耳酮,二氢黄酮,（四）查耳酮、二氢查耳酮类,红花,菊科植物红花的花。【功效】：活血通经，去瘀止痛。治经闭，难产，死胎，产后恶露不行、瘀血作痛，痈肿，跌打损伤。,红花甙（Carthamin）,活血化瘀。用于治疗闭塞性脑血管疾病，冠心病，脉管炎。,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（五）双黄酮,（二分子黄酮衍生物聚合生成的二聚物），多分布于裸子植物，尤以松柏纲、银杏纲和凤尾纲等植物中最普遍。,C-C连结C5-C8、C8-C8连接方式醚链连结C4-O-C6,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（五）双黄酮,银杏叶中银杏素（gikgetin）具有解痉、降压、扩冠作用。,银杏,银杏树是一种古老的植物，约二亿年前即已开始出现于地球上，是现存种子植物中最古老的植物，第四世纪冰川以后成为我国独特的树种，在学术界一直被誉为“活化石”。“植物界大熊猫”。银杏叶具有显著的药理活性,仅是黄酮类成分就有20多种。,银杏,对血液循环的作用；通过降低血小板(一个形成动脉硬化的关键因素)粘度、保持其分布均匀，从而直接促进血液循环。对血管的作用能增强动脉、静脉和毛细血管的强度和弹性。中枢神经系统的保护作用。脑和神经系统中自由基被广泛认为是加速衰老的主要原因。银杏促进血液循环，以及对细胞的氧气和葡萄糖的输送；银杏保护细胞免受伤害，并将自由基清除出体外。,目前，对银杏叶重点开发的产品有三类：,第一，药品：银杏注射剂及片剂及胶囊、银杏叶口服液等。用于冠心病心绞痛、脑出血痉挛、高血压、高脂血症、抗衰老等。第二，化妆品：已开发成洗发香波、护发剂、护肤霜等，用于治疗粉刺、痤疮及减肥。第三，保健食品：有巧克力糖、口香糖、米酒、饮料等，具有预防和治疗老年性痴呆、脑中风等作用。,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（六）花色素类（anthocyanidins）,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（六）花色素类（anthocyanidins）,天竺葵素,矢车菊素,飞燕草素,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（七）黄烷醇类黄烷3醇类（flavan3ols）黄烷3、4二醇类（flavan3、4diols）,3醇3、4二醇类,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（七）黄烷醇类,儿茶素抗脂肪肝作用抗癌和Vp样作用,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（八）双苯吡酮类（Xanthones）,芸果香叶中异芒果素（isomengiferin）具有止咳祛痰,第一节基本结构和分类二、结构分类,二、结构分类,（九）橙酮类（奥弄）（aurones）,植物硫磺菊中硫磺菊素（Sulphuretin）,三、黄酮苷,天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，组成黄酮苷的糖类主要有单糖、双糖、参糖、酰化糖。,（一）常用的糖单糖类：DGlu，D半乳糖，D木糖，LRha，L阿拉伯糖，D葡萄糖酸。,第一节基本结构和分类三、黄酮苷,三、黄酮苷,双糖类：槐糖类（glc1-2glu）龙胆二糖(glu1-6glu)芸香糖(rha1-6glu)新橙皮糖(rha1-2glu)刺槐二糖(rha1-6gal),三糖类：龙胆三糖(glu1-6glu1-2fru)槐三糖(glu1-2glu1-2glu)酰化糖：22酰葡萄糖咖啡酰基葡萄糖,第一节基本结构和分类三、黄酮苷,三、黄酮苷,（二）连接位置,黄酮苷中糖的连接位置与苷元的结构类型有关，黄酮醇类:常形成3-、7-、3-、4-单糖苷，或3、7-，3、4-及7、4-双糖苷等.花色苷类:多在3OH连糖或形成3、5二糖苷,第一节基本结构和分类三、黄酮苷,三、黄酮苷,第一节基本结构和分类三、黄酮苷,（三）除O苷外还有C苷,牡荆素（Vitexin）,R=H葛根素R=Xylose葛根黄素木糖苷,二、生理活性,对心血管系统的作用降低毛细血管脆性及异常通透性：芦丁、橙皮苷扩张冠状动脉，治疗冠心病：葛根素降压银杏素抑制血小板聚集及血栓形成红花/银杏素,二、生理活性,二、生理活性,2、抗肝脏毒作用水飞蓟素、（+）-儿茶素3、抗炎作用二氢槲皮素,4、雌性激素样作用大豆素等,5、抗菌及抗病毒作用木樨草素、黄芩苷、黄芩素、槲皮素。,6、泻下作用营石苷A7、解痉作用异甘草素、大豆素,8、止咳，平喘作用,第二节理化性质一、性状,一、性状,1、游离黄酮类化合物：完好的晶型黄酮苷类：无定形粉末,第二节理化性质一、性状,一、性状,3、颜色1）呈色因素：结构中有无交叉共轭体系，助色团（-OH，-OCH3）数目及位置。,第二节理化性质一、性状,一、性状,3、颜色2）呈色规律（1）一般情况下：黄酮醇及其苷类灰黄色到黄色查耳酮二氢黄酮（醇）无色异黄酮微显黄色,（3）花色苷及苷元颜色因pH不同而改变：pH7红色；pH=8.5紫色；pH8.5蓝色,黄色到橙黄色,（2）7、4位引入助色团后颜色加深，其它位引入助色团影响较少。,第二节理化性质二、溶解性,二、溶解性,1、游离黄酮：有极性（含氧基团）；难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂以及稀碱液（具有酸性）不溶于石油醚。,第二节理化性质二、溶解性,二、溶解性,2、黄酮苷类水溶性增加，易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，难溶或不溶苯、三氯甲烷等有机溶剂。水溶性规律：糖链越长，则水溶度越大糖连接位置不同，水溶性不同,可利用此性质，用热水重结晶芦丁。,芦丁热水1200冷水18000,二、溶解性,H2OMeOHEtOHEt2OCHCl3游离黄酮-+黄酮苷+（热）+-,与分子平面性有关：平面性越强，水溶性越差,(水溶性)黄酮（醇）、查尔酮二氢黄酮、二氢黄酮醇花色素,一般Ar-OH5-OH5%NaHCO35%Na2CO30.2%NaOH5%NaOHPH8PH10pH1112pH1314应用于提取、分离及鉴定工作中。,PH梯度萃取,第二节理化性质三、酸性与碱性,三、酸性与碱性,2、酸性,比较下列化合物的酸性大小：,AB,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,一还原反应1、盐酸镁粉反应,1）方法：样品溶于1ml甲醇或乙醇，加镁粉少许，振摇，滴加几滴浓盐酸，1-2分钟内（必要时微热）即可显色。,多数黄酮（醇），二氢黄酮（醇）：显橙色紫红色反应少数黄酮（醇），二氢黄酮（醇）：显紫-蓝色,B环引入-OH,-OCH3，颜色随之加深。,2）对象：,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,一还原反应2、NaBH4反应,NaBH4是对二氢黄酮类化合物专属性较高的一种还原剂，与二氢黄酮类化合物产生红紫色。,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,二金属盐类试剂的络合反应,黄酮类化合物分子中具有下列这些结构,5-OH-4-酮基3-OH-4-酮基邻二酚羟基,常与铝盐(Al3+)，铅盐(Pb2+)，镁盐(Mg2+),锆盐(Zr2+)等试剂反应，生成有色络合物。,反应官能团：3-OH，4-C=O5-OH，4-C=O邻二酚羟基,第三节理化性质四、显色反应,四、显色反应,二金属盐类试剂的络合反应,1、铝盐：试剂：1%AlCl3或硝酸铝溶液现象：络合物为黄色，UV（415nm)灯下有荧光。可用于定性及定量分析。,2镁盐：试剂：醋酸镁甲醇液（Mg(OAC)2)一般在滤纸上进行，喷Mg(OAC)2的甲醇液，加热干燥，在UV灯下观察。,二氢黄酮（醇）:天蓝色荧光,具C5OH色泽更明显。黄酮醇，异黄酮:显黄橙黄褐色。,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,二金属盐类试剂的络合反应,3铅盐:试剂：1%Pb(OAC)2及碱式Pb(OAC)2水溶液现象：络合物为黄红色沉淀。中性Pb(OAC)2可与分子中具邻二酚羟基或兼有3-OH-4C=O或5-OH-4C=O化合物作用。,碱式Pb(OAC)2一般酚羟基均可沉淀，用于提取分离鉴定工作。,第三节理化性质四、显色反应,四、显色反应,二金属盐类试剂的络合反应,4锆盐：（锆枸橼酸反应）用来检查和区分黄酮分子中3、5-二OH,（1）2%二氯氧锆甲醇液（ZrOCl2）（2）2%枸橼酸甲醇液,试剂,有游离的3-或5-OH存在时，均可反应生成黄色的锆络合物.3-OH，4-酮基络合物的稳定性5-OH，4-酮基络合物（仅二氢黄酮醇除外）。当反应液中接着加入枸橼酸后，5-羟基黄酮的黄色溶液显著褪色，而3-羟基黄酮溶液仍呈鲜黄色（锆枸橼酸反应）。,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,二金属盐类试剂的络合反应,5.氯化锶（SrCl2）反应,在氨性甲醇溶液中，可与生成绿色-棕色-黑色,6.FeCl3反应：Ar-OH显色剂,绿色墨绿黑色沉淀,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,三硼酸显色反应,凡具有结构，在无机酸或有机酸条件下与硼酸反应生成亮黄色,H+,H3BO4,亮黄色,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,四碱性试剂显色反应,1、日光及UV下，通过纸斑反应，样品用碱性试剂处理后颜色变化来鉴定黄酮类化合物。常用碱性试剂：氨蒸汽，Na2CO3水溶液,氨蒸汽处理后的色变，置空气中随即褪去，Na2CO3水溶液则不褪色,第二节理化性质四、显色反应,四、显色反应,四碱性试剂显色反应,2、利用碱性试剂反应鉴别分子中某些结构特征,2）黄酮醇类在碱液中呈黄色，通人空气变为棕色,可与其他黄酮类区别,3）黄酮类有或3，4二OH，碱液黄色-深红色-绿棕色,1）二氢黄酮在碱性中开环转为异构体-查耳酮，显橙黄色,橙皮素橙皮查耳酮,用化学方法鉴别A-G,第四节提取分离一、提取方法,一、提取方法,存在形式:花、叶、果：黄酮苷木部坚硬组织：游离黄酮一般用溶剂提取法：,1、黄酮苷类、极性稍大的苷元：丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇提取。2、多糖苷类：沸水提取。3、大多数黄酮苷元：宜用极性较小的溶剂，如：氯仿、乙醚、乙酸乙酯、苯。,选择溶剂：,醇提法热水提取法碱溶酸沉法系统溶剂提取法,1、醇提法,根据苷的溶解特性：（）极性大的苷类或苷元：选用含水乙醇、甲醇（：）。（）极性小的苷元：氯仿、乙醚、乙酸乙酯等，用95%乙醇；选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化的目的。例如：1、植物叶子的醇浸液-石油醚处理，除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。2、药材水溶液-加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。注意事项：避免苷水解，应先破坏酶的活性。,第四节提取分离一、提取方法,一、提取方法,2、热水提取法,主要是苷类，如槐花米中芦丁的提取，利用芦丁的溶解度在沸水（1:200）和冷水（1:10000）中的显著不同。缺点：水中杂质多,第四节提取分离一、提取方法,（二）碱提取酸沉淀法,原理：黄酮类有酚，具有酸性，可溶于碱水溶液，酸化后可析出；饱和石灰水Ca(OH)2，稀Na2CO3，NaOH等。,药材,碱水液,H+,OH-,沉淀（黄酮苷，苷元）,水（水杂，M+）,例：槐花米提取芦丁,第四节提取分离一、提取方法,4、系统溶剂提取法,Pet：色素、油脂等；C6H6：提取多甲氧基黄酮、含异戊烯基等；CHCl3,EtOAc：可提取大多数游离黄酮；EtOH,MeOH：提取多羟基黄酮、双黄酮、查耳酮等；稀醇、沸水：苷类；HCl：提取花色素类。,（一）柱色谱法（二）pH梯度萃取法（三）利用特殊官能团的性质分离,二、分离,第四节提取分离二、分离,二、分离,分离依据,第四节提取分离二、分离,二、分离,层析法,1、硅胶,吸附：主要适于分离异黄酮、二氢黄酮（醇）及高度甲基化或乙酰化的黄酮（醇）。分配：少数情况下，用于极性较大的化合物、多羟基黄酮醇及其苷类。,（1）分离苷元时：用氯仿-甲醇混合溶剂洗脱。,（2）分离苷时：用氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水洗脱。,二、分离,层析法,2、聚酰胺柱层析,原理：通过聚酰胺分子上的酰胺基（）与黄酮分子上的Ar-OH形成氢键缔合而产生吸附。,第四节提取分离二、分离,适用于分离酚类、醌类化合物，各种类型的黄酮类化合物（苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮），蒽醌类化合物。,第四节提取分离二、分离,二、分离,层析法,2、聚酰胺柱层析,吸附力大小,Ar-OH数目Ar-OH位置溶剂情况形成氢键能力（分子平面性情况）,吸附规律：,（）黄酮类化合物酚越多，易吸附，洗脱慢；（）分子中芳香核、共轭双键多，吸附力强；查耳酮二氢黄酮；（）苷元相同时，三糖苷双糖苷单糖苷苷元（）易形成分子内氢键，吸附减弱：间位或对位邻位黄酮；（）结构类型不同，黄酮醇黄酮二氢黄酮异黄酮（）洗脱溶剂对吸附的影响：水甲醇、乙醇丙酮稀或氨水甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下列规律：,（1）甙元相同，洗脱先后顺序一般是：参糖甙双糖甙单糖甙甙元（2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减缓.（3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇（4）分子中芳香核、共轭双键多者则吸附力强，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的行为。,中药粗粉乙醇提取乙醇回收不溶物溶液（树脂、游离黄酮）聚酰胺柱，水、洗脱乙醇液水洗液回收（糖等）总黄酮,聚酰胺的双重色谱性,以含水流动相（如甲醇一水）作洗脱剂，苷比苷元先洗下来。,以有机溶剂作洗脱剂（如氯仿一甲醇）苷元比苷先洗脱下来。,第四节提取分离二、分离,二、分离,层析法,2、聚酰胺柱层析,3、葡聚糖凝胶（Sephadexgel）柱层析,第四节提取分离二、分离,二、分离,层析法,（1）用SephadexLH-20分离游离的黄酮，主要是靠吸附作用，Ar-OH多的化合物极性强，吸附力强，难洗脱。（2）分离黄酮苷，分子筛起主导作用，按分子量由大到小的顺序流出柱体。糖数量多，分子量大，分子筛时，先洗脱下来。,分离黄酮类化合物的机理：双重性,3、葡聚糖凝胶（Sephadexgel）柱层析,Ve为洗脱样品时需要溶剂总量或洗脱体积，Vo为柱子空体积，Ve/Vo越小，化合物越容易洗脱。从表中可以看出，首先洗脱下来的是苷类成分，按照分子筛原理分离，然后是游离黄酮类成分，按照吸附原理分离。,3、葡聚糖凝胶（Sephadexgel）柱层析,第四节提取分离二、分离,二、分离,层析法,常用洗脱剂。碱性水溶液0.1mol/LNH4OH盐水溶液0.5mol/LNaCl醇及含水醇甲醇，甲醇水（不同比例）正丁醇-甲醇3：1乙醇丙酮甲醇水2：1：1氯仿甲醇9：1适用于SephadexLH-20凝胶，羟丙基化的葡聚糖凝胶。,第四节提取分离二、分离,二、分离,pH梯度萃取法,适合于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。,根据Ar-OH数目，位置不同酸性强弱不同而分离,混合物,醚层,乙醚,依次用5%NaHCO37,4二OH5%Na2CO37或4-OH0.2%NaOH一般Ar-OH5%NaOH5-OH萃取,第四节提取分离二、分离,二、分离,官能团不同,1、Pb(AC)2沉淀法具邻二ArOH：中性Pb(AC)2可沉淀不具邻二ArOH：碱式Pb(AC)2可沉淀,应用：除去杂质。分子中有COOH（树胶粘液，果胶，有机酸，蛋白质，氨基酸）或邻二Ar-OH（如鞣质等），可用Pb(AC)2去除。,第四节提取分离二、分离,二、分离,官能团不同,2、硼酸络合法,具邻二ArOH的黄酮可与硼酸络合，生成物溶于水，借此可与之不具有这种结构的化合物分离。实际中，常将各种柱层析法与各种经典方法相互配合应用。,结构测定一般步骤1、色嗅味：黄，橙黄，二氢黄酮，异黄酮无色2、植物来源：豆科，芸香科，菊科，唇形科3、旋光性：二氢黄酮(醇),黄烷醇，苷元有旋光性，苷均有旋光性4、熔点：层析Rf与文献对照5、检识反应6、光谱分析,第五节结构鉴定,第五节结构鉴定一、色谱法,适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物。纸层析在本质上是液液分配层析，利用不同的物质在固定相与流动相之间的分配系数不同而进行分离。固定相：水。流动相：与水不相混溶的有机溶剂。载体：滤纸,(一)、纸层析（PC）法,1、常用的溶剂系统,1）醇性溶剂。（主要依分配作用原理）主要适用于苷元n-BuOH-HOAC-H2O4:1:5上层BAWt-BuOH-HOAC-H2O3:1:1TAW,第五节结构鉴定一、色谱法,(一)、纸层析（PC）法,2）水性溶剂（主要依吸附作用原理）主要适用于苷2-6%HOAC3%NaClHOAC:H2O=60:40,2、检测：,1）UV灯检查：有色斑点，氨蒸汽处理后产生明显颜色变化。2）喷显色剂：2AlCl3甲醇液（UV灯下检查）；1FeCl3-1%K3Fe(CN)6水溶液,3、吸附规律1）非平面性分子，二氢黄酮(醇)，二氢查耳酮亲水性强，用3-5%HAC展开时,Rf=0.1-0.3。,第五节结构鉴定一、色谱法,(一)、纸层析（PC）法,2）平面性分子，黄酮(醇)、查耳酮用3-5%HAC，展开时，Rf0.02几乎停留原点不动。,3)-OH糖苷化后极性增大，故在醇性展开剂中，Rf值相应降低。同一类型苷元，Rf值：苷元单糖苷双糖苷,以BAW系统为例：苷元Rf值0.7以上，苷小于0.7,3、吸附规律,第五节结构鉴定一、色谱法,(一)、纸层析（PC）法,在水或2-8%HOAC，3NaCl或1HCl展开时则顺序颠倒。Rf值：苷元单糖苷双糖苷Rf值：苷0.5以上，糖链越长，Rf值越大。苷元Rf小，几乎原点不动。,第五节结构鉴定一、色谱法,（二）、薄层层析（TLC）法,一般采用吸附薄层层析。常用吸附剂：硅胶、聚酰胺硅胶：游离黄酮展开剂：甲苯甲酸甲酯甲酸（5：4：1）CHCl3-MeOH,聚酰胺：适用范围较广。展开剂：EtOH-H2O,MeOH-H2O,乙腈H2O,丙酮H2O,第五节结构鉴定二、光谱法,（一）、UV,程序,1、测定单纯样品在甲醇溶液中的UV光谱-骨架2、加入一些诊断试剂后测UV光谱常用的诊断试剂：甲醇钠NaOMe醋酸钠NaOAc醋酸钠/硼酸NaOAc/H3BO3三氯化铝AlCl3三氯化铝/盐酸AlCl3/HCl3、若样品为苷，可进行水解，水解后测苷元UV,第五节结构鉴定二、光谱法,（一）、UV,1、黄酮类化合物在甲醇中的紫外光谱图特征,B环桂皮酰系统(cinnamoyl)带300-400nm,A环苯甲酰系统(benzoyl)带240-280nm,第五节结构鉴定二、光谱法,（一）、UV,1、黄酮类化合物在甲醇中的紫外光谱图特征,3、诊断试剂与吸收带的关系,诊断试剂：能使黄酮类的酚离解或形成络合物，导致光谱发生变化，对结构具有诊断意义的的试剂。（）加入各种诊断试剂后，带的位置基本不动，强度有变化；（）加入各种诊断试剂后,带的位置移动有一定的规律：,一、黄酮和黄酮醇类,1、在甲醇中的光谱特征基本特征：带不同，黄酮位于304-350nm；黄酮醇位于358-385nm；作用：区别黄酮和黄酮醇在黄酮或黄酮醇母核上，有羟基，甲氧基等供电子基取代，可引起吸收带红移。B环氧取代程度越高，带越向长波方向移动。A环氧取代，则使带、带红移6-17nm。但如果羟基甲基化或苷化，则相应的吸收峰向紫移，带更明显。,（2）查耳酮及橙酮：带为主峰，带吸收弱。,3）异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇,都有苯甲酰系统，而无桂皮酰系统。紫外吸收峰都是带为强峰，带为弱峰。异黄酮：245270nm；二氢黄酮及二氢黄酮醇：270295nm。,3、利用诊断试剂检出位置,（）甲醇钠：强碱性，使所有酚羟基解离，红移。：带红移，强度稍有增强；，无：带红移，强度减弱；游离：在处，有吸收峰存在，成苷后消失；，二及其他位置的邻位三，不稳定，在甲醇钠存在下，易氧化分解，故吸收带会随时间的延长而衰退。,（2）乙酸钠（NaOAc）：使可使7-或4-羟基解离，影响相应吸收带红移。：带向红移（酸性减弱，位移小）；：被取代时，带与甲醇钠引起的位移值相同或较大；（用于区别）邻位不稳定，吸收峰会逐渐衰退。,（3）乙酸钠硼酸：使邻二酚形成络合物（，邻位除外）环有邻二酚时，带红移环有邻二酚时，带红移,4）AlCl3和AlCl3HCl原理：使邻二酚，、与羰基生成络合物，红移；邻二酚加酸后络合物分解，紫移；,A：样品+AICI3/HCl光谱等于样品+CH3OH光谱。表示无3-OH或5-OH或两者被取代。,如样品甲醇液在加入AICI3/HCl后，带红移3555nm则示有5-OH而无3-OH；只红移1720nm时，示有6-氧取代；带红移约60nm，示有3-OH而无5-OH；带红移50-60nm，示同时有3-OH，5-OH。,B：样品+AICI3与样品+AICI3/HCl光谱一样，则表示无邻二酚羟基,样品+AICI3与样品+AICI3/HCl光谱不同；环有邻二时，加盐酸后向紫移；环有邻三时，加盐酸后向紫移若紫移在5065nm，则A及B环均有邻二酚羟基。,二、异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类,结构特点：有苯甲酰系统,无桂皮酰系统，带明显,1、在甲醇中的特征,（）异黄酮：带在，随环含氧基的增多红移；（2）二氢黄酮（醇）：带在，受环取代基影响；,2、利用诊断试剂检出位置,（）甲醇钠、环有，带红移；、邻二（三），不稳定；、，二二氢黄酮（醇），带红移，强度增加；，；,（2）乙酸钠,异黄酮：带红移；，异黄酮：带不移动；，四异黄酮：不稳定；，二二氢黄酮（醇）：带红移；二氢黄酮（醇）：带红移；，三二氢黄酮（醇）：不稳定,（3）乙酸钠硼酸,二：带红移,（4）AlCl3lCl3/HCl,6,7-和7,8二异黄酮，二氢黄酮（醇）：带红移11-30nm（AlCl3lCl3/HCl）异黄酮：带红移（AlCl3/HCl-MeOH）二氢黄酮（醇）：带红移（AlCl3lCl3/HCl）,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,没有制成衍生物的黄酮类化合物，常用无水DMSO-D6对鉴别Ar-OH数量有用。,例：3，5，7-三羟基黄酮1H-NMR谱上Ar-OH质子信号：12.40(5-OH)10.93(7-OH)9.7(3-OH)这些信号在向样品中加重水(D2O）后即可消失。,内标物：四甲基硅烷（TMS）,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,各种类型质子1H-NMR谱规律：,1、A环质子：5.78.0,1）5,7-二羟基黄酮类化合物,A环上的芳氢：6H：5.7-6.9(d,J=2.5)8H：5.7-6.9(d,J=2.5),H6较H8高场一些当7-OH成苷后，H6及H8均向低场位移,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,1、A环质子：5.7-8.0,2）7-羟基黄酮类化合物,A环上的芳氢：5-H：7.98.2（d,J=9.0），（4位C=O强烈的负屏蔽效应）6-H：6.77.1（dd,J=9.0,2.5）8-H：6.77.0（d,J=2.5）,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,2、B环质子：6.57.9,较A环稍低场,1)4-氧取代黄酮类化合物,（H-3,5较为高场）：H-3,5：6.57.1（d,J8.5）H-2,6：6.57.9（d,J8.5）,B环上的芳氢有两组信号：H-3,5,H-2,6构成AABB系统，可简单看成AB系统。,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,2、B环质子：6.57.9,较A环稍低场,2)3,4-二氧黄酮类化合物,B环上的芳氢：H-5：6.77.1（d,J8.5）H-2：7.27.9（d,J2.5）H-6：7.27.9（dd,J8.5,2.5）,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,、C环质子：可区别不同类型黄酮类化合物的骨架。,H-3（黄酮）:6.3(1H,s)，尖锐单峰信号,1）黄酮,易与5，6，7或5，7，8三O取代A环H-8或H-6单峰信号相混。对5-OH进行选择性氘代甲基硅烷化时，对H-8，H-6，H-3会产生程度不同的影响：H-3低场位移0.15，H-8高场位移0.15。H-6基本保持不变,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,、C环质子：,2）异黄酮,H-2（异黄酮）:位于C=O的位，且连在与氧相连的C上，故位于较低场。7.67.8(1H,s，CDCl3);8.58.7(1H,s,DMSO-d6),第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,、C环质子：,3）二氢黄酮（醇）（1）二氢黄酮,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,3）二氢黄酮（醇）（2）二氢黄酮醇,、C环质子：,H-2,H-3为反式直立键系统,3-OH成苷时，H-2及H-3均向低场移动可用以判断糖的位置,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,、C环质子：,4）查耳酮,H-：6.50-6.70(1H,d,J=Ca.17.0)H-：7.30-7.70(1H,d,J=Ca.17.0),第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,、C环质子：,5）橙酮,苄氢:6.50-6.70(1H,s)6.37-6.94(1H,s,DMSO-d6),第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,4、糖上质子：,1)单糖苷,可以通过糖上端基质子（H-1）的化学位移值判断糖连接位置及糖的种类，见下表。,糖与苷元相连时，糖上端基质子（H-1）与其他H比较，一般位于较低场（4.0-6.0）。,提示:（1）黄酮C3-OH的Glu苷与4，5，7-OH糖苷很易区别（2）黄酮醇3-O-Glu与3-O-Rha亦可区分（3）二氢黄酮醇3-O-Glu与3-O-Rha不易区分但可借助Rha上的CH30.8-1.2,J=6.5Hz(d),第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,4、糖上质子：,1)单糖苷,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,4、糖上质子：,2)双糖苷,黄酮类化合物双糖苷中，末端糖上的C-1-H因离黄酮母核较远，受到其负屏蔽影响相对较小，故其吸收峰将移至比H-1较高场区,第五节结构鉴定二、光谱法,（二）、1H-NMR,5、苯环上其他质子：,取代基甲基（CH3）2.04-2.45(3H,s)乙酰氧基（CH3COO）2.30-2.45(3H,s)甲氧基（OCH3）3.45-4.10(3H,s),第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,主要用在以下三个方面:1、黄酮类化合物骨架类型的判断2、黄酮类化合物取代基位置的判断3、黄酮类化合物苷的确定a、了解苷中糖的连接位置b、了解苷键构型c、了解糖糖连接顺序,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,1、判断黄酮类化合物骨架类型（15个C）,可以根据中央三个碳信号的位置及C6-C3-C6中的C2-C3系统及其裂分情况推断黄酮类化合物的骨架类型,判断依据：,1）C=O的位移：170-200,2）C2()C3(),100-165,2、确定黄酮类化合物取代图式,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,1）取代基位移效应,A或B环上引入取代基时，引起的位移大致可以用简单苯衍生物的位移效应计算：,2、确定黄酮类化合物取代图式,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,1）取代基位移效应,规律：（1）-OH，-OCH3的引入使：ipso-C原子向低场大幅度位移邻位C原子向高场位移对位C原子向高场位移间位C原子向低场位移幅度小,（2）A环上引入取代基，位移效应只影响A环，B环只影响B环，如果一个环上引入多个取代基，位移效应具有加和性。,2、确定黄酮类化合物取代图式,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,1）取代基位移效应,（3）A环上引入5-OH时,不仅影响A环，由于5-OH与4-C=O形成氢键，使C4、C2上升（+4.5，+0.87），C3下降（-1.99）。,C5-OH甲基化影响消失。,3、黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,黄酮类等酚性化合物在形成O-糖苷后，苷元以及糖均产生相应的苷化位移，但因苷元上成苷位置不同以及糖的种类不同，苷化位移幅度也不同，因此可以判定糖在苷元上的连接位置。,苷化位移(GS)：糖与苷元成苷后，苷元的-C、-C和糖的端基碳的化学位移值均发生了改变，这种改变成为苷化位移。苷化位移值与苷元的结构有关，与糖的种类关系不大。通过苷化位移可以推测糖与苷元、糖与糖的连接位置。,3、黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,1）糖的苷化位移和端基碳信号,酚性苷中糖的端基碳的苷化位移为:+4.0-6.0。7,2,3或4-O-糖苷，糖的端基碳信号,C-1：100.0-102.55-O-葡萄糖苷，C-1：104.37-O-鼠李糖苷，C-1：99.0,因此，可以通过糖端基碳的化学位移确定糖的连接位置。,3、黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,2）苷元的苷化位移,规律：苷化后苷元的ispo-C向高场位移，邻位、对位向低场位移，对位位移幅度大且稳定,4、双糖及低聚糖苷中糖一糖的连结顺序,第五节结构鉴定二、光谱法,（三）、13C-NMR,双糖苷及低聚糖苷的光谱可分解成相应的单糖苷或双糖苷的光谱进行比较。,当糖上-OH被苷化后，将使糖上该-OH所在C向低场位移，邻C稍向高场位移。,质谱MS,特点：黄酮苷元直接测定，分子离子峰（）较强，为基峰；黄酮苷全乙酰化，全甲基化后再测定；主要碎片峰：，,