微生物的实验室培养

课题1微生物的实验室培养,基础知识,（一）培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质叫做培养基。配制成液体状态的基质称为液体培养基。配制成的固体状态的基质称为固体培养基。,在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成实验室最常用的琼脂固体培养基。,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。液体培养基主要用于工业生产。（2）按功能分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分，可分为天然培养基和合成培养基。,1、培养基的类型：,2.培养基内所含的营养物质,(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐,常见的选择培养基：,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离自生固氮微生物不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入纤维素的培养基:分离能分解纤维素的微生物加入含有某种除草剂培养基:分离能降解某种除草剂的微生物,(1)碳源：,无机碳源:、有机碳源：,蛋白质,脂肪酸等,自养型微生物以无机碳为碳源，异养型微生物以有机碳为碳源。,碳酸盐,碳酸氢盐,二氧化碳,糖类（主要）,凡是能为微生物生长繁殖提供所需碳元素的营养物质,碳源的分类:,(2)氮源,氮源的分类:无机氮源：、有机氮源：,蛋白胨,牛肉膏,尿素等,氮气,氨气,硝酸盐,氨盐,(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件,3.培养基内所需的其他条件,(二)无菌技术,1、获得纯净培养物的关键:2、无菌技术包括的四大方面(参看教材15页)3、消毒与灭菌(1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸等紫外线消毒,(不包括芽孢和孢子),防止外来杂菌的入侵,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,（2）灭菌,概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a灼烧灭菌b干热灭菌c高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具(接种环、接种针)、其他金属用具、试管口或瓶口,适用范围：,干热灭菌160170；12h,适用范围：能耐高温的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)具体方法：P85附录4,高压蒸汽灭菌100kPa12115-30min,通常用于培养基的灭菌,具体方法：P85附录4,消毒与灭菌的区别,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,消毒,P15-16旁栏思考,灭菌,灭菌,思考：为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?,防止营养成分被破坏,微生物实验室培养的基本操作程序,1.器具的灭菌2.培养基的配制3.培养基的灭菌4.倒平板5.微生物接种6.恒温箱中培养7.菌种的保存,实验操作,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1、计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。,2、称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较粘稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。,3、溶化将称好的牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中，不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加自来水100mL。,4、灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121条件下，灭菌1530min。将培养皿用几层旧报纸抱紧，58套培养基作一包，包好后放入干热灭菌箱内，在160170下灭菌2h。,5、倒平板待培养基冷却到50左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。,倒平板,?,思考1,溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?加琼脂的目的是什么?,可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差,作为凝固剂,思考2,在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？培养皿能否用高压蒸汽灭菌？,?,在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用,不能,因为培养皿要保持干燥,应该采取干热灭菌.,1.培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,P17倒平板操作的讨论,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,(二)纯化大肠杆菌,常用接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,P18讨论：,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。,稀释涂布平板法,1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。,系列稀释操作：,2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。,3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。,注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处.,涂布平板操作：,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,P19讨论：,微生物的恒温培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基放在37的恒温箱中培养，培养12h和24h后，分别观察各培养皿中菌落的生长情况,微生物的恒温培养,平板画线法获得的菌落,稀释涂布平板法获得的菌落,稀释涂布平板法获得的菌落,结果分析与评价,1、未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？（对照组）没有。若有菌落，说明灭菌不彻底。2、在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立的菌落？这些菌落的颜色、形状和大小相似吗？是。相似。如在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。,3、培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因。菌落的大小不同，菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大。4、如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？说明有杂菌污染。可能原因：灭菌不彻底、接种过程或培养过程中有杂菌污染。,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法,课题延伸,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、