（工程热物理专业论文）肾脏热物性参数测量及降温速率对细胞形态影响的实验研究.pdf

肾脏热物性参数测量及降温速率对细胞形态影响的实验研究m e a s u r e m e n to ft h e r m a lp a r a m e t e r so fk i d n e ya n de x p e r i m e n t a ls t u d yo nc o o l i n gr a t ei m p a c to nc e l lm o r p h o l o g y专业：王猩垫物理研究生：扬爱天津商业大学机械工程学院摘要采用学科交叉的研究方法，对肾脏低温延时保存的生物传热机理进行了基础性的研究。运用新的技术和方法，对肾脏及保护液物性参数和细胞形态学进行观察实验。该研究内容，是从热科学角度探索冰温延时保存离体肾脏传热机理所必须解决的基础问题。新实验方法的设计既是科学研究的可靠性手段，又是理论研究深入的基础。在查阅国内外生物物性参数研究现状的工作基础上，采用新的实验仪器及相关方法，获得肾脏及保护液的相关物性参数。因为肾脏组织和保护液热导率的精确测定是深入研究冰温延时保存肾脏的基础参数，利用差示扫描量热仪的m d s c 技术间接获取肾脏不同部位的导热率和相变点，且对不同工况条件下的保护液冰点进行了深入研究分析；使用果蔬热物性测试系统可以直接测量并能同时获得保护液的导热系数、比热和热扩散系数；通过低温显微系统对离体。肾脏组织冷却过程中，降温速率和温度对低温保存离体肾脏的细胞形态的影响进行了实验研究。经实验研究发现，用差示扫描量热仪进行肾脏组织导热率测定研究，存在一定的不确定因素，使得实验结果与参考数据虽基本相近，但二者存在微小的差异。肾脏冰点温度因测量部位不同，其生物组织结构的不同，在较小温度范围内波动；器官保护液冰点的测试较为准确。比较肾脏和器官保护液二者的冰点温度，相差0 1 ，说明器官保护液用于肾脏冰温延时保存具有可行性。通过对四种降温速率下肾脏细胞形态学观察比较可以发现：降温速率越小，肾脏细胞形态的完整性越好，对功能细胞膜的损伤越轻；相反，较大的降温速率对细胞损伤较为严重，尤其是肾小管结构。需要指出的是，肾脏组织内细胞多为功能细胞，无疑增加了对组织微观实验研究的难度，本文在此方面仅做了初步的尝试。上述结果为冰温用于离体肾脏的延时保存，提供了有价值的理论依据和实验方法。关键词：热物性冰点降温速率细胞形态a bs tra c ti n t e r d i s c i p l i n a r yr e s e a r c hm e t h o d sh a v eb e e nu s e ds t u d yo fm e c h a n i s mo fh e a tt r a n s f e rd u r i n gt h eo r g a nc o l dp r e s e r v a t i o n t h er e s e a r c ho ne x p e r i m e n to ft h e r m a lp r o p e r t i e so fk i d n e ya n do r g a np r e s e r v a t i o ns o l u t i o na n dt h ec e l lm o r p h o l o g yi nt h i sp a p e ri sd o n ew i t ht h en e wt e c h n o l o g ya n dm e t h o d s ，w h i c hi sh i g hc o n c e r nr e s e a r c hi nt h ef i e l do fb i o h e a tt r a n s f e rs c i e n c e f u r t h e r m o r e ，a sat o p i co fc o m m o nc o n c e r n ，i ti sak e yp r o b l e mt h a th a st ob es o l v e dd u r i n gc o l dp r e s e r v a t i o ni nk i d n e yh e a tt r a n s f e rm e c h a n i s mb ya d o p t i n gt h e o r ya n dm o t h e ro ft h e r m a ls c i e n c e a d v a n c e dt e c h n o l o g yb e i n ga d o p t e di ne x p e r i m e n ta n dt h e o r yr e s e a r c hn o to n l yaw a yt h a tm a k e st h e ms c i e n t i f i c a l l y ，a l s om a k e st h e md e e p l y b a s e do nk n o w l e d g eo fe x i s t i n gr e s e a r c hs t a t e sa n dr e c e d i n gj o b san e wt e c h n o l o g yi sl e a d - i nt og e tt h er e l e v a n tp a r a m e t e r so fk i d n e ya n do r g a np r e s e r v a t i o ns o l u t i o n c o n s i d e r i n gt h ea c c u r a t em e a s u r e m e n to fc o e f f i c i e n to fh e a tc o n d u c t i v i t yi sa l w a y st h eb a s i cc h a r a c t e r i s t i cp a r a m e t e r so nb i o h e a tt r a n s f e rs t u d y ，t h em d s ci sa t t e m p t e di nt h ep a p e rt og e ti ti n d i r e c t l y ；a n dt oo b t a i nt h ef r e e z i n gp o i n tf o rk i d n e ya n dp r e s e r v a t i o ns o l u t i o n i nd e p t hr e s e a r c ho r g a np r e s e r v a t i o ns o l u t i o nc o n d u c t e df r e e z i n gp o i n tt e s tu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ；t h e r m o p h y s i c a lp r o p e r t i e sm e a n ss y s t e mi st a k e ni nu s et om e a s u r et h et h e r m a lc o n d u c t i v i t y , s p e c i f i ca n dt h e r m a ld i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fo r g a np r e s e r v a t i o ns o l u t i o n ；t h r o u g hl o w t e m p e r a t u r em i c r oc o o l i n gs y s t e mi nt h ek i d n e yt i s s u e ，o b s e r v e dt h ec e l lm o r p h o l o g yo fv i t r or e n a la tt h ed i f f e r e n tc o o l i n gr a t ea n dc r y o p r e s e r v a t i o nt e m p e r a t u r e t h em i c r o s t r u c t u r e sw e r ea n a l y z e da n dc o m p a r e db yt i s s u es e c t i o n t h em e a s u r e m e n tr e s u l tf o rt h et h e r m a lc o n d u c t i v i t yo fk i d n e yb yt a k i n gu s eo fm d s ci si n f l u e n c e db ys o m ef a c t o r s a l t h o u g ht h er e s u l t sa r ea l m o s tt h es a m ew i t ht h er e f e r e n c ed a t a ，b u tt h e r ea r ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h e m f r e e z i n gp o i n tt e m p e r a t u r ef l u c t u a t e sb yas m a l lm a r g i n ，b e c a u s eo fr e n a lc o r t e xa n dm e d u l l ah a sd i f f e r e n ts t r u c t u r e t h e r ew a sad i f f e r e n c eo fo 1 b e t w e e nf r e e z i n gp o i n tt e m p e r a t u r eo fk i d n e ya n do r g a np r e s e r v a t i o ns o l u t i o n c o m p a r e dw i t hc o o l i n gr a t e ，f o u n dt h a tt h es m a l l e rt h ec o o l i n gr a t e ，t h eb e t t e rt h ei n t e g r i t yo fr e n a lc e l lm o r p h o l o g y ，c e l lm e m b r a n ed a m a g em o r el i g h t c e l ls t r u c t u r ew a sd a m a g e dw i t hf a s t e rc o o l i n gr a t e ，i np a r t i c u l a r ，t u b u l a rs t r u c t u r eh a sb e e nm o r es e r i o u si n j u r y i tm u s tb ep o i n t e dt h a te x p e r i m e n t a ls t u d yo ff u n c t i o nc e l l si sd i f f i c u l t ya n dc o m p l e x i ti sap r e l i m i n a r ya t t e m p ta n dn e e df u r t h e re x p l o r e k e y w o r d s ：t h e r m a lp r o p e r t i e sf r e e z i n gp o i n tc o o l i n gr a t ec e l lm o r p h o l o g y目录第一章前言11 1 引言11 1 1 生物传热学11 1 2 器官移植11 2 肾脏保存的研究进展31 3 冰温技术51 4 本论文的研究方法和内容7第二章肾脏组织热物性参数实验研究82 1 引言82 2 差示扫描量热仪82 3 实验对象及实验设备92 4 实验步骤及方法92 4 1 校j 下仪器92 4 2 热导率实验1 02 4 - 3 冰点实验l o2 5 实验结果与分析l l2 5 1 热导率1 12 5 2 冰点温度的测量l82 6 讨论2l2 7 本章小结2 l第三章器官保护液热物性实验研究2 33 1 引言2 33 2 果蔬热物性测试系统2 33 3 实验对象及实验设备2 33 4 实验步骤及方法2 43 5 实验结果2 53 6 讨论2 73 7 本章小结2 8第四章肾脏细胞形态的实验研究2 94 1 引言2 94 2 低温显微系统及其应用3 04 3 实验仪器及药品314 3 1 仪器3l4 3 2 药品3l4 4 实验步骤及方法314 5 实验结果一3 34 5 1 温度对低温保存中肾脏细胞形态影响3 34 5 2 降温速率对肾脏细胞形态的影响3 44 6 讨论3 74 6 1 保存温度对细胞形态的影响3 84 6 2 降温速率对细胞形态的影响3 84 7 本章小结3 9第五章结论与展望4 05 。1 结论4 05 2 展望4 0参考文献4 2攻读硕士期间论文4 6主要符号表一4 7学位论文独创性声明4 8致谢4 9第一章前言1 1 引言1 1 1 生物传热学第一章前言生命体具有生命自律的“活力”，是一个开放系统，离不丌与赖以生存的环境进行物质能量的交换，而且生命体中不仅有生理因素，还有各种感觉器官造成心理上随机性的动态反应，由此决定了活体运输过程本质的非定常性。近年来，随着人们对人体生物传热现象的研究逐渐从定性过渡到定量，其结果直接刺激了人类深入认识人体传热特性、传热机制的迫切性，并形成了- - i q 新的学科生物传热学。生物传热学涵盖了生物、热物理、临床医学等多个领域的交叉学科，是正在蓬勃发展中的学科。生物体是一个精密的多参数调控的自适应动态平衡，它由各种功能多层次分系统有机地组成综合协调系统。所以在生物组织内传热、传质以及生物体与环境之间能量传递和调控的过程十分复杂。它研究的是生物体内物质和能量的传递动态变化过程并加以有效应用，在临床医学工程领域中其内容具有极其重要的理论意义和应用价值。其核心的研究内容包括从细胞、亚细胞层次到组织、器官直至整个生物体内的热质传递规律和动态调控机理。其研究方向涉及对人体器官，系统正常和异常热生理过程的解释和阐明，并应用复杂而精确的数学模型对其进行描述；对各种生命层次上热参数的测量并建立相应的测试仪器：对在传热、传质过程中具有重要意义的物性参数的测定；对各种热物理因子作用于人体及各种生物材料时产生的热学效应的研究；热物理学应用于医疗实践等【i 】。它已成为横跨诸多领域的最新的学科生长点之一，已成为当今学术界竞相关注的前沿。弄清生物组织内热量的传导规律和动态调控机理是现代生物传热学面临的巨大挑战之一。1 1 2 器官移植1 9 5 4 年世界上首次施行同卵双生姐妹间的肾移植成功。7 0 年器官移植技术发展速度加快，其中肾移植始终占据首位。到目前为止，全球肾移植即达3 5 万余例，心脏移植3 万余例，肝脏移植4 万余例。心移植一年以上存活率在7 0 以上，肝移植则达8 8 。其中肾脏移植存活最长达3 7 年，肝脏移植存活最长达3 0 年2 。目前，世界第l 页第一章前言各国已先后在临床上开展了肾、心、肝脾、胰、腺、骨髓、。肾上腺、胰岛、甲状旁腺、肺睾丸、关节、胎胰、胎甲状旁腺、胎肾、胎胸腺、胰肾联合、肝细胞、脾细胞、脑细胞和神经组织等的器官移植。我国器官移植起步约晚于世界1 0 年，但进展较快，上述各种器官移植我国均已开展，并形成了自己的特点，特别是多种类别的胚胎器官移植在国际上处于领先地位。器官移植是活性移植，要取得成功，技术上有3 个难关需要突破。一是移植器官一旦植入受者体内，必须立刻接通血管，以恢复输送养料的血供，使细胞赖以存活，这就要求有一套不同于缝合一般组织的外科技术，而这种完善的血管吻合操作方法，直到1 9 0 3 年才由a 卡雷尔创制出来。二是切取的离体缺血器官在常温下短期内( 少则几分钟，多则不超过l 小时) 就会死亡，不能用于移植。而要在如此短促的时间内完成移植手术是不可能的。因此，要设法保持器官的活性，这就是器官保存。方法是降温和持续灌流，因为低温能减少细胞对养料的需求，从而延长离体器官的存活时间，灌流能供给必需的养料。直到1 9 6 7 年由f 0 贝尔泽、1 9 6 9 年由g m 科林斯( 均为美国人) 分别创制出实用的降温灌沈技术，包括一种特制的灌沈溶液，可以安全地保存供移植用肾的活性达2 4 小时。这样才赢得器官移植手术所需的足够时间。三是医疗上用的器官来自另一个人。但是受者作为生物有着一种天赋的能力和机构( 免疫机构) ，能对进入其体内的外来“非己”组织器官加以识别、控制、摧毁和消灭。这种生理免疫过程在临床上表现为排斥反应，导致移植器官破坏和移植失败。所以，同种移植后必然发生排斥反应，必须用强有力的免疫抑制措施予以逆转。到1 9 6 0 年才陆续发现有临床实效的免疫抑制药物：硫唑嘌呤( 1 9 6 1 ) 、泼尼松( 1 9 6 3 ) 、抗淋巴细胞球蛋白( a l g ，1 9 6 6 ) 、环磷酰胺( 1 9 7 1 ) ，这以后爿能使移植的器官长期存活。1 9 6 2 年美国j e 默里( 1 9 9 0 年诺贝尔生理学或医学奖获得者) 第一次进行人体肾移植获得长期存活，器官移植作为医疗手段，才成为现实。进入2 l 世纪的器官移植，是治疗末期器官衰竭唯一有效的根治手段。任何临床器官移植首先要有高质量的供体，这是器官移植成功的先决条件和根本保证，作为器官移植学三大支柱之一的器官保存曾经为此做出过重大的贡献，是器官移植学的基石。我国的肾移植数己超过2 万例。2 0 0 0 年，年移植数突破了5 0 0 0 1 歹0 ，仅此于美国，占世界第二，目前已有3 0 多个单位年移植数超过1 0 0 例，有的超过2 0 0 例，并拥有一支稳定的有经验的肾移植队伍3 1 。第2 页第一章前言随着器官移植技术的发展，国内外的供者不足问题h 趋严重，等待接受移植而死亡的患者数量每年都在递增。目前，我国尿毒症患者每年新增约1 2 万人，而每年肾移植手术仅为5 0 0 0 例左右，就是说仅仅约4 的患者才能得到肾移植的治疗。美国是世界上丌展器官移植最早的国家之一，据美国u n o s 网络统计，截至2 0 0 8 年2 月2 0 同，美国共计有7 8 8 2 9 名患者等待行肾移植手术，1 7 0 1 0 名患者等待行肝移植手术，而2 0 0 7年共实施肝移植手术5 9 4 1 例，肾移植手术1 5 2 8 9 f f 0 ，许多患者要等待数月至几年，甚至有些患者因等待不到合适的供体肾脏而永远离开了人世5 1 。现阶段，由于低温保存法方法简便而被器官移植广泛采用。由于保存方法或保存时间( 热、冷缺血时间过长) 的不当造成移植器官功能受损以致移植物丢失，这样的例子屡见不鲜，无疑对有限的器官资源造成浪费，从而加剧了供体器官短缺。因此，改善器官保存方法是至关重要的。这需要我们更深入了解保存期组织损伤的机制，减少灌注期问和保存期间的损伤，以改善器官保存质量。1 2 肾脏保存的研究进展临床肾移植的发展，需要提供大量有活力的肾。目前，尸体供肾已成为移植肾脏的主要来源。肾脏保存是使供移植用的肾脏在离体无血供状态下保持活力的措施。器官移植必需移植活的器官，因此，供移植用的肾脏，从切离供者体内之时起直到其主要血管与受者血管接通期间，始终保持着完整的解剖结构和活性，是移植成功的一个前提。但是，任何器官一旦失去血液供应，细胞得不到所必需的氧和养料，在常温( 3 5 - - - - 3 7 ( 2 )下于短期内即会死亡。能耐受的时间是极短的，如心、肝仅1 0 - - - 1 5 分钟，肾约在4 5 - 6 0 分钟，若超过上述时限，移植后就很难恢复功能。在临床实际工作中，则要求常温下的缺血时间越短越好，最好不超过3 - 5 分钟，最长不超过7 - 8 分钟。根本不可能在如此短促的时间内完成移植手术。因此，必需设法使离体肾脏的活性能长时问维持。器官的低温保存技术，国内外从7 0 年代至今一直在研究。目前较为成功的是细胞和简单组织的低温保存，因复杂组织保存中包含血管，血管的低温保存将带来一系列的问题。为此国内外众多学者在此方面进行了不懈的努力“御m 2 ”洲钥，同时也提出了学科交叉研究的重要性n6 1 7 1 8 1 。生物组织虽能在低温下长期保存，但却极容易在降温和复温过程中因溶液冻结、融化、以及溶液渗透压力变化等因素的作用而受到损害。与国外相比，国内研究器官低温保存的方法基本沿袭国外的经验，因为器官作为一个独第3 页第一章前言立的个体，其保存技术要比复杂生物组织团难的多。器官的低温保存方法包括在低温液体中的浸渍保存和用灌注液保存的灌注保存，前者由于方法简单被广泛使用。器官保存的目的是从供者体内摘出器官移植至受者体内的过程中最大限度减少缺血对离体器官造成的损伤。原则上，有两类方法可以延长离体缺血器官的活性。一是尽可能降低细胞对维持代谢必需物质的需求或增加其耐受力；二是设法不断地供给最低限度的维持细胞活性所必需的营养料。前者是低温，后者是持续灌流。机器持续低温灌流配有脉冲泵、膜式氧化器、流量计，用经过微孔过滤、经缓冲处理的沉淀血浆，作低温持续灌洗，不断地供给低温代谢必需的营养，并清除代谢产生的废物。此法一度应用甚广，由于价格昂贵、操作复杂、运送不便，还有可能产生各种机械性和免疫性灌流损害，现很少应用。目前最常用的方法是低温保存，一般说来，在0 - 4 的低温下，离体器官耐受缺血的时间可较常温时延长l o 倍。早期的低温保存是将离体器官放于冷溶液中，叫做单纯表面冷却法。但器官的中心深处部位降温较差，整个器官降温不均匀。后来改用冷( 0 4 ) 的灌洗液，利用重力作用，从离体器官的动脉迅速灌入，作短暂冲洗，这样不仅可清除血管内残留的有害物质，最主要的是器官的深部及外部均匀地降温到i o * c 以下( 1 5 。c 是最高限) 。然后将其保存于l 4 的溶液中，直到移植。这种方法叫做单纯低温灌洗保存方法( 亦称简单低温保存或冷贮存法) 。灌洗液和保护液可以相同，也可以是两种不同的溶液。保护液在器官移植手术中，自供体内切取器官并阻断其动静脉血管起，直到用冷灌洗液将其中心降温为止这段时间，称为热缺血时间；从降温到低温保存开始，到移植器官在受体内接通血管开放血流这一段时间，叫做冷缺血时间。热、冷缺血时间的总和即为总缺血时间。若该器官能始终保持其活性，移植后能迅速而完全恢复其功能，这个总缺血时间，即是该离体器官的安全保存期限。安全保存期限的长短，因保护液的种类不同而不同。开始时都应用等渗溶液，其电解质的组成与细胞外液相仿，如林格氏液、乳酸盐林格氏液( 平衡液) 等，这些溶液安全保存离体缺血器官的时间仍然较短，如肾的保存时间在1 2 d , 时以内，平均为5 4 , 时，供肝保存时间更短，仅约2小时。这么短的时间不能满足包括运送时间在内的器官移植所需的整个手术时间的要求。1 9 6 9 年美国g m 科林斯创制了一种与细胞内液组成相仿的溶液，要点是高钾、高镁、低钠的高渗溶液，在低温时可安全保存狗肾2 4 4 8 小时；临床应用证明离体人肾第4 贞第一章前言的安全保存时问达2 0 - 2 4 d 、时。在现代化的高速运送条件下这种溶液己能满足一国之内或国际问远距离传送的需要。科林斯创导的原则( 用仿细胞内液型溶液代替仿细胞外液型液来保存供移植用的离体无血器官) 是器官移植发展史上重要的一页。此后，有多种根据科林斯氏原则创制的实用的仿细胞内液型液问世，其中最著名的有科林斯自制的c o l l i n s c 液、e u r o c o l l i n s 液( 欧渊t c o l l i n s 氏液) 、s a c k s 液、r o s s 液。科林斯氏液之类溶液能有较长保存器官活性的机制是：其阳离子浓度与细胞内相仿，可防止细胞内外钠、钾离子的交换，避免细胞内钾外逸而丧失，而细胞内钾是细胞活性所必需。细胞膜两侧离子交换停止，可节存能量。溶液的高渗性能可防止细胞及其超微结构水肿。同济医科大学器官移植研究于1 9 8 2 年所创制的w m o i 号液，能安全保存供。肾3 0 3 6 小时，甚至可达4 0 5 0 小时。其主要的特点是内含a t p 、微量钙和葡萄糖酸盐，可提供肾脏在保存期间所需的能量，提高了细胞膜的稳定性，且其高渗性有效地防止细胞水肿。第二军医大学长征医院和上海市中心血站共同配制的改良r o s s 液( h c a 液) ，其成分包括：k + 、n a + 、m g s 0 4 、枸橼酸盐、甘露醇和腺嘌呤等，h c a 液是目前我国肾脏移植应用的主要灌洗和低温保护液，经2 0 多年的临床应用，尤于其配制简单，稳定性好，使用时不需添加其他药物，而得到广泛的认同。离体肾脏保存可分为短期( 1 周以内) 、中期( 1 周n 1 月) 和长期( 经月累年) 保存。目前成功的还仅限于短期保存。以临床保存经验来说，用机器持续低温灌洗法可安全保存3 天，用简单低温可保存2 4 7 2 d , 时；离体肾脏保存的最终目的是长期保存，以成立器官库，能最大限度地利用各种尸体肾脏来治病，但目前还远远不能做到。1 3 冰温技术冰温技术是由日本山根昭美博士f 式命名的，冰温的研究和技术开发已有三十余年，主要以食品保鲜为中心而发展。生物组织并非在零度开始冻结，而是拥有各自不同的固有“结冰点”，从零度以下到生物组织结冰点之间的温度叫做“冰温 。大多数的生物组织冰点都低于0 。c ，当温度处于冰点以上的温度时，组织细胞中含有许多糖类，无机盐，可溶性蛋白质等成分，而各种天然高分子物质以空间网状结构存在，使水分子之间的移动在某种程度上受到一定阻碍而产生冻结回避现象，因而细胞液与纯水存在差异。从生化意义上说，对于多数正常体温下的酶，若超出酶的最适反应温第5 页第一章前言度，则温度改变对酶反应速度起主要作用，温度每下降i o 。c ，其活性将下降1 5 2 0 倍。据此推算，从3 7 下降至o 。c ，酶的活性将下降1 2 1 3 倍，却不使酶遭到破坏，而且温度回升后酶必须能保持活性，才可保存器官的细胞功能。采用冰温保存与传统方法的最大区别在于：可以避免o 。c 6 0 。c 这段“危险温度区”。们所带来的诸多问题，但是保持器官的“活”性所要解决的问题仍将十分复杂。实验证实：将果物的温度控制在冰温带内可以维持其细胞的鲜活，贮存一年后其色泽、品味、以及各项生化指标均与刚刚采摘时基本相同，与普通冷库保存的鲜果质量截然不同加2 1 2 2 2 “1 。中国水产科学研究院研究的对虾无水充氧运输时问达到1 0 18 h ，集美大学生物工程学院对黑鲷( 鱼) 无水保活技术研究表明，通过适当梯度降温无需加保护液，使鱼处于深度休眠状态，将鱼置于温度为( 2 士0 5 ) 的保温箱中，在无水条件下保存6 小时后复水成活“们。保存的时间虽然短暂，但它却对作为整个生命个体低温保存的理论研究做了重要提示。与冰温技术相关的诸多问题已经引起众多学者的关注。通常认为o 4 是最适合器官保存的温度，这是因为人们认为低于o ，细胞内就会结冰，进而破坏细胞结构。但是细胞在o 以下结冰，这一假设并不是j 下确的。冰温保存是通过采取合适的降温速率，使生物组织降低到所对应的冻结点温度以上零度以下的某一温度，并严格维持这一温度而进行生物保存的一种理论和技术。一般认为当温度低于o 时细胞脱水：当温度低于0 5 6 。c ，细胞问质液体发生冷冻，但细胞内液仍维持未冷冻状态怖1 。冰温温度带虽然很窄，但在常温至冰温的相互转换过程中，生物组织传热和传质的变化却较复杂。低温是器官保存技术的基础，温度降低与组织耗氧及代谢抑制程度存在一定的关系。东京慈惠会医科大学曾进行利用冰温技术保存白鼠肝脏的研究。该课题首先找到老鼠肝脏的具体冰温点，并分别在4 。c 和0 8 保存鼠肝脏数十小时。之后对每个肝脏的部分功能进行了测试，! t h a t p ( 三磷酸腺甙) 、a d p ( 二磷酸腺苷) 署i i t a n ( 腺嘌呤核苷) 等说明其完好。m a t s u d a 2 6 1 通过比较u w 液中在4 。c ，o 。c ，一4 。c 下肝细胞的保存，发现低于零度的低温保存，在没有冰晶形成的情况下，可以明显提高保存效果。美国匹兹堡大学以及同本鸟取大学关于血液的冰温保存研究等“订。s a k a g u c h i “等研究在一1 保存的心肌细胞的功能和新陈代谢情况。研究表明器官保护液进入细胞形式的保存中，一l 保存与4o c 相比，可延长心脏保存时间。在加强缺血恢复、保存缺血时心肌腺嘌呤核苷酸和避免再灌注水肿方面都取得了良好的效果。不同的研究者对器官第6 页第一章前言的冰晶点得出了不同的结沦，m a z u r 1 研究认为肾脏胞浆冰点温度在1 以上，而j a c o b s e n 呦1 等人用h a p 2 液灌注肾脏后采用d t a 法测得的冰点温度是一0 2 。c 。其原因在于器官是由多类型的组织细胞构成，而不同类型的细胞，其冰点是有差异的。这些研究结果可以间接说明冰温技术用于延时保存肾脏大器官的可行性。1 4 本论文的研究方法和内容1 4 1 主要研究内容( 1 ) 肾脏组织热物性参数检测。进行生物体传热特性定量化的研究是生物传热研究进步的重要标志，而其中关于组织的热物性参数的研究已经成为了研究的关键。这是因为在各类生物组织传热模型中，都包含有热导率、热扩散率、比热容等最为基本的物理参数，它们是揭示生物材料的热传输能力和载热能力以及进一步开展生物传热研究的前提。( 2 ) 保护液热物性参数测量。实验研究h c a 保护液的导热率，扩散系数和比热容。本文的测量的热物性参数为离体肾脏冷灌注过程中保护液与组织的传热研究提供所必需的基础数据。( 3 ) 研究移植器官在冷却条件下，不同降温速率对器官“品质”的影响。探明活体器官在低温条件下传热传质的宏微观特性，据此寻求到合理的变温控制过程。第7 页第二章肾脏宝 l 织热物性实验研究2 1 引言第二章肾脏组织热物性参数实验研究生物组织热物性参数的精确获取属于生物传热领域的基础研究，生物组织热物性参数对于临床医学中预示组织内温度分布及其变化规律以及了解生物组织的传热传质特性具有十分重要的意义。离体肾脏热导率，关系到离体肾脏低温保存过程的数学模型的正确描述，对所设置的低温保存条件量化分析研究非常重要，是生物传热研究和数值模拟计算重要的热物性参数。本文将采用冰温技术进行肾脏的低温延时保存，肾脏作为一个独立的生物个体由不同的复杂组织组成，而不同组织其冰点温度点是不同的。通过对肾脏多部位冰点温度的测量，为整体器官的保存条件提供基础数据。2 2 差示扫描量热仪差示扫描量热法( d s c ) 是应用最普遍的热分析技术。1 9 9 2 年，r e a d i n g 等人发展了一种新的热分析技术调制式d s c 0 j 】，它使用了与传统d s c 相同的热流传感装置，但是在传统的线性变温程序上叠加了一个j 下弦调制( 振荡) 温度波以产生一个随时问连续增加但不是线性的升温模式。采用f o u r i e r 转换，m d s c 将两种升温速率同时作用于样品：一种是平均升温速率，它相当于普通标准d s c 在同样升温速率下的信号；另一种是调制升温速率，目的是为了在得到热流信号的同时得到热熔信号。m d s c 有着传统d s c 所不具备的优越性。( 1 ) 在m d s c 的试验中同时提高灵敏度和分辨率。d s c 的灵敏度和分辨率受升温速率的影响。升温速率快，灵敏度提高，分辨率下降；生温速率慢，分辨率提高，灵敏度下降。m d s c 可以解决这个问题是因为它有两个升温速率，既有足够低的基础升温速率用以改善分辨率，又有较快的f 弦升温速率来提高灵敏度。( 2 ) m d s c 提高了弱转变过程的灵敏度。传统的d s c 由于基线弯曲度和漂移限制了微弱转变过程信息的准确度，并增加了测量的复杂性。m d s c 采用如下等式( 1 )取得热熔信号消除了基线弯曲和漂移：( 2 1 )第二章肾脏组织热物性实验研究( 3 ) 图谱分析更容易理解，能将样品区分为可逆和不可逆过程，清晰而准确的表明各种转变的本质。【3 2 1 如焓恢复、挥发、结晶、热固化、蛋白质变性、淀粉凝胶、分解等为动力学过程，能清楚的反映在不可逆的热流曲线上；热容、玻璃化转变与热熔有关，反映在可逆的热流曲线上；对于熔融等一些其他过程有可能在可逆和不可逆热流曲线上同时出现信号。3 3 1( 4 ) 准确测量聚合物的结晶度。某些物质在受热时会发生聚集形态的转变，如熔融和结晶，这两种过程的焓变就结合到了一起1 3 4 1 。其中直接可测量比热值的功能在本实验中尤为重要，因为比热和热导率是相关性质。2 3 实验对象及实验设备t a 公司q d s c 系列q 1 0 0 0 差示扫描量热仪，如图2 1 ，附件包括：铝制坩埚、密封机；猪肾皮质和髓质；聚苯乙烯；保护液；胶头滴管；尺；手术刀；电子天平；镊子等。2 4 实验步骤及方法2 4 1 校正仪器图2 1 差示扫描量热仪第一个校准试验( 即空炉子实验) ，校准基线。池子罩没有任何样品和样品盘，只是加热空的池子。首先预热炉子，然后炉子温度保持在起始温度平衡5 m i n ，下一步是以恒定的加热速率( 1 0 c r a i n ) 加热至终止温度并保持平衡5 m i n 。设定的起始温度和终止温度点与以后做样品的温度范围相当。本实验选择一2 0 - - 一5 0 c 的温度区间。第9 页第二章肾脏组织热物性实验研究第二个校准试验一蓝宝石校正，试验方法同上，只是需要在样品和参比台上各放置一枚蓝宝石圆盘( 不带坩埚) 。池子常数和温度校j 下。这个试验需要金属铟，利用熔融过程吸热的大小和铟的熔点对池子和温度传感器校正。试验温度范围比以后做的实验温度范围稍微大一点，加热速率与以后做实验的速度相当。m d s c 比热校准。校准使用己知特定温度下的标准材料( 铟和蓝宝石) 。实验开始前将热容校准常数( 总热容和可逆热容) 手动设定为默认值1 0 。实验结束后，总热容和可逆热容的校准常数是需要温度范围内热容的理论值和测量值之比的平均数，最后将这两个常数输入仪器控制软件，软件将自动应用到以后所做的实验中1 3 5 1 。2 4 2 热导率实验热导率校正采用一己知低热导率材料，本实验选用聚苯乙烯。用手术刀在聚苯乙烯上取一定质量的圆柱体试样两块( 质量均小于2 5 m g ，厚度一块小于0 5 m m ，一块大于2 m m ) ，用千分尺测量两块样品的直径和厚度，用电子天平称重，并记录两个样品的质量，直径和厚度，然后分别放入两个铝制坩埚中，用专用密封机密封。在热导率校正运行期间，用手术刀在肾上、下段各取皮质和髓质一定质量的圆柱体组织样品两块( 质量均小于2 5 m g ，厚度一块小于o 5 m m ，块大于2 m m ) ，用千分尺测量各块组织的直径和厚度，用电子天平称重，并记录四个样品的质量，直径和厚度，然后分别放入八个铝制坩埚中，用专用密封机密封。热导率校j 下实验结束后，依次放入八只坩埚样品，设置自动取样功能，开始实验。m d s c 的运行条件：温度4 0 ，振幅1 ，周期为6 0 s 。四只坩埚为方便记录编号如下：肾皮质( 上) ：薄试样1 ，厚试样2 ；肾皮质( 下) ：薄试样一3 ，厚试样一4肾髓质( 上) ：薄试样5 ，厚试样6 ：肾髓质( 下) ：薄试样7 ，厚试样- 82 4 3 冰点实验在。肾上、下段各取一定质量的圆柱体组织样品，用电子天平称重，并记录数据，然后放入四个铝制坩埚中，用专用密封机密封。依次将坩埚放入炉子，设置温度程序：先降温至一2 5 c ，恒温1 5 m i n ，以1 0 m i n的升温速率升至2 0 c 。为了确保实验数据的准确性，每次实验都采用相同的温度程第1 0 页第二章肾脏组织热物性实验研究序。取5 , - 一1 0 m g 保护液，放入坩埚中，电子天平称重，并记录数据，用专用密封机密封。依次放入炉子，温度程序的设置同肾脏冰点实验。设置实验条件：高纯氮气的流量5 0 m l m i n ，升温速率为1 0 m i n 。2 5 实验结果与分析根据本课题的临床实验可知，腹腔打开时。肾脏暴露的瞬间，其表面温度分布均匀，且基本与腹腔内温度一致，大约为3 4 。c 左右。器官摘取后立即用1 的冷却液灌充至。肾脏呈均匀乳白色，此时移植外科医生根据临床经验认为已达到冷保存状态。本实验在所选取的温度范围内利用该方法得到3 4 的肾脏热导率。2 5 1 热导率单面热流模式经m d s c 扩展的理论公式【3 6 】：一些学者如c h i u 3 7 1 ，s i r c a r l 3 引，k e a t i n g 【3 9 1 ，d u s w a l t t 4 0 】都曾用热流型d s c 测量诸如热塑性固体、弹性体、热塑性熔体烟火等绝缘材料的热导率。在他们所用的试验中，试件被放在d s c 样品池中，与样品平台接触，热电偶测量试件一面的温度和流入热量。一已知温度的散热片与试件的另一面接触。由测量的热流值和d s c 样品池与散热片之间的温差，按一下公式计算热导率：d q d t = 一觑( d r l d x )( 2 2 )其中：q 一热量( j )t _ 时间( s e c )l 卜热导率( w m )t - 一温度( )x 一试件厚度( m )a 一试件横截面积( m 2 )相比c h i u 和其他人所做的稳定热流实验，m d s c 的调制热流使试样达到一动态平衡，可以通过在试样一面施加振荡升温程式来测量热导率。公式( 2 2 ) 中描述的单面热流模式经m d s c 技术扩展为公式( 2 - 3 )( 鲁) 2 _ 2 ( z 瑚2x 丽 1 - 2 e 甄2 z tc o 面s 2 z l 硒+ e 4 z l 协3 )其中式中：第二章肾脏组织热物性实验研究l 卜导热率( w c m )d q d t 一热流振幅( j s e c )( i ) 一角频率( 2 u s e c )旷样品密度( g c m 3 )c p - 样品比热( j g )z 2 一( o p c 。( 2 k )t 。广调制温度振幅( )l 一样品长度( c m )a 一样品横截面积( c m 2 )m 一样品质量( g )c 一表观比热( j * c )实验假设：试件为一j 下圆柱体，横截面积a 和长度l 固定，上下底面平行，密度和比热均匀。试样受热面有震荡控温系统设置。试件不受热面热流为零。试件边壁无热流。对于低导热率的材料，e 4 z l 项很大，因此方程最右边的项可近似取1 。将公式( 2 - 3 )整理，由于c = ( d o d t ) ( c o t 。) 及c o = 2 n p e r i o d ( p ) 。解k 得：k = ( 2 z c 2 ) “c p p a 2 尸)( 2 4 )对于正圆柱体：p = m a l ，a = n d 2 4 ，公式( 2 4 ) 变为：k = ( 8 l c 2 ) ( c y d 2 尸)( 2 5 )( 二) 热导率校正常数d 3 6 1般认为由于试样边壁的热能损失造成热导率实验值与理论值之间有o 0 3 0 0 4 w 。c 的差值。这一差值对于热导率低的材料，使之与理论值有较显著的偏离；但对于热导率较高的材料，如玻璃材料，则差异不大。而且实验研究表明m d s c的测量精度随热导率的降低而降低。对于聚苯乙烯，其导热率特别低，影响测量精度的因素还包括试样周围的载流气体的热导率。因为在载流气体条件下，边壁无热流的假设并不严格。采用热导率校正常数即可确保准确度和精度，修正边壁的热能损失造成的影响。对于低热导率材料( 聚苯乙烯) ，校正常数d 可由公式( 2 6 ) 计算得出：第1 2 页第二章肾脏组织热物性实验研究d = ( k o k ，) o 5 一k ，( 2 - 6 )式中：d 一热导率校j 下常数一材料热导热实验值k 。一材料热导率理论值将校f 常数d 代入公式( 2 6 ) ，即可计算待测材料的热导率：k = k o 一2 d + ( k 0 2 4 胱o ) o 5 2( 2 7 )这罩k 。为待测材料热导率的实验值，由公式( 2 - 5 ) 计算得出。实验结果( 1 ) 数据记录：四只坩埚样品的测量结果，如表2 1表2 1 肾脏导热系数测定的实验数据( 2 ) 计算结果热导率修正系数聚苯乙烯的比热c p ( j 。c g ) 及表观比热c ( j 。c g ) 的实验值可从图2 - 2 ，2 3 得到：c n _ 2 3 2 1 j ( g ) ，c - - 1 0 2 9 j ( * c g ) ，c = 0 0 0 8 8 9 1 j 。c将各已知参数代入公式( 2 4 ) ，即可得到聚苯乙烯的热导率实验值k o ：k o = ( 8 l c 2 ) ( c p m d 2 p ) = 0 0 0 0 3 3 5 j ( * c c m s ) = o 0 3 3 5 w m k本实验采用的聚苯乙烯的真实热导率k r = 0 0 3 8 w m k得到d = ( k 。k ，) v 2 - k ，= - 0 0 0 2 3 w m k第1 3 页第二章肾脏组织热物性实验研究爹塞藿2芏爹星主2芏t e 州t 咖m c ，“_ _ “5 ”“”。图2 - 2 聚苯乙烯比热c p ( j 。c g )t e m p e r a t u r e ( c 1 ”。”“”“。图2 - 3 聚苯乙烯表观比热( j 4 c g )肾脏热导率i 肾皮质( 上)肾皮质( 上) 的比热c p ( j 。c g ) 及表观比热c ( j c g ) 的实验值可从图2 - 4 ，2 5得到：c p _ 4 8 3 7 j ( g ) ，c = 4 1 3 9 j ( 。c g ) ，c = 0 0 5 2 4 4 1 j 。c将各已知参数代入公式( 2 4 ) ，即可得到肾皮质的热导率实验值k l ：k i = ( 8 l c 2 ) ( c p m d 2 p ) = 0 0 0 4 0 2 5 j ( 。c c m s ) = 0 4 0 2 5 w m 。k运用公式( 2 - 7 ) 及热导率校正常数d 修正得出k ：k ；= i k l 2 d + ( k t 2 - 4 d k l ) o 1 2 = 0 4 0 7 1w m k第1 4 页第二章肾脏组织热物性实验研究爹薹害&3至多萋害&8至 f e w , 岬t u m c ) 州- _ _ w 芏u h - - _ -图2 4 肾皮质( 上) 比热c p ( j 。c g ) l e m 坤r a t u m ( c ) _ _ v 镕1 h m 图2 - 5 肾皮质( 上) 表观比