（工程力学专业论文）血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究.pdf

中山大学硕士学位论文 论文题目：血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 专业：工程力学 硕士生：王传志 指导教师：王彪教授 摘要 光镊是一种光学微操作技术，由于它可以实现对生物活体样品无损伤操作， 它已经成为生物学、医学和物理学中的研究热点之一。研究了单光阱光镊系统的 搭建方法，完成了实验系统的设计、系统参数的设定、仪器的选择等一系列的工 作，成功的搭建了一套简单有效的实验室光镊系统。利用该系统完成了对酵母细 胞的捕获，并且对捕获结果进行了分析与讨论。在光阱中微粒受力方面，基于几 何光学模型，对几何尺寸远远大于激光波长的米氏球形微粒所受的光阱力进行了 定量计算；基于电磁场模型，对几何尺寸远小于激光波长的瑞利粒子所受的光阱 力进行了定量计算。并且利用该系统对人的血红细胞膜的力学性能进行了初步实 验探索，得出了人的红细胞膜的拉伸力与伸长率的关系曲线。 本研究利用一个微米小球为“手柄”，实现了用光镊间接操控生物大分子。建 立了利用光镊技术测量人的血红细胞膜弹性的系统。在实验上为光镊操控生物大 分子做了探索性工作。 光镊技术本身在向实时可控的复杂光阱方面不断发展。多光阱操控技术在众 多的研究领域显得越来越重要。全息光镊作为一种产生多光阱或新型光学势阱的 方法脱颖而出。它不仅能构成各种功能的光阱，并且还能实现三维光阱阵列。本 文构建了基于纯相位型液晶空间光调制器的全息光镊系统。采用了常用的迭代傅 立叶变换算法( i t e r a t i v cf o u r i e rt r a i l s f o r m g o r i t h m ，i 兀a ，又称g e r c h b e r g s a ) 【t o n 算法) 制作了全息图，产生了期望光强分布的光阱。 关键词：光镊；光阱；血红细胞膜；剪切弹性模量；全息光镊 血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 t i i t l e ：s t l l d yo nt h ee l a s t i cp r o l p e r t i e so fr e db 1 0 0 dc e l lm e m b r a n e s u s i n go p t i c a l1 w e e z e r s m a jo r ：e n g i l l e e r i n gm e c h a l l i c s n a m e ：c h u a n z h iw 抽g s u p e r v i s o r ：b i a ow a n g ( p r o f e s s o r ) a b s t r a c t o p t i c a lt w e e z e r st e c h n o l o g yi sat e c h n i q u eo fn o n i n v a s i v e l yt r a p p i n ga n d m a n i p u l a t j l l gm j c r o 。p a r t j c l e s i tj sa ni m p o r t a n ti m p l e m e n to f s t u d y i n gl i f ep r o c e s so n m o l e c u l a rs c a l e o p l i c a l t w e c z e r sh a sv a s ta p p l i c a t i o np r o s p e c ti l lt h e 矗e l d so f s t u d y 柚da p p l i c a t i o ns u c h 硒b i o l o g y ，m e d i c i n ea n dp h y s i c s n o wi th a sb e e no n e o fl h eh o l r e s e a r c h i l l gt o p i c si i ln e wm e t h o d s t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yi st os e tu pas y s t e mo fo p t 渤lt w e e z e r s t l l e o p t l c a l t w e e z e r si i l s t r u m e mw i t ho i 圮o p t i c a l t r a pi ss u c c e s s f u l l yd e s i g n e da n db u i hu p w r eh a v c 蛐c c e s s 如l l yc o m p l e t e das e r i c so ft a s k s ，s u c h 勰t h ec h o i i c co fi n s t r u m e n t s t h es y s t e mp a r a m 9 t e rs e t t i i l g sa n ds 0o n t h ey e a s tc e l l sh a v eb c e ni m p r i s o n e db yt h e o p t l c a l t w e e z e f si i l s t n l m e n tw i t ho n e o p t i c a lt r a p t h er e s u h sh a v eb e e na n a l y z e da n d d i s c u s s e d b yu s j n gt h er om o d e l w h i c hi sb a s e do nt h et h e o r yo fg e o m e t r j co p t i c s ，t h e 0 p t l c a lt r a p p i i 培f o r c co nt h em i c r o s p h e r ep a r t i c l e si l lt h em i es c a t t c r i l l gf i e l di s c a l c u l a t e dq u a n t i t a t i v e l y f 0 rt h ep a n i c l e si i it h er a y l e 逸hs c a i t e r i n g6 e l d ，t h e0 p t 妇l t r a p p i n gf o r c cc a l c u l a t i o nr e s u hb a s e do nt h et h e o r yo fe l e c t r o m a g m t i cf i e l di sa l s o d e s c r i b e d a n dw el l a v e c a r r yo u tap r e l i m i n a r ye x p l o r a t i o no ft h cm e c h a n i c a l p r o p e n i e so fh u m a nr e db l o o dc e um e m b r a n e sw i t ht h i so p t i c a l t w e e z e r ss y s t e i l l a p u uf o r c ca n de l o n g a t i o nc i l r v eo fh u m a ne r y t l l r o c y t em e m b r a n el l a sb e e no b t a i n e d i nt h i sp a p e r ，an l e t h o dt oi n e a s u r ct h ee l a s t i c i t vo fh u m a nr e db l o o dc e m e m b r a n e si s d e v e l o p e d ， w i t ham i 咖b e a da s “h a n d i e ”a ne x p l o r et a s kf o r r e s e a r c h i n gp e r f o r m n c c so fm o l e c u l e si i lb j o l o g yu s i f l g0 p t i c a lt w e e z e r si st a k e n 0 i p t j c a lt w e c z e r st e c l l l l o l o g yh a sr a p i d l yd e v e l o p e di i l a s p e c t so fr e a l t i m e c o n t r o la n dc o n l p l e xt r a p s t h em a n i p u l a t i o nt e c l l i l o l o g yo f m u h j 0 p t j c a j t f a p sp l a y s a n l m p o r t a n tr o l ei i l m a n yr e s e a r c h a r e a s t h eh o l o g r a p h i c o p t i c a lt w e e z e r s 血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 t e c l l l l o l o g ys t a n d s o u t丘o mt h ec r o w d弱an e wr e s e a r c hm e t h o dt o p r o d u c c m u l t i o p t i c a lt r a p s i tc a nn o to n l yp r o d u c em u l t i m n c t i o n a lo p t i c a lt r a p s ，b u ta l s o p r o d u c c t h r e e d i l l l e n s i o n a lo p t i c a lt r a pa i t a y s i nt h i sp a p e r t h eh o l o g r a p h i co p t i c a lt w e c z e r ss y s t e mb a do nt h ep h 弱c o n l y l i q u i dc r y s t a ls p a t i a ll i g h tm o d u l a t o ri sc 0 璐t r u c t e d t h ci t e r a t i v ef b u r i e rt 姗s f o r m a k o r i t h m ( i 兀a l s ok n o w na st h eg e r c h b e 唱一s a x t o na 1 9 0 r i t h m ) h a sb c e nu s e dt o p r o d u c eh o l o g r 卸1 s t h eh o l o g r a p h i ct w e e z e r ss y s t e mb a s e do nt h cp h a s e - o n l ys u 涯 h a sa d v a n t a g e si np r o d u c i n gt h el i g h tt r 印w i t h 锄e x p e c t e dd i s t r i b u t i o no fl i g h t i i l t e n s i ty k e yw d r d s ：o p t i c a lt 如e e z e r s ；s i n g l e - b e a mo p t i c a ig 髓d i e n tf o r c e 勋a p ； h u m a nr e db i o o dc e hm e m b r a n e ；s h e a rm o d u i u s ； h o l o g r a p h i co p t i c a l t 钾e e z e 璐 中山大学硕士学位论文 中山大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“中山大学硕士、博士( 硕士) 学位论 文版权使用规定”，同意中山大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权中山大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名驾缝二 导师签名： 弘月旦日 论文原创性声明内容 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：礅、 日期：鲈q 1 年6 月i 。日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室 被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名磷恕导师签名：旃 日期：垆。1 年 6 月lo 日日期：卿石月f d 日 中山大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 本课题的研究背景和意义 长期以来，显微操作一直是人们梦寐以求的理想。显微观察技术已经 有近四个世纪的历史。每当人们看到微米、纳米尺度大小的微粒时，自然 想在可分辨的尺度上操控它们。在2 0 世纪8 0 年代，一项崭新的技术叩响 了生命科学的大门，它就是基于光的力学效应的“光学镊子”。光镊是人们 期待已久的无损伤操纵活体生物样本的有效手段l l l 。光镊是美国贝尔实验 室科学家t h u ra s h k i n 于1 9 8 6 年发明的。a r t h u ra s h k i n 首先将这项激光 技术用于生命科学。在光镊发明以前的漫长岁月里，科研工作者进行了许 多有意义的探索工作。 1 9 世纪，英国物理学家麦克斯韦预言：光射到物质表面时，将对这一 表面施加压力。1 9 0 1 年，俄国物理学家列别捷夫设计了一个实验，首次发 现光压，并且测量了数据。与此同时，美国物理学家尼科尔斯和哈尔也分 别用精密实验测定了光的压力。最初，由于没有足够强的光源，光辐射压 极其微弱，所以相关的实验无法开展。2 0 世纪6 0 年代发明的激光给光辐 射压的研究提供了高强度，高准直度，高相干性的光源。激光的出现使得 相关的研究工作突飞猛进。 1 9 6 9 年，心t h u ra s h k i n 通过理论计算认为聚焦的激光能够推动尺寸 为几个微米的粒子，并且实现了用聚焦的氩离子激光使得悬浮在水中的透 明胶粒( 直径o 6 到2 5 微米) 沿着光轴方向加速运动。1 9 7 0 年，心t h u r a s h k i n 等首先提出能够用光压( o p t i c a lp r e s s u r e ) 操控微小粒子l 引。之后数年内， a r t h u ra s h k i n 等人逐步拓展其应用领域，如将粒子、液滴等提起以对抗重 力等方面的应用研究【3 。6 1 。这项技术后来发展成了激光制冷技术，不仅可以 使用在微米量级的粒子上，还可以推广到原子分子的尺度。朱棣文( s t e v e n c h u ) 因在激光制冷技术方面取得了显著的成就而获得了1 9 9 7 年诺贝尔物 理学奖。1 9 8 6 年，a n h u ra s h k i n 等人发现，仅仅一束高度聚焦的激光，就 可以形成稳定的势阱而将微粒稳定囚禁【7 - 8 】。这标志着光镊的诞生，光镊的 正式全名为单光束梯度力光阱( s i n g l e _ b e a mo p t i c a lg r a d i e n tf 0 r c et r a p ) 1 1 j 。 正如m t h u ra s h k i n 所说的那样，光镊“将细胞器从它们正常位置移去 的能力，为我们打开了精确研究细胞功能的大门”。光镊的发明使得人们对 微观领域的认识活动从被动的观察转为主动的操控。光镊可以精确定位微 血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 粒，非机械无损伤的操纵活体样本，经过标定的光镊系统能够实现对皮牛 顿量级的微小作用力及亚微米量级微小位移的测定。光镊技术现在已经在 许多研究领域发挥着作用，如对细胞、细胞器及染色体进行捕获、分选； 微粒的旋转、排列与显微加工；光子晶体的制备；激光冷却技术等。因此， 光镊理论和技术的深入研究将对生命科学、医学、化学、材料科学、物理 学等领域的发展作出不可磨灭的贡献。 1 2 国外光镊技术的发展与研究现状 光镊于1 9 8 6 年被发明，经历了2 0 多年的发展，目前已经被广泛应用 于细胞学、分子生物学、物理学、微测量技术等领域，是一项非常实用的 新型工具。光镊的发明使得人类对微观世界的认识活动从被动的观察转为 主动的操控。 1 9 8 6 年，t h u r a s h k i n 首次实现了单光束梯度力光阱对电介质微粒的 捕获，并且指出了负光压是由于梯度力产生的，并且对瑞利粒子的捕获力 进行了分析。心t h u ra s h k i n 和d z e i d z i c ( 1 9 8 9 ) 用光镊将细胞质拉出胞质 丝，以测定细胞质在各种状态下的黏弹性。g f e u l i c h ( 1 9 9 1 ) 用光镊把杀伤t 细胞和鞭细胞放在一起，以观察免疫反应。s t e v e nc h u ( 1 9 9 1 ) 把d n a 分 子标记上荧光，并且用树脂小球与它的末端连接，然后用光镊去捕获小球， 通过操控小球来测定在拉力作用下d n a 分子的性质。1 9 9 3 年，s v o b o d a 和 b l o c k 等人使用光镊首次观察到了驱动蛋白( k i n e s i n 分子) 的运动过程i 引， 如图1 1 所示。将驱动蛋白粘在被光阱捕获的硅球表面上，将微管固定在样品 池底上。当硅球表面的驱动蛋白和微管相互作用时，小球被驱动蛋白拉着沿着 微管运动，小球偏离光阱中心，观测小球的运动轨迹便可得出驱动蛋白的运动 情况。实验结果表明驱动蛋白沿着微管的运动是离散的，而且每步之间的时间 间隔是随机的，驱动蛋白沿着微管以8 n m 的步幅台阶式运动。1 9 9 7 年，b l o c k 和s c h n i t z e r 等人通过实验进一步得出驱动蛋白每走一步需要水解一个衄p 的结 论1 1 0 】。1 9 9 9 年，b l o c k 等人再次通过实验得到结论：第一，k i n e s i n 分子运 动时负载能力由环境中的a t p 分子浓度决定：第二，分子负载越大，最大 运动速度就会减小。 r l 山大学碰七学位论文 二：丝一 ；l 三三三三至；兰i ；i 垂莹雾 i 墓圣兰蓦 0l7 帕 幽1 1 光镊测量动蚩白的步距 r 昏l lm e a s u r j n g t l l es l e p l e n 舀h o f “眦s i nb yo 讲j c a l l w 眦e r s a ，l h es k c l c hr m po f “雎s m m 洲ga l o g m tb ，i l i ep l o i 宴h a w e d t h es l o p l sa b o 8n m 肌肉收缩所产生的力柬源于水解盯p 将化学能转换为推动微丝和肌球蛋产 生相对滑动的机械能。以往学界对其中的化学能机械能转化机制井不清楚。1 9 9 4 年，f 血e r 等人利用负反馈增强的双光镊系统测量了在肌肉收缩中起主要作用的 肌球蛋白和微丝之间的作用力和相对运动步幅【1 ”，如图1 2 所示。将硅球粘附 在盖玻片上将此盖玻片置于一个流动小池中将微丝的两头分别粘一聚苯乙烯 小球形成哑铃结构，用双光镊操控这两个小球使得微丝处于绷直状态。移动光 阱，使被聚苯乙烯小球拉紧的微丝靠近盖玻片，让微丝与硅球表面的肌球蛋白 作用。当硅球上的肌球蛋白维持在适当的密度就能够保证单根微丝与单个肌 球蛋白分子作用，从而产生不连续的相对运动。肌球蛋白在微丝上行走，就会 推动微丝产生位移微丝推动聚苯乙烯小球偏离光阱中心，因此可以通过聚苯 乙烯小球利用四象限探测器方法测得微丝的位移。通过测定小球的位移可以得 出小球所受的力。测量结果显示，肌球蛋白分段位移的平均步长为1 1 n m ，所产 生的力的平均值为3 到4 d n 。 m 红细胞膜弹怿性能的光镡实验研究 l g 、 幽1 2 双光镪测量微丝。j 肌球蛋白作力与运动步幅示意酗 f i 晷1 2 t h es h i c h m a p o fh o w l o 眦a s u r e l h e 如r a n d8 l e p0 f m y o s 蛔b y o m s 随着光镊技术应用领域的不断扩大，为适应更多的研究需求，光镊技术本 身在向实时可控的复杂光阱方面不断地改进。就表现形式而斋，光镊仪器山最 初的单光束梯度力光阱逐渐演化出了许多类型的光学势阱i i “。如双光镊i l ”、三 光镊”】、四光镊、扫拙光镊 ”j 、b 秒光镊等。这一系列光镊的衍生技 术不仪丰富了光镊家族，吏为生命科学、医学、物理学等不同领域在微纳尺度 的研究提供了个非常巧妙的工具。e r mf a l l m a n 【驯、r o b e nms i i i l m o n s 等人 利用偏振分光棱镜实现了光束的分解与耦合，并且利用光学转镜或声光偏振器 实现了光阱位置的精确控制与相对变化，成功的研制了具有两个独立光阱的光 镊系统。人们还将衍射光学、计算机量成全息图等技术应用于光镊技术，以在 同系统l 】同时产生多个光阱。多光阱操控技术在众多的实验研究中显得越来 越重要。光镊技术杠山简单的单光束梯度力势阱向多光阱及阱位叫控的复杂光 阱的发展过程巾，全息光镊作为一利，产生多光阱或新型光学势阱的矗沾脱颖而 出。它不仅能构成各种功能的光阱。并且还能实现三维光阱阵列。全息光镊的 出现带动了一系列的研究和发展p 吲。科学家d a v i d g g r i e r 教授矧预言，全息 光镊将引发光学微操纵的一场技术革命。 全息光镊使用空间光调制器或者衍射光学元件来产生二维或者三维光阱阵 列。其基本原理为：将计算机产生的全息图加载到空| i l j 光调制器上，激光束经 过扩束准真后照射到空日j 光调制器上。激光束经s l m 衍射再通过一个望远镜系 统最后进入显微物镜，在显微物镜的焦平面上形成所需的光阱阵列。通过改变 全息图就可以使得所形成的光阱作动态变化。荚国c b j c a 鼬大学的d a v 讨gg t i e r 教授【扯2 5 】的研究小组和丹麦r 啪国家实验室叫2 7 1 在这方便的研究处于领先地 位。他们设计的动态全息光镊系统不仅可以产生任意形状的二维光点阵列，而 且通过使用特殊的算法可以产生三维光点阵列。全息光镊根据所形成的光场特 性会实现不同的功能，如单粒子的旋转。多粒子的捕获、移动和分选等。美国 器j翟 鼋董 9 繁 巾山大学硕士学位论文 c h i c a g o 大学的e r i cr d u 丘e s 鹏和d a v i dgg r i e r 【2 8 l 于1 9 9 8 年实现了世界上第一 个全息光镊系统。他们使用衍射光学元件( d o e ) 将准直的激光束分成多个独立 的光束，通过强会聚透镜聚焦后形成多光阱。 s t a n d r e w s 大学的n b s i i l l p n 等人将光镊系统中传统的基膜高斯光束 改为l 丑g u e r 托g a u s s i a n 光束，光束能够将水中悬浮的透明玻璃小球或者聚四氟 乙烯小球旋转起来。这种能够使微粒旋转的光镊被人们形象的称之为“光扳手” 1 2 引。光镊的光致旋转技术有望用于制备驱动微机械马达。q u e e 璐l a n d 大学的 f r i e s em e j 等人利用h g u e 盯c g a u s s i a n 光束使得具有弱吸收性的陶瓷颗粒及 金属氧化物颗粒旋转起来，之后他们又通过线偏振光实现了透明的双折射晶体 的快速转动。 1 3 国内光镊技术的发展与研究现状 中国科技大学激光生物实验室于1 9 8 9 年开始研究激光光镊( l o t ) 技 术及其以光镊为核心的光学微处理技术，是国内最早开展此项研究的单位。 他们开展了微小粒子( 微米，亚微米和纳米尺寸) 的光学微操作与微加工 技术，及其在生命科学等领域的应用研究。二十多年来，在李银妹教授的 指导下，该研究组已在光镊技术的理论基础、实验技术和实验系统研究方 面取得了很大进展，并对这一技术在生物领域中的应用进行了大量的探索。 中国科学院物理研究所的张道中教授研究组在光镊中粒子捕获力的理论分 析、光镊实验系统中微位移和力的测量、光镊在生物细胞和生物大分子的 生物特性分析等方面进行了较深入的研究。山西大学的降雨强应用光镊这 一现代化的手段在微观上对单个细胞及微管蛋白等生物大分子的生物行为 进行了较深入的研究。测定了单个白细胞在各种条件下的膜丝力，从理论 和实验两个方面研究了膜丝形成的力学机制【3 0 1 。浙江大学的王晓娜将激光 捕获技术用于微细加工【3 1 1 。中国农业大学的徐春华利用双光镊技术研究了 微管系统的分子力学性能，包括荧光标记微管断裂力的测量、微管弹性的 研究和微管蛋白与微管相互作用力的研究【3 2 1 。广西医科大学的谢健应用了 光镊固定活细胞，同时应用激光拉曼技术对活细胞进行了拉曼光谱测定。 光镊和激光拉曼光谱技术被巧妙的结合起来，用于在肿瘤诊断的基础研究 【3 3 1 。中科院西安光学精密机械研究所姚保利研究小组掌握了激光光镊、飞 秒激光光刀等技术，并研发出了具有自主知识产权的激光光镊产品，在特 殊光束及特殊微粒光学捕获力计算的理论研究方面取得了创新性成果【3 4 1 。 近些年来我国又涌现出一些光镊技术研究组，他们陆续开展了光镊系统及 其应用的研究工作。如清华大学、南开大学、南昌大学、苏州大学、中国 血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 科学院遗传所等单位。这一悄然兴起的现代化光学微操作技术已逐渐引起 我国学者的重视。 1 4 本文主要内容 本文主要包括以下几个方面：光镊的研究背景及其意义、光镊的原理 及其应用、光镊的光阱力理论研究、单光阱光镊系统实验平台的设计及其 搭建、光镊捕获微粒的实验操作、观察与分析。而且，利用我们搭建的单 光阱光镊系统对人的血红细胞膜的弹性进行了初步探索，并对实验结果进 行了简要的分析。 本论文的结构如下：第一章介绍了光镊技术发展过程以及国内外光镊 技术的研究现状，阐明了本课题的研究目的和意义；第二章介绍了光镊的 原理，阐述了光镊捕获微粒的条件，并且解释了梯度力、散射力、光阱等 概念，并详细分析了米氏微粒和瑞利微粒所受的光阱力；第三章设计了单 光阱光镊系统以及讨论了对光阱横向位置进行操纵时系统的稳定性等，并 且利用单光镊系统实现了酵母细胞的捕获，并且对捕获的结果进行了分析； 第四章介绍了利用单光阱光镊系统测量人的血红细胞膜弹性性能的方法。 提取了人的血红细胞并且对样本进行了精细的处理，标定了皮牛顿量级力 的测量系统。利用光镊拉动血红细胞膜的一端使得其变形测量血红细胞膜 的弹性，并对测量结果进行了简要的分析；第五章介绍了衍射光学元件的 设计原理和方法，简述了电控双折射液晶空间光调制器的相位调制原理， 并且搭建了全息光镊系统。采用了迭代傅立叶变换算法( i t e r a t i v cf o u r i c r t r a n s f o r m 砧9 0 r i t h m ，i f l a ，又称g e r c h b e r g s a x t o n 算法) 制作了全息图，产生 了预期光强分布的光阱。 巾山大学硕士学位论文 第二章光镊技术概述 2 1 光镊的定义 光镊，也就是光学镊子，它是一种利用光来实现操纵的工具。由于它具有 传统机械镊子夹持和操纵微小粒子的功能，所以我们称它为光镊。 光不仅有热效应，它还有力学效应。光镊，全名为单光束梯度力光阱，是 由一束高度聚焦的激光而形成的三维势阱。光镊是利用高度聚焦的激光束的力 学效应实现的【3 5 l 。它实际上是利用非均匀光场与微粒相互作用时形成的力学势 阱来操控微小物体的。光镊可以在三维空间实现稳定的非机械接触性的操作， 光镊的介入不会给研究环境造成影响。 通常情况下，一定强度和模式的激光束会聚到微米量级，形成激光微束。 激光微束对其焦点附近的、大小从数十纳米到数十微米级的电介质微粒不仅仅 产生沿着光束方向的散射力，还产生一个指向光束焦点的、大小正比于光的强 度梯度的力，也就是梯度力。梯度力，在一定条件下，可以使得微粒稳定束缚 在光束焦点附近。 与机械镊子相比，光镊是以一种柔和的非机械接触的方式捕获和操纵微粒 的。在激光高度聚焦的中心的周围一定区域内，微粒一旦落入这个区域内，就 有可能移向光束几何中心。这个特别的光场造成了一个势能较低的区域，即从 这个区域内到区域外存在一个势垒。在没有足够强的外力干扰的情况下，被捕 获的微粒不会偏离光学中心。它使粒子受到光学势阱的束缚而达到“镊”的效果， 然后通过移动光束来移动粒子。因此，光镊酷似一个陷阱。光镊是对光的 势阱效应的形象而通俗的概括【1 l 。 2 2 光的动量和光压 光的本质是电磁波。电磁波不仅携带能量，而且也携带动量【3 叫。光的力学 效应，是光具有动量的直接结果。携带动量的光与物质相互作用伴随着动量的 交换，表现为光对物体施加一作用力。作用主要表现为对物体的压力，所以称 它为光辐射压或者光压。 对于单色平面光波，设其电磁场能量密度为u ，以光速传播，相应的电磁 能流密度矢量的大小为s = “c ，方向为光的传播方向。单位体积的光场携带的 动量，也就是动量密度，为g 一“c ，方向沿波矢七的方向。单位时间流过垂直 j l i l 红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 光传播方向单位面积的动量为 g g c 一“一s c( 2 - 1 ) 根据光的量子理论，单色平面波可以看作为一束光子流，每个光子携带的 能量一枷，动量为： p j i l 七一 a 一c ( 2 2 ) 其中，h 为普朗克常数，a 为光波长。 光携带的能量e 和动量p 之间有如下关系： p e c ( 2 3 ) 其中，c 为光速。 光与物体相互作用的过程中，伴随着有动量的交换。一束平行光照射到物 体上，其动量变化为a p ，经历时间为t 秒。由动量守恒定律可知，物体得到的 动量为一p 。根据牛顿第二定律，作用在物体上的力等于光引起的单位时间内 物体动量的变化。由此可得出光作用在物体上的力为f 一一a p f 。如果光作用 面积为s ，那么光压为p f s 。 2 3 光镊中粒子的梯度力和散射力 我们选择电介质小球为模型来探讨光与微粒的相互作用。我们采用几何光 学近似来考察光穿过电介质小球时作用于小球的力。对于尺寸为几微米的小球， 几何光学是近似成立的，假设小球的折射率n 2 大于周围的介质折射率n l 。当一 束光穿过电介质小球时，由几何光学可以确定光线的传播路径，如图2 1 所示。 以a 、b 两条光线为代表，光线在进入和离开小球表面时发生折射，同时也在小 球表面发生反射。 中山大学硕士学位论文 图2 1 梯度力的产生 ( a ) 均匀光场( b ) 非均匀光场 f i g 2 - 1t h e 伊a d i e n tf o r c e ( a ) s y m m e l r i co p l i c a lf i e l d ( b ) a s y m m e t f i co p t i l 丘c l d 量改变 入射光a 图2 2 动量变化 f i g 2 - 2t h em o m e n l u ma l t e r a t i o n 由于光场强度分布不均匀，光束在小球表面折射时动量发生改变，小球将 受到指向最大光强处的力，我们称这个力为梯度力。如图2 2 所示。 这一结论可以推广到一般的存在光场强度分布不均匀的情况，尤其是存在 光场强度最大点的情形，例如被透镜会聚的光束焦点附近。在强会聚的光场中， 粒子将受到一指向光最强点( 焦点) 的梯度力。也就是说粒子是处于一个势阱 中，阱底就在焦点附近。光对粒子不仅有推力还有拉力，粒子就被约束在焦点 附近。这种强会聚的单光束形成的梯度力光阱就是所谓的光镊。 实际上，当光束穿过小球时，在小球表面会产生一定的反射，同时小球也 会对光有一定的吸收，这样光就会施加一推力给小球，此力通常被称为散射力。 散射力总是沿光线方向推微粒，而梯度力则是把微粒拉向光束的焦点处。光阱 主要是依靠梯度力形成的。稳定捕获是梯度力和散射力平衡的结果。只有当梯 度力大于散射力时，才能够形成稳定的光阱而捕获微粒。 血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 2 4 光镊的光阱力理论 目前研究光阱作用力的模型主要有两种：射线光学模型【3 6 l 和电磁场模型 【3 刀。射线光学模型以几何光学和动量守恒定律为理论基础，适用于微粒尺寸比 光波波长大的情况，也就是米氏( m i c ) 粒子；后者基于麦克斯韦电磁场理论， 适用于微粒尺寸比光波波长小的情况，也就是瑞利( r a y l e i g h ) 粒子。引文【3 “z j 的实验结果表明，当作用对象的尺寸比所用光波波长大一个数量级时实验结果 同射线光学模型计算结果吻合的较好，而当作用对象尺寸小于所用光波波长时 实验结果同电磁场模型吻合较好。 2 4 1 射线光学模型 当经物镜会聚的高斯光束照射到一个透明的均匀介质球形粒子( a h ) 时， 我们将光束分成许多条细光束，每条细光束在粒子表面将发生反射和折射。当 细光束折射进粒子内部将在粒子中不断发生反射和折射，如图2 3 所示。 jl p 1 r 少墨一” 图2 3 几何光学计算模型 f i g 2 - 3r a y - o p t i c sm o d e l0 fc a l c t i i a t i o n 细光束由光子流组成，每个光子携带有能量和动量，细光束传播方向的改 变引起光子动量的变化。根据动量守恒定律可知，细光束的动量传递给粒子一 部分，单位时间内细光束对粒子有力的作用。定义沿细光束传播方向的分量为 散射力f s ，垂直于细光束传播方向的分量定义为梯度力f g 。我们写出沿着z 轴 中山大学硕十学位论文 方向传播的光波中的一条功率为p 1 的细光束的散射力f s 和梯度力f g 的表达式 【3 6 】 。竽黜弛一雩慧掣 p c 。警m c o s 弛一雩祭掣 仁5 ， c上+ 。+ z n 1 的。 另外，被捕获的微粒要求是透明的。因为透明的微粒对光的折射大于对光 的反射，折射引起的梯度力才能够大于光的反射和吸收引起的散射力，才能够 稳定捕获微粒。一般情况下，聚苯乙烯小球、大部分细胞等常见的样品对某一 波段的可见光透明。 除了上诉基本的捕获条件外，还有许多因素对稳定捕获有较大影响。如激 光微束的功率、波长、束腰半径、微粒的尺寸以及球心与光轴和束腰的距离等。 这些因素都不同程度的影响着捕获效果舶l 。 中山大学硕士学位论文 第三章光镊系统设计及实验研究 3 1 单光阱光镊系统的基本组成 光镊系统是利用其光阱来捕获生物微粒。一般来说单光阱光镊是使一束激 光扩束准直后进入倒置研究型生物显微镜系统，再通过高倍、大数值孔径显微 物镜会聚后形成光阱。梯度场光学势阱将微粒捕获于焦点附近，人们通过显微 镜的成像系统进行观察、记录。在生物学领域，通过对光阱的操纵来实现对生 物微粒的捕获、翻转、移动等操作。通常来说单光阱光镊系统包括以下几个组 成部分【4 5 l ： ( 1 ) 激光器； ( 2 ) 激光光路调节系统； ( 3 )光路耦合系统； ( 4 ) 光阱微操作系统； ( 5 ) 实时观察、记录与图像处理系统； 光镊系统的基本组成框架如图3 1 所示。 图3 1 光镊系统的基本组成 f i g 3 - 1s l r u c t u r e0 ft h ei 璐t m 腓n t so fo p t i c a l 眦e z e r s 为了保证激光束聚焦的质量和操作的安全方便，我们对倒置生物显微镜进 行了改造。在显微镜的目镜前、c c d 摄像机与显微镜机体的接口处加入了针对 激光波长的滤波片，避免实验中强度很高的激光会灼伤人的眼睛和c c d 感光靶 面。在倒置显微镜的物镜和目镜之间加上了光路耦合器。从激光器发射出的光 束透过光路耦合器后经过显微物镜会聚在焦点附近形成光阱。光阱的形成并不 影响原来的光路成像系统。下面简单介绍各部分功能。 ( 1 ) 激光器光源 激光器是形成光阱的光源。激光器发出的光束被扩束准直后经显微物镜聚 血红细胞膜弹性性能的光镊实验研究 焦后形成激光微束，从而在焦点附近形成光学势阱。为了保证光阱质量，实现 对生物样本精确可靠的无损伤操作，应当选用波长、功率适当，性能稳定可靠 的激光器作为光源。目前国际上相关实验室中使用的多数是连续的、t e m 模 式的单模激光器。 ( 2 ) 激光的光路调节系统 为了保证光斑的质量，并且形成较大的光场梯度，在激光束进入显微物镜 汇聚前，应当对从激光器发出的激光束进行扩束、准直。根据光路设计的需要， 调节系统还包括偏转器、衰减片、滤光片等光学器件，用于控制光束的偏转方 向和强度。 ( 3 ) 显微镜聚焦、成像系统 显微物镜是光镊系统的核心，单光束梯度力光阱正是通过它使得激光束汇 聚而形成的。梯度力的作用使得进入激光微束焦点附近的微粒被囚禁。此外， 倒置研究型显微镜的光学成像系统正是光镊微操作的显微观察装置。 ( 4 ) c c d 观察、记录及图像处理系统 光镊系统需要具有较高的时空分辨率的观察系统来记录和分析被捕获的微 粒的动态过程。光镊系统需要一个具有实时观察、连续记录功能的监测与图像 处理系统。我们利用c c d 摄像头实现对实验操作过程的观察与记录。 光镊系统中选用卤素灯作为可见光照明光源，照亮视场。利用显微镜的目 镜或者与显微镜连接的c c d 摄像机观察。在显示屏幕上实时观察操控过程。由 于高强度的激光束会对人眼和c c d 摄像机产生危害，需要在目镜前和c c d 摄 像机前加滤波片。为了达到安全操作，大部分情况下还是选用c c d 观测法。另 外，基于c c d 图像处理的“光积分量重心提取法”可以对小球位移进行精确的测 量，但是时间响应较低。 另外，扩束后的激光与显微物镜之间加上了双向色分束器，它能够使工作 波长的光透过而其他的光反射。双向色分束器上面镀膜的要求根据实际所用的 波长设计。 3 2 单光阱光镊系统的设计 高斯光束经过显微物镜变换后，在束腰附近产生大的光强梯度，这样光束 才能够实现对微粒的捕获。显微物镜在光镊系统中不仅起聚焦作用，还是捕获 微粒时位移和力的测量的关键的光学器件，直接影响测量精度。微粒在束腰中 心位置前被稳定捕获，在实验中我们可以调节光路使得束腰中心位置接近于物 镜焦点，使得粒子被捕获的同时能够清晰的被观察到。单光阱光镊的设计示意 图如图3 3 。在我们的系统中，选用的是奥林巴斯的油浸显微物镜，1 0 0 ，数 t i ，m 大学碘学位论文 值孔径n a = l3 。如图3 2 所示 吲3 _ 2 奥林巴斯油浸物镜 f j 昏3 2 0 l y m p u so l l _ i r s i o no b j e c i j v c 在光镊系统。p ，物镜的分辨力的大小将影响对捕获微粒尺寸的选择所以我 们要考虑物镜的分辨力。物镜的分辨力由它的数值孔径和照明光线的波长决定。 物镜的分辨距离公式为 】 d 一06 1 = 一 h f 3 n 式子中 为照明光线的波长，n a 为物镜的数值孔径。所以选择短波长的 光源照明和利用大的数值孔径的显微物镜，叮以提高物镜的分辨力。 q 田 “，b q i l - _ 。 二 二r h ”“ 7 | 上_ b n 。一 m t k 蚓3 3 单光阱光镊系统示意幽 h g3 3 1 m o 叩1 1 c “s c h e m t i c s l r i 】c t u r eo f i l i eo 口i c a j f w e e z e r s8 p p 哪t u s s y m