（分析化学专业论文）基于溶胶凝胶和纳米颗粒固定化酶的生物传感器的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 生物传感器具有体积小、使用方便、检测速度快等优点，在l 晦床医学、生化 研究、环境保护以及食品工业等领域都得到了广泛应用。酶的固定化方法在生物 传感器研究中具有重要地位，在相当多的场合，对传感器的灵敏度、选择性、响 应速度、使用寿命等有着决定性的影响。合适的固定化方法应当满足：( 1 ) 酶固 定化后活性应尽可能少受影响，保证传感器的高灵敏度和高选择性：( 2 ) 固定化 方法对被测对象的传质阻力小，保证传感器的快速响应；( 3 ) 酶固定化牢固，不 易洗脱，保证传感器有较长的使用寿命。 本论文的研究旨在通过改进酶的固定化技术，提高固定化酶的催化效率，以 达到改善生物传感器性能的目的。具体研究工作如下： 第一部分：基于掺杂溶胶凝胶法固定化酶的生物传感器 1 溶胶- 凝胶法固定化酶可以在温和的条件下进行，能较好地保持酶的活性， 因而得到广泛应用。但是传统的溶胶- 凝胶法常常存在孔径小或孔道堵塞等问题， 限制了其优点的发挥。本工作研究在凝胶形成过程中掺杂肌氨酸和山梨醇，由于 两种添加剂的模板作用，可形成大而有序的凝胶网格，使得酶与底物能充分接触， 从而达到提高酶催化效率、改善生物传感器性能的目的。基于这一方法固定了辣 根过氧化酶和葡萄糖氧化酶，考察了掺杂前后固定化酶活性的变化，发现这两种 酶采用该方法固定化后，其催化活性提高程度不同。 2 次黄嘌呤是体内嘌呤核苷酸分解代谢的中间产物，是疾病诊断、食品分析 等方面的重要指标之一。传统的分析方法不仅操作复杂、成本较高，而且 1 0 - 7 _ 1 0 。6 m o l l 的检测下限仍然不太令人满意。本文在掺杂溶胶凝胶固定化辣根 过氧化酶和葡萄糖氧化酶的基础上，将黄嘌呤氧化酶固定于掺杂溶胶凝胶中，使 得固定化酶的催化效率达到了普通溶胶- 凝胶法的2 5 4 倍。结合本实验室自行研 制的液滴光化学传感装置，构建了高灵敏的次黄嘌呤传感器。在p h 值为8 7 4 的 t r i s h c l 缓冲溶液中，该传感器对2 0 x1 0 - 7 8 0 1 0 6 m o l l 的次黄嘌呤呈线性响 应，检测限达到5 0 1 0 一m o l l 。 第二部分：基于纳米颗粒吸附固定化酶的生物传感器 纳米颗粒具有比表面积大、表面活性高等特点，在酶的固定化方面得到人们 的重视。本文将辣根过氧化酶和葡萄糖氧化酶吸附于二氧化硅纳米颗粒表面，结 合溶胶凝胶法，制成适合传感器应用的酶柱。结果表明，基于这种方法得到的固 基于溶胶- 凝胶和纳米颗粒固定化酶生物传感器的研究 定化酶柱不仅在催化活性方面有一定程度的提高，而且相对于传统的溶胶凝胶 法，在热稳定性、操作稳定性、使用寿命等方面有显著的改善。基于纳米颗粒吸 附固定化酶的方法，不仅可以得到性能更优的生物传感器，而且对固定化酶的其 它应用领域也将产生影响。 第三部分：其它工作 脱氧核糖核酸( d n a ) 与靶向分子相互作用的研究对于了解药物的作用机理 及新药的设计具有重要的意义。本文研究了洛美沙星与d n a 的相互作用，测得 d n a 与洛美沙星的结合常数为4 6 x1 0 3 l m o l ( 3 7 0 c ，p h = 7t r i s h c i ) 。金属离子 的存在对洛美沙星与d n a 的相互作用有不同程度的影响。m 9 2 + 和c a 2 + 存在时影 响较大，洛美沙星与d n a 的结合常数可以分别提高到原来的1 5 和1 2 倍。n a + 、 k + 几乎不改变洛美沙星与d n a 的结合常数。溶液的p h 值对其作用也有一定的影 响：p h 值越高，洛美沙星与d n a 的结合能力越弱。 关键词：固定化酶；溶胶凝胶；纳米颗粒；生物传感器；d n a ；洛美沙星 u 颈圭学位论文 a b s t r a c t b i o s e n s o r sa r ep o w e r f u lt o o l sf o rc l i n i c a lm e d i c i n e ，b i o c h e m i c a lr e s e a r c h ， e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na n df o o di n d u s t r y , o w i n gt ot h e i rs m a l ls i z e ，c o n v e n i e n tu s e a n df a s ta s s a y e n z y m e si m m o b i l i z a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i nd e s i g na n d f a b r i c a t i o no fb i o s e n s o r s ，w h i c hu s u a l l yd e c i d e st h ep e r f o r m a n c eo fb i o s e n s o r s ，s u c h a ss e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y , r e s p o n s et i m ea n dl i f e t i m e ag o o di m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s h o u l dm e e tt h ef o l l o w i n gr e q u i r e m e n t s ：( 1 ) p r o d u c ei m m o b i l i z e de n z y m e st h a tr e t a i n t h e i rb i o c a t a l y t i ca c t i v i t i e s ；( 2 ) p r o d u c eb i o s e n s o r st h a th a v eal o wm a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c ea n dar a p i dr e s p o n s et i m e ；( 3 ) p r o d u c ei m m o b i l i z e de n z y m e st h a ta r e s t a b l ea n dd on o tl e a c hf r o mt h es u b s t r a t e t h ep u r p o s eo ft h i st h e s i si st oi m p r o v et h ep e r f o r m a n c eo fb i o s e n s o rb y a m e l i o r a t i n ge n z y m e si m m o b i l i z a t i o nt e c h n i q u e i nd e t a i l ，t h et h e s i si n c l u d e st h e f o l l o w i n gp a r t s ： p a r ti ：i n v e s t i g a t i o no fb i o s e n s o r sb a s e do nd o p e ds o l g e lf o re n z y m e s i m m o b i l i z a t i o n l 。t h e s o l - g e le n c a p s u l a t i o nm e t h o dh a sb e e nw i d e l y u s e di n e n z y m e s i m m o b i l i z a t i o ns i n c ei tc a nb ep r e p a r e du n d e rm i l dc h e m i c a lc o n d i t i o n s ，a l l o w i n gt h e e n t r a p p e de n z y m e sr e t a i nt h e i ra c t i v i t y h o w e v e r , s o l - g e lm a t e r i a l sm a yu n d e r g o c r a c k i n gd u et oh y d r a t i o ns t r e s s e s ，a n di ns o m ec a s e sc a nb l o c kt h ea c c e s s i b i l i t yo f a n a l y t e st ot h ee n t r a p p e de n z y m e s 。t h eu s eo fa d d i t i v e sc a no v e r c o m es u c hp r o b l e m s 。 i nt h i sw o r k ，d u r i n ge n c a p s u l a t i o no fe n z y m e si n t os o l g e ld e r i v e ds i l i c a ，s a r c o s i n e a n dd - s o r b i t o lh a v eb e e na d d e dl ee n h a n c ep o r es i z e s s ot h ed i f f u s i o nr a t ef o r s u b s t r a t em o l e c u l e st o e n t r a p p e de n z y m e sw a si n c r e a s e d ，a n dt h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e de n z y m e sa n dt h ep e r l e l l l l a n e eo fb i o s e n s o r sw e r ea l s oi m p r o v e d 。b a s e d o nt h i sm e t h o d ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ea n dg l u c o s eo x i d a s ew e r ei m m o b i l i z e d ，a n d t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m e sw e r ee x a m i n e db yd o p e da n du n d o p e d s o l g e l + t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m p r o v e m e n to ft h ec a t a l y t i c c a p a b i l i t yo ft h i st w o e n z y m e sw e r ed i f f e r e n tb yu s i n gd o p e ds o l - g e lm e t h o d 2 h y p o x a n t h i n ei sam e t a b o l i t ei nt h ed e g r a d a t i o no fa d e n i n en u e l e o t i d e t h e m e a s u r e m e n to fh y p o x a n t h i n ei s i m p o r t a n ti nc l i n i c a ld i a g n o s i sa n df o o di n d u s t r y 。 t h et r a d i t i o nm e t h o d sa r ec o m p l e xa n dc o s t l y i na d d i t i o n ，t h ed e t e c t i o nl i m i to f i t l 基于溶胶- 凝胶和纳米颗粒固定化酶生物传感器的研究 1 0 一1 0 一m o l li sn o ts a t i s f i e de n o u g h b a s eo na b o v ew o r k ( p a r t i - 1 ) ，x a n t h i n e o x i d a s ew a si m m o b i l i z e db yt h ed o p e ds o l g e lm e t h o d t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e b i o c a t a l y t i ca c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dx a n t h i n eo x i d a s eb yu pt o2 5 4 - f o l dr e l a t i v et o t h a to fb yu n d o p e dg l a s s e s b a s e do nt h ed o p e ds o l g e lt e c h n i q u ef o ri m m o b i l i z i n g e n z y m e s ，al i q u i dd r o ps e n s o rw a sd e v e l o p e dt od e t e r m i n eh y p o x a n t h i n e i np h 8 7 4 t r i s h c lb u f f e rs o l u t i o n ，t h eb i o s e n s o rs h o w e dl i n e a rr e s p o n s ei nt h er a n g ef r o m2 0 1 0 。7t o8 0 1 0 - 6 m o i l w i t had e t e c t i o nl i m i to f 5 0 1 0 8 m 0 1 l p a r tl h i n v e s t i g a t i o no ft h eb i o s e n s o r sb a s e do na d s o r p t i o no fe n z y m e so n t o s i l i c an a n o p a r t i c l e s n a n o p a r t i c l e sp l a yi m p o r t a n tr o l e si ne n z y m e si m m o b i l i z a t i o nd u et ot h e i rl a r g e s p e c i f i cs u r f a c ea r e aa n dh i g hs u r f a c ef r e ee n e r g y h e r e ，w er e p o r t e dam e t h o dt o i m m o b i l i z eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ea n dg l u c o s eo x i d a s eb yc o m b i n i n gt h em e r i t so f s o l - g e lm e t h o d sa n ds i l i c an a n o p a r t i c l e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts i l i c an a n o p a r t i c l e s c o u l di n c r e a s en o to n l yt h ea c t i v i t yb u ta l s ot h et h e r m a ls t a b i l i t y , o p e r a t i o n a ls t a b i l i t y a n dt h el i f e t i m eo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m e s i ti st ob ee x p e c t e dt h a ts u c ham e t h o d w i l ln o to n l yg r e a t l yf a c i l i t a t et h ea p p e a r a n c eo fv a r i o u st y p e so fb i o s e n s o r s ，b u ta l s o b eu s e di no t h e rf i e l d sw h e r ei m m o b i l i z e de n z y m e sa r en e c e s s a r y p a r ti l l ：0 t h e rw o r k i n v e s t i g a t i o no ft h e i n t e r a c t i o no fd n aw i t hi t s t a r g e t m o l e c u l e si s v e r y i m p o r t a n tf o ru n d e r s t a n d i n gt h em e c h a n i s mo fd r u ga n dd r u gd e s i g n h e r e ，t h e i n t e r a c t i o no fl o m e f l o x a c i nw i t hc a l ft h y m u sd n aw a ss t u d i e db yf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y t h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n to ft h ec o m p l e xf o r m a t i o nw a s4 6 10 3 l m o l ( 3 7 0 c ，p h = 7t r i s h c i ) m e t a li o n si n f l u e n c e dt h ei n t e r a c t i o n f o re x a m p l e ，i nt h e p r e s e n c eo fm a g n e s i u mi o n sa n dc a l c i u mi o n s ，t h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n tw a s1 5a n d i 2t i m e sh i g h e r , r e s p e c t i v e l y o t h e rm e t a li o n s ，s u c ha ss o d i u ma n dp o t a s s i u m ，c o u l d h a r d l yi n f l u e n c et h ei n t e r a c t i o n t h ei n f l u e n c eo fp ho nt h ei n t e r a c t i o nw a sa l s o i n v e s t i g a t e d t h eh i g h e rt h ep hv a l u e ，t h ew e a k e rt h ei n t e r a c t i o n k e y w o r d s ：i m m o b i l i z e de n z y m e s ；s o l g e l ；n a n o p a r t i c l e s ；b i o s e n s o r s ；d n a ； l o m e f l o x a c i n i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 谬 究或采。除了文孛耨剩热叛标注雩| 建静蠹器努，零论文举包含镊 莓其麓令入或 集体己经发表溅撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声躜的法律衙果由本入承掇。 作者签名：蠢霞学 习嬲； 2 0 0 5 年8 届 嚣 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有装保留、使用学位论文的规定，同意学校僳 餐著爨溪家有关部门或捉擒送交谂交瓣复露终窝电予舨，允诲论文被套凝秘诺阕。 本人授权湖南大学可以将本学位论文的全都或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或稳籀等复镧手段诃汇编举学位论文。 本学位论文属于 l 、保密嬲，在年解密后邋用本授权书。 2 、不保密墨。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：两承捌 刷醛辄移嘲 疆矮：2 0 0 5 年8 足，日 嗍2 0 0 5 钿广 硕士学位论文 1 1引言 第1 章绪论 传感器，就好比是人的感官的延伸，在科学研究、生产、生活的各个方面， 被广泛地用于实时、在线地获取各种信息。这些基于不同原理的传感器，既可以 反映出各种物理量，如温度、湿度等的变化，也可以反映出各种化学量，如p h 、 离子浓度等的变化。特别是随着生物技术的迅速发展和广泛应用，能够实时、在 线获取各种生化信息的生物传感器显得越来越重要。 要实现生化信息的传感，首先要能够高灵敏、高选择地识别被测对象，如各 种与生命活动密切相关的离子、气体、有机分子以及生物大分子等等。对于简单 的离子、分子，可以利用天然的或人工合成的载体，如放线菌素、冠醚、杯芳烃 等，通过一些较为简单的物理、化学手段制成敏感膜，完成高灵敏高选择性识别。 但是对于很多有机物、生物大分子，则需要相应的酶、抗原、抗体甚至生物组织 才能完成识别。如何将这些生物活性单元固定化制成相应的敏感膜，同时又要保 持生物活性单元的固有特性，是生物传感器研究的一个关键问题。 酶作为一种生物催化剂，能在常温常压的温和条件下高效地催化反应，并且 具有很高的专一性【，常被制成固定化酶，广泛地用于生物传感器的构建1 2 4j 。合 适的固定化方法应当满足：( 1 ) 酶固定化后活性应尽可能少受影响，保证传感器 的高灵敏度和高选择性；( 2 ) 固定化方法对被测对象的传质阻力小，保证传感器 的快速响应；( 3 ) 酶固定化牢固，不易洗脱，保证传感器有较长的使用寿命。 早在8 0 年前，科学家们已发现酶被吸附在骨炭粉上仍具有活性的现象，但真 正开展大量的固定化酶的研究是从5 0 年代初开始的。经过5 0 多年的研究和发展， 酶固定化技术取得了长足进步。在此基础上，已经成功地得到了一些灵敏度高、 选择性好的生物传感器。例如，t h u s t 等【3 1 利用吸附法将青霉素酶固定于多孔s i 0 2 中，制成了选择性和稳定性较好的青霉素传感器。l i u 等【4 】将葡萄糖氧化酶( g o d ) 吸附固定于y 型沸石分子筛修饰的铂电极上制成了灵敏度较高的葡萄糖传感器。 a n s g a r t 6 1 等人利用聚氨基甲磺酰胺凝胶包埋固定肌氨酸氧化酶，以铁氰化物为媒 介体，在丝网印刷电极上制成了厚膜传感器，用于h 2 0 2 的测量，效果满意。 然而，由于固定化效率、稳定性、通用性等方面的问题，限制了生物传感器 的综合性能的提高。因此，进一步开发更简单、更适用的固定化方法以及性能更 加优异的载体材料，仍然是这个领域追求的目标。 基于潞胶嵌胶和纳米颗粒嘲定化酶的搬物传感器的研究 1 2 常用的固宠化酶方法 酶固定化方法有多种，大致可分为以下四类：吸附法、交联法、凝价键念法 爨及色堙法等，鲡鞫1 1 所示。这些方法遴常会联台佼糟，或甄稽馥遴，酸获得 最佳的性能。 徊曩1 曼曼z 堂f 。 袖馑曼厘纠剑 1 螽 爱 圈1 1 酶的固定他方法 f i g ，t 。l m e t h o d sf o re n z y m e si m m o b i l i z a t i o n l 。2 1吸附法 吸附法是利用离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维索、琼脂糖等多糖 类或多魏玻璃、离子交换樾疆等载俸上弱霾定方式。工艺麓蠖及条 孛激靼是笑显 著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机离分子材料，吸附 过稳爵弼霹达裂缝亿和固定纯，瓣失涯露可重薪溪纯，载体可以再生1 9 “。铡翔， m o j o v i c 等【1 1 1 将从c a n d i d a r u g o s a ( 念珠菌属) 中提取的脂肪酶吸附固定在大孔共 聚彩载嚣上，在最优条纷下最大吸瓣量炎1 5 。4 m g g ，酶固定效率为6 2 。作纛在 卵磷脂，异章烷存在下，用此固定酶水解椰子油，酶活力为游离酶的7 0 ，重鬓使 用1 5 次后，固定酶活性仍保持其最拐活性豹5 6 。 吸附法操作简单，反应条件濑和，载体可反复使用。但悬由于结台不牢围， 酶易脱落，从嚣导数了催能活力敬丧失秘珐污反应产物等闫题，因此其斑用受劐 了较大的限制。 1 2 2 交联法 交联法是用双功能或多功能试剂与酶之间交联的固定方法。参与交联反威的 酶蛋白的功能团有n 末端的n 氨基、赖甄酸的8 氨基、酪氨酸的酚基、半虢鬣酸 硕士学位论文 的巯基和组氨酸的咪唑基等。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺一2 ，2 - 二磺 酸、l 。5 - 二氟2 ，4 - 二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等1 2 以引，最常用的是戊二醛。 如j a n c s i k 1 2 1 等分别将1 3 - 半乳糖苷酶、醛缩酶、青霉素酰化酶包埋于聚乙烯醇膜 内，用戊二醛作为交联剂，有效地减少了酶的漏失。其反应式如下： o h ( c h 2 ) 3 c h o 一一e 一e _ 。e 丁。 一：一n 。c h ( c i 岛) 3 c h 2 _ n 一 e n z y m e ，v 交联剂一般价格昂贵，此法也很少单独使用，一般都将其作为其他固定化方 法的辅助手段，以达到更好的固定效果。 1 2 - 3 共价键合法 共价键合法是酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间 形成化学共价键连接，从而使酶固定的方法。由于酶与载体间连接牢固，不易发 生酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性。其常用载体包括天然高分子( 纤维素、 琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物等) 、合成高聚物( 尼龙、多聚氨基 酸、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物等) 以及无机支持物( 多孔玻璃、金属氧化物等) 1 4 16 1 。例如，e 1 m a s r y t l 4 1 利用甲基丙烯酸缩水甘油酯在尼龙膜表面接枝共聚，再 与对苯二胺作用，引入芳氨基，用重氮化法将b 半乳糖苷酶进行了固定化，反应 式如下： 纠一c 如仃硼：n a n 0 2 一c ko - 叩，1 t y r - p c 心仃恻一， 共价键合法要求酶具有与基质能发生反应的特殊的官能团，且固定化后酶分 子的取向是固定的，使底物与酶反应位点间的接触受到一定限制。此外，共价键 合和交联过程所发生的剧烈化学反应对酶的存活十分不利。 善 【基 基于溶胶凝腔和纳米颗粒固定化酶的生物传感器的研究 l - 24 包埋法 包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中。这样可 以防止酶蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触。此法较为简便，酶分 子仅仅是被包埋起来，生物活性破坏少。但此法对太分子底物不适用。 包埋法可分为网格型和微胶囊型两种，将酶包埋在高分子半透膜中的称为微 胶囊型：将酶包埋在有机基质和无机基质材料的凝胶细微网格中的称为网格型。 常用的有机材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等，无机材料有硅胶类等。包埋法一般 不需要与酶蛋白的氨其酸残基进行结合反应很少改变酶的高级结构，酶活力回 收率很高，因此可以应用于许多酶的固定化但是在包埋时发生化学聚合反应， 酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。 12 4 1 微胶囊法 微胶囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内膜既能使酶存在于类似细胞内 的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微胶囊外环境接触。小分子底物则能迅速通 过膜与酶作用，产物也能扩散出来。例如，d a s 等町l 将脲酶包埋固定于二十六烷 基硫酸钠在适当溶剂中形成的反相胶柬内，与玻璃电极共同组成脲传感器。用于 临床血样品中尿酸的测定，其结果与常用方法的结果一致。微胶囊法包埋的酶量 很多，在医学上具有很大的应用可能性，因此越来越受到人们的注意。 1 2 4 2 有机凝胶包埋法 有机凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水溶性有机凝胶的空隙中的方法。常用 的基质材料有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇类等。其中，聚丙烯酰胺凝胶因为亲水性 强、理化性质稳定以及结构参数易控制等优点，成为人们最常用的固定化酶载体 之一1 8 1 。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺( 单体) 和甲撑双丙烯酰胺( 交 联剂) 。在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。例如， 冯锋等【2 9 l 以过硫酸胺为引发剂，以n ，n 亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，对丙烯酰 胺单体进行共聚，制成凝胶。固定了l 氨基酸氧化酶，测定l 一氨基酸获得较好结 果。 用聚丙烯酰胺凝胶的包埋法制备固定化酶时，条件较苛刻容易导致酶失活， 而且载体不易表征，存在着较大的扩散阻力。另外，就是酶的漏失，尤以低分子 蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度，与交联程度，可得到克服的a 1 2 4 3 溶胶一凝胶包埋法 溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶( s o ) 、凝胶 ( g e l ) n 固化的方法。s o l g e l 是物理包埋过程，凝胶网格是围绕酶逐渐形成的，对 酶的尺寸无特殊要求，温和的反应条件和凝胶的非晶态结构都有利于保持酶的结 酶的尺寸无特殊要求，温和的反应条件和凝胶的非晶态结构都有利于保持酶的结 硕士学位论文 构完整性和表面微观结构的各向同性，另外，由于基质含有足够的水，生物酶处 于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，与它在水溶液中有相似的行为。 早在2 0 世纪8 0 年代中期，人们就已经发现利用s 0 1 g e l 法可以将有机物分子 掺杂于无机基质中，并可保持有机物分子的物理化学性质不变。但当时人们普遍 认为前驱体的高反应活性，过程中醇的释放以及凝胶化过程导致的压力变化可能 会破坏有机物分子的构象和活性。所以，利用s 0 1 g e l 法将有机物分子掺杂于s o l g e l 基质领域的研究工作进展一直较为缓慢。 直到1 9 9 0 年以色列的b r a u n 等【1 8 1 利用s 0 1 g e l 法成功地将碱性磷酸酶引入 s i 0 2 基质中。自此，s o l _ g e l 法固定化酶技术的开发进入了一个迅速发展的阶段 t g - 2 h 。迄今为止，许多生物酶如脂肪酶【2 2 1 、过氧化氢酶【2 3 1 、胆固醇氧化酶【2 4 】、 葡萄糖氧化酶2 5 。2 7 1 以及黄嘌呤氧化酶 2 8 1 等均能被包埋在s 0 1 g e l 基质中，并能在 一定操作条件下保持较高的构象完整性、催化活性和热稳定性。 由于二氧化硅比有机聚合物材料更具有化学和热稳定性、良好的坚固性、抗 磨性和化学惰性、低的体积变形性，及商的热稳定性和光化学稳定性，所以应用 得较为广泛。以下着重介绍该类基质材料的s o l g e l 。 a s o l - g e l 过程及其对生物分子的包埋 s 0 1 g e l 方法就是将一定量的硅酯、水、催化剂和溶剂等物质混合，振摇，通 过水解、缩台( 包括聚缩合) 、老化、干燥等步骤制得玻璃态衍生物。 水解反应 由硅酯键水解生成硅醇键，则最初分层的两相逐渐形成均匀溶液( 即溶胶) ， 可用下式表示： i r o 一；i 一+ 心o l h 或o h 屿o l s i 一0 h + r o h i 缩合反应 包括硅醇之间生成水以及硅醇与硅酯之间生成醇的缩合反应。通过分子之间 不断地进行缩合反应，形成硅氧烷链的网状聚合物。聚合物的增长包括长大和再 结合过程，长大过程主要发生在聚合的开始阶段，由部分水解的单体、二聚体、 三聚体之间进行缩合反应，此时聚合物增长较慢，随着单体、二聚体等低聚物和 水的减少，增长过程减弱，但出现了较大分子之间的再结合过程，聚合物增长迅 速。缩合反应可用下列式子表示： 基于溶腔凝胶帮纳米颗粒鞠定位酶的生物蝗感瓣的研究 i - - s i ，o h l i s i o h i - l | = 三- - s i o 蠢一+ r o h l i - | i 寻一s i 一o j i 一+ 琏。 1 通过不断的缩合反应，最终母致s i 0 2 网络的形成，即形成了凝胶。这种多孔 凝胶内鼋含溶蔬和窳。 老化和译撰 形成滠胶之荫，s i 0 2 网络之中的溶剂和水份在温和条件下逐渐蒸发丧失，但 缀合友应继续进行，湿驳会出瑰不圈程发豹皱续现象，弼孔燎会缩小，最终形成 干凝胶。 生物分子戆京域 在该过程形成s o l 或g e l 的某个时候，将酶加入，就能制得含酶的s 0 1 g e l 敏 藩元俘，这是缝戒生兹簧感器懿荚键部 率之一。溶胶躐凝菠霹生耪潘穗兹震熬包 埋与固定过程可用图1 2 寝示 3 0 1 。 ( a )( b ) ( c ) 鳗1 2s o l - g e l 彀堙固定薅过程零意圈 ( a ) 水解、聚合树期形成s 0 1 颗粒；( b ) 酶加到s o l 中：( c ) 酶被凝胶嘲定 f i g 。1 ，2 t h ee n t r a p s u l a t i o np r o c e s so fae n z y m ei nt h es o l g e l ( a ) f o r m a t i o no fs o lp a r t i c l e sd u r i n gi n i t i a lh y d r o l y s i sa n dp o i y c o n d e n s a t i o np r o c e s s ；( b ) a d d i t i o no fe n z y m e st ot h es o l ；( e ) e n z y m em o l e c u l e si m m o b i l i z e di nt h eg e l b 。s o l - g e l 瓣缺点 s o l g e l 包埋酶分子技术虽然只有十几年的发展历史，但其良好的j 嗷用前娥已 经啜弓l 了科研界和工监界的广泛必趣。禳来越多的研究结果表明，固定于s o l * g e l 一 一 l s l|毹 一 一 瀚 盼 争 + 硕士学位论文 基质中的酶能保持良好的催化性能，从而昭示着酶的s o l - g e l 固定化技术具有乐观 的发展前景。不可否认s 0 1 g e l 法也存在一些局限性，如： ( 1 ) 必须控制很多试验因素； ( 2 ) 聚合物的空间结构使之局限于测定较小尺寸的物质；而且，由于大的扩 散阻力使响应时间增加； ( 3 ) 尽管与吸附法相比，试剂洗脱可大大减少，慢速度的洗脱仍可能发生， 尤其是对于分子较小的试剂，洗脱的程度决定于制备s o l - g e l 的过程、基质孔隙与 包埋试剂的相对大小和测定条件； ( 4 ) 从四个烷氧基起始反应物制备的s 0 1 g e l 在凝聚后很长时间后还在继续缩 合，这将导致孔隙随时间而减小，并影响底物扩散至s o l g e l 内部的能力； ( 5 ) 包埋可能会稍微改变试剂的生物活性，因为试剂在孔隙中自由度仍可能 有一定程度的降低或与孔隙内表面产生相互作用。 c s 0 1 g e l 法的改进 传统的s 0 1 g e l 材料的孔径较小及凝胶孔坍塌引起孔道堵塞，导致底物与产物 分子较低的扩散速率，从而使酶反应效率降低。因此应调大凝胶的孔径及调控有 序的孔道结构，以使分子自由进出，尽可能减小扩散阻力，同时也可以达到改善 分配效应的目的【3 1 l 。最初，人们利用对s o l - g e l 化学的认识，采用表面活性剂作模 板对水解缩聚反应过程和溶胶表面进行修饰，以达到在一定范围内获得可控结构 和可控粒度的凝胶材料。但是由于大部分表面活性剂模板含有破坏酶的试剂，因 此，可用非表面活性剂代替表面活性剂作模板。例如，b r e n n a n 等【3 2 】首次在s o l g e l 法固定a 糜蛋白酶和核糖核酸酶t 1 的过程中，掺杂山梨醇和肌氨酸，他们发现 用该法固定这两种酶的活性及稳定性都比不添山梨醇和肌氨酸的要高，但文献中 指出由于酶结构的复杂性，利用添加的这两种物质作模板来提高固定化酶活性的 方法可能不会适用于所有的酶。 另一方面，为改善基质与酶的生物相容性，近年来凝胶衍生材料等作载体固 定化生物活性单元取得了引人瞩目的成绩3 3 d 4 1 。例如，b e s a n g e r 3 4 】等，将正硅酸 乙酯( t e o s ) 与丙三醇反应，生成二甘油基硅烷( d g s ) 。他们发现用d g s 作为 前驱体用s 0 1 g e l 法固定二氢叶酸酶、环氧化酶2 等几种酶后，酶的催化效率与稳 定性都比单纯用t e o s 为前驱体的情形更好。 对凝胶材料改性及在凝胶形成过程中掺杂与生物分子具有良好相容性的物 质，是溶胶凝胶法发展的一个重要方向。 l - 2 5 四种固定化酶方法的比较 表1 1 比较了各种固定化酶的一些优缺点。四种酶固定化方法各有所长，其 中包埋法是相对较好的一种方法。无论采用何种方法，固定化酶的稳定性是首要 表1 。1 固髭纯酶方法豹优虢点毙较 l 。3 萋于纳米材料的固定诧酶方法 凌露定能酶技术中，除了固定他方法外，酶鲮固定像载体也是一个礤究的热 点。寻找新型的载体，以提高固定化酶的稃种性能具有重簧的意义。 纳米材料l 奠其独特性熊引起了人们鲍广泛兴趣【3 5 4 2 l 。与相废的块体材料枢 比，纳米材料具有独特的化学和物联性质，可应用于电学、催化、磁性材料、光 催他、生物染色剂、药物输送等许多领域。作为灏定化酶载体是其中的研究热点 之一。 1 。3 。| 基于金寝纳米鬏粒圈定他酶的研究及应用 基于金、银、铜等材料的纳米颗粒均被用于酶的固定。其中以纳米众应用褥 最势广泛。续金俸秀基羲疆究承滚滚孛缡寒耪孝莓性震蓥选耪辩瓣主要漾毽是： 制备方法简单并已十分成熟，颗粒大小可被严格控制，颗粒分布比较集中和均 匀；性戆稳定，赛于保存，夸鬏羧续寒焱舞1 6 n m 貔承滚滚霹绦存l 2 个秀， 是制备微型电子器件的理想材料；能产擞较强的等离予菸振吸收，几楚几十的 麓寒会显嬖携魏淫襞夔，霹俸受分掇孛黪撂记秘，在毙港分桩孛毒广泛豹应建。 纳米金以其独特的光学、电学及物理化学性质，已经开始在嫩物分析领域中 获褥威矮4 3 4 7 1 。续寒金也姥够与菜藏生兹缀分强嚣提互终蘧，劳缝毒效瓣维持箕 生物活性，因而是一种具有潜在应用前景的固定生物材料的媒介。c r u m b l i s s 等1 4 6 1 凌毁辫了酶豹缠米金逶遭奄瀑获戆方法沉积副导壤耪拳毒上，避露邀诬学辑突，发 现制成的酶电极能很好地保持酶活惚，延长电极的使用寿命。另外，金属纳米颗 一 携鼠 礤士学位论文 粒与徽球缀簸戆复合鬏蓬鬟霄荔予葳产餮巾分离瓣浚熬优点，爨魏在鬓定毪酶方 面应用较多。例如，p h a d t a r e 等【4 1 】通过在聚亚胺醑微球表面组装一层金纳米颗粒， 鞋金绫寒鬏救壹接蔽瓣霆定篱蛋自薅，哥丈大提蹇霞定纯酶豹溪经与霹泾度熬稳 定性。并可通过离心分离使之能反复利用。 然瑟，鬓霄磅变发瑗，蠢些鹜被金续米鬏粒暇瓣爱酶活蛙簿羝。舞f i s c h e r l 4 哪 等采用修饰了巯基镳的纳米盒颗粒吸附糜龋白酶。发现该酶的活性被抑制。因此， 对金缡米颓载霾定酶熬褪毽窍 专遗一步磅究。 1 3 2 基于非金属纳米颗粒固定化酶的研究及应用 用于嗣定化酶的非金属纳米颗粒有m n 0 2 、t i 0 2 、s i 0 2 等。由于s i 0 2 纳米颗 粒具裔良好的生物相窖性及较好的坚固性、抗磨性、化学惰性以及高的光稳定性 和透过性，嗣此，s i 0 2 纳米颗粒在酶的固定纯中应尾得沈较多1 4 9 弓引。纳米s i 0 2 为无定型白色粉末( 攒其团聚体) ，是一种无毒、无昧、无污染的凭机非金属材料， 比表预积大( ：逸6 4 0 7 0 0 m 2 g ) ，表面存在不饱和的残键及不弼镶合状态的羟基。 s i 0 2 纳米粒予具有商比表面积，用予生物分子的固定，可以增加阙定的分子数量， 姨雨增强反磁信号。s i n g h 等人【5 3 】爝s 0 1 g e l 方法合成硅纳采颡粒。其直径为2 0 n m 或2 0 0 n m 。为了构建有机磷农药生物传感器，该纳米颗粒用于固定乙酰腮碱脂酶， 具有较高的玩表活稳，结合离子敏场效应管检测，响应遇速( t o s ) ，灵敏度裔， 对p a r a o x o n 杀虫剂的检测下限可达l x l 0 6 m o l l 。原茜等1 5 5 】以氨基化二氧化硅缵 米颗粒固定_ j 曩氧纯氨酶，发现嚣定亿酶谨纯反应酌最逶滚度、最适p h 及对酶抑 制剂的抵抗能力都有明显提离。 1 3 3 基于蕃兹性纳米颗粒阉定能酶的研究和应用 构成磁热续寒颗粒豹誊| 糖长撂畿铯铁、铁与冀宅金鬓戆台金等。耄予它荔予 从反威混合物中回收，因此受到人们的重视，被称为“绿色材料”垆“。1 9 7 3 年， r o b i n s o n 等 5 7 1 第一次将磁憾物质搏灸酶匿定纯瓣鼗薅，戴露，磁性载钵越来越多 地应用于细胞和酶的固定化1 5 “0 1 。例如。a r i c a 等【5 8 1 将发酵工业中，生产葡萄糖 常用驰蘩莓糠淀糖酶，用溴纯羲交联霆定农聚( 甲基异了烯酸跫) ( p m m a ) 包被 的f e 3 0 4 磁性纳米颗粒上，发现其热稳定性和操作稳定饿比游离酶的高，且便于 酶的圈牧。c h e n 等蛐1 题f e 3 0 4 磁魅纳米鬏载固定酵母乙静聪氢懿，发瑗隧定他酶 的热稳定性比游离酶提高了近1 0 倍，并飘固定化酶可以非常方便地多次回收铡 用。 1 3 4 基子碳纳米管固定化酶的研究及应用 辕绡米管是一种纳米尺度的其