（生物物理学专业论文）复杂生物体系中蛋白质分离分析方法的建立.pdf

中国医学科学脘中周协和医科大学顾i ：学位论文 a c t a p s b i s b s a d a d t t e s i h p l c i e x i d l c m s 瓜i s m a l d i o d o v a r p m r p l c p a g e s d s s c x l c t e m e d 中英文缩略语表 a c r - l a m i d e a m m o n i u mp e r s u l p h a t e b i s a c r y l a m i d e b o v i r es e r u ma l b u m i n d a l t o n d i t h i o t h r e i t o l e l e c t r o s p r a yi o n i z i t i n l l i g hp e r f o r m a n c 圮l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i n n e rd i m e n s i o n l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y r a n d o mm a s ss p e c t r o m y m a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z t i o n o u r e rd i m e n s i o n o v a l b u m i n r o t a t i o np e rm i n u t e r e v c r 畿p h a s el i q u i dc h r o m a t o g r p h y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e s t r o n gc m i o ne x c h a n g el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y n n ，n n - t e t r a - m e t h y l e t h y l e n e 丙烯酰胺 过硫酸铵 甲叉双丙烯酰胺 牛血清白蛋白 道尔顿 二硫苏糖醇 电喷雾离子化 高效液相色谱 离子交换色谱 内径 液相色谱串联质谱 基质辅助激光解析离 子化 外径 鸡卵清蛋白 转分钟 反相色谱 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠 强阳离子交换色谱 四甲基乙二胺 中目医学科学院中国协和医科大学碗j ：学位论文 中文摘要 基于质谱技术的蛋白质组学已经成为当前生命科学领域的一个研究热点。质谱技 术提供了一种快速、灵敏的鉴定蛋白质混合物的方法。但在蛋白质组学研究中，质谱 鉴定前多采用对蛋白质混合物酶切，产生更复杂的多肽混合物的样品制备方式，复杂 程度过高的样品导致蛋白质鉴定结果的低覆盖率和高假阳性率。基于以上原因，本研 究的目的是建立复杂生物体系蛋白质分离方法，在蛋白质水平上进行蛋白质的分离分 析，以提高蛋白质鉴定的可靠性，适应蛋白质组学研究发展的需要。 本课题的主要工作是在蛋白水平上建立一种简单、高效的蛋白质分离方法，研究 对象为血清蛋白谱。具体研究如下：1 ) 通过对不同类型的反相色谱填料c 4 、r 2 、 强阳离子交换( s c x ) 色谱填料和新型离子交换色谱填料分离血清蛋白所得色谱结果 比较，确定新型离子交换色谱填料具有较高的分离效率；2 ) 优化流动相的流速、样 品迸样量和微毛细管柱尺寸。获得最佳分离条件；3 ) 优化梯度洗脱条件，确定分离 血清蛋白样品的最佳方法；4 ) 评价分离方法的重现性；5 ) 按照色谱分离峰与时间相 结合的办法收集组分，随机选取两组分经过l c - - m s m s 的方法鉴定出可信度) 9 0 的四种蛋自：g a p j u n c t i o nb e t a1 p r o t e i n 、r a s - 3 2 、r a s - 1 0 和c o n s e r v e dh y p o t h e t i c a l p r o t e i n ；6 ) 应用建立的色谱分离方法分离了同一胰腺癌患者术前术后血清，结果表 明该色谱方法可以高效的分离蛋白质混合物。 本实验建立了简单、高效的复杂生物体系中蛋白质分离方法，它不仅为提高蛋白 质鉴定的可信度打下了坚实的基础，同时有可能成为研究疾病发生机制、筛选早期诊 断标志物及评估愈后的一种新方法。 关键诃：血清蛋白质组，高效液相色谱，质谱，电喷雾离子化 中国医学科学院中周协和医科大学硕l ：学位论文 a b s t r a c t m a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) - b a s e dp r o t e o m i c sh a sb e c o m eah o ts p o ti nt h el i f es c i e n c e r e s e a r c h m st e c h n o l o g yp r o v i d e sar a p i d i t ya n ds e n s i t i v i t yt od e t e c ta n di d e n t i f yt h e p r o t e i n si nc o m p l e xm i x t u r eo fp r o t e i n s b u tt h ef a l s ep o s i t i v er a t eo fm s b a s e dp r o t e i n i d e n t i f i c a t i o ni sh i g h , w h i c hp a r t l ya r i s ef r o mt h e s a m p l ec o m p l e x i t y b e f o r em s i d e n t i f i c a t i o n m o s tc o m m o n l yu s e dm e t h o dc a l l e d “s h o t g u n i st h a tt h ea n a l y t e sb e f o r e b e i n gi n t r o d u c e di n t ot h em a s ss p e c t r o m e t e ra r ep e p t i d e sg e n e r a t e db ye n z y m a t i cc l e a v a g e o fam i x t u r eo fp r o t e i n s ，w h i c hc o m m o n l yr e s u l t si nc o n s e q u e n c eo ft h el i m i t e ds e q u e n c e c o v e r a g ea n dh i g hf a l s ep o s i t i v er a t e s b a s e du p o nt h ea b o v e - m e n t i o n e df a c t , o u ra i mi st o e s t a b l i s has i m p l ea n de f f e c t i v em e t h o df o rs e p a r a t i n gap r o t e i nm i x t u r ef r o mc o m p l e x b i o l o g i c a ls y s t e m , w h i c hc a ns a t i s f yt h en e e do f p r o t c o m i c sd e v e l o p m e n t o u rs t u d ym a i n l yf o c u s e so ne s t a b l i s h i n gas i m p l ea n de f f i c i e n ts e p a r a t i o nm e t h o do n t h em o l e c u l a rl e v e lo f p r o t e i n s t h ei n v e s t i g a t i o n sa r ea sf o l l o w s ：1 ) t od e t e r m i n eak i n do f n e wi o ne x c h a n g ep a c k i n gm a t e r i a l ss u p e r i o ro v e rd i f f e r e n tk i n d so fc h r o m a t o g r a p h i c p a c k i n gm a t e r i a l s , s u c ha sc 4 ，r 2 ，s t r o n gc a t i o ne x c h a n g ei nt h ep r o c e s so fs e p a r a t i n g c o m p l e xp r o t e i n si ns e r u m ；2 ) t oo p t i m i z ea n dg e tt h eb e s ts e p a r a t i v ec o n d i t i o n sb y c o m p a r a t i v ee x p e r i m e n t sa d o p t i n gd i f f e r e n tf l o wm t e s , t h el o a d e dq u a n t i t ya n dt h e d i m e n s i o no fc a p i l l a r y ；3 ) t oo p t i m i z et h eb e s tg r a d i e n te l u t i o np a a e r nf o rt h es e p a r a t i o n o fs e r u m ；4 ) t oe v a l u a t et h er e p r o d u c t i v i t yo ft h es e p a r a t i o nm e t h o d ；5 ) a c c o r d i n gt o c h r o m a t o g r a p h i cp e a ka n dt i m e ，t w of r a c t i o n sw e r es e l e c t e dr a n d o m l y , f o l l o w e db y l c m s ，m sa n a l y s i s ，a n dg a pj u n c t i o nb e t al p r o t e i n 、r a sa s s o c i a t e dp r o t e i n 3 2 、r a s a s s o d a t e dp r o t e i n l 0a n dc o n s e r v e dh y p o t h e t i c a lp r o t e i nw e r ei d e n t i f i e dw i t hc o n f i d e n c eo f g r e a t e rt h a n9 0 n o t a b l e l y , f o u rp r o t e i n si d e n t i f i e dh e r e i nw e r ea l ll o w - a b u n d a n c e p r o t e i n s ；6 ) t h i ss e p a r a t i o nm e t h o de s t a b l i s h e dh e r e i nh i g h l i g h t si t sa v a i l a b i l i t yb y c o m p a r i n gt h ea n a l y t i c a lr e s u l t sb e t w e e nt h ep r e o p e r a t i v es e r u ma n dt h ep o s t - o p 翻；i 砌 f r o mt h es a n l ep a n c r e a t i cc a n c e rp a t i e n t 2 中国医学科学院中国协和医科大学硕f 学位论文 a s i m p l ea n de f f e c t i v em e t h o df o rs e p a r a t i n gp r o t e i n sf r o mc o m p l e xb i o l o g i c a l s y s t e mw a se s t a b l i s h e d i t sn o to n l yt oi m p r o v et h ec o n f i d e n c eo f t h ep r o t e i ni d e m i f i c a t i o n , b u tg i v eas i m p l ea n dp o t e n t i a lp a t h w a yt of i n dt h ee n o r m o u si n f o r m a t i o na b o u tt h e p a t h o l o g i cm e c h a n i s m , t os c r e e ne a r l yd e t e c t i o nb o m a r k e r sa n dt oe v a l u a t ep r o g n o s i s a s s c $ $ b 圮b to f d i s e a s e k e y w o r d s ：s e r u mp r o t e o m i c s , h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , m a s s s p e c t r o m e t r y , e l e c t r o s p a yi o n i z a t i o n 3 中国医学科学院中国协和医科夫学硕f j 学位论文 前言 一、高效液相色谱法背景知识 色谱分析技术是分析化学中一个重要分支，广泛应用于制药工业、合成化学、生 物技术、临床化学、食品检测和法医学等多种领域。2 0 世纪初色谱技术起源于俄国 生物化学家茨维特的工作，2 0 世纪6 0 年代高效液相色谱法在经典液相色谱法和气相 色谱法的基础上发展起来。从色谱原理上讲，高效液相色谱法和经典液相色谱法没有 本质区别。由于科学技术的不断发展，新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒 固定相的出现使得经典色谱法的分析能力产生了质的飞跃。高效液相色谱法包括吸附 色谱法、分配色谱法、离子色谱法、体积排阻色谱法和亲和色谱法等。其中分配色谱 法又分为正相色谱法和反相色谱法。高效液相色谱法拥有诸多优点：1 ) 分离效能高， 柱效可达5 x 1 0 3 - 3 x 1 0 4 块米理论塔板数；2 ) 选择性高：3 ) 检测灵敏度高，广泛使用 的紫外吸收检测器，最小检出量可达l o 飞；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出 量可达1o 坦g ；4 ) 分析速度快，近年来出现的超高效液相色谱( u p l c ) 【1 1 更是大大 缩短了分离分析时间。高效液相色谱技术已经应用于无机离子、有机分子、核酸、多 肽和蛋白质的分离。近年来，新技术和新方法亦不断出现，主要包括：1 ) 新型固相 填料的研制；2 ) 新型流动相的使用；3 ) 新型检测器的扩展应用和h p l c 仪器自动化 程度的迅速提高；4 ) 全新分析方法的涌现；5 ) 多维液相色谱和质谱联用技术的快速 发展，使得高效液相色谱法在生命科学领域的应用更加广泛。 离子交换色谱是高效液相色谱中一种重要的分离模式，随着生命科学的进一步发 展，离子交换色谱在分离生物大分子上显示出更多的优势。离子交换色谱分离蛋白质 的过程，主要是利用蛋白质具有彼此不同的电荷而进行选择性的分离。蛋白质是多价 可解离的生物大分子，不同蛋白质所带电荷不同，因此它们与离子交换填料的相互作 用也不同。蛋白质和离子交换填料之间的相互作用方式是多种多样的，这使得离子交 换色谱技术具有很高的分离能力。 二、胰腺癌相关背景知识 4 中国医学科学院中国协和医科大学硕i 擘位论文 胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，由于解剖位置特殊，起病隐匿，侵袭性 强，缺乏有效的早期诊断方法，使其在西方国家是第四大恶性肿瘤，5 年存活率不足 1 1 2 1 ；在中国是第六大恶性肿瘤，5 年存活率1 - 3 1 甜。近年来，其发病率呈现明 显上升趋势。中国王丽1 4 1 等以中国疾病监测点收集人i = 1 及死亡资料为基础，对全国疾 病监测点人群年的胰腺癌死亡资料进行统计分析，结果显示1 0 年问( 1 9 9 1 2 0 0 0 年) 死 于胰腺癌者1 6 1 9 人，占肿瘤死亡的1 8 7 ，死亡率由1 9 9 1 年1 8 3 增加到2 0 0 0 年 的2 2 6 。尽管过去的几十年医学技术取得了很大进展，但在提高胰腺癌诊治方面并 未取得明显进展。虽然一些新的影像学诊断技术( 包括逆行胰胆管造影技术、磁共振 胰胆管成像技术和电子计算机x 线断层扫描技术) 和血清学肿瘤标志物( 包括 c a l 9 - 9 睁j 、d u p a n 2 和c a 2 4 2 ) 的检测已用于胰腺癌的早期诊断，但结果并不理想。 因此，现在需要寻找新的途径解决胰腺癌诊治的难题。 三、血清蛋白质组背景知识 蛋白质组( p r o t e o m e ) - - 词是w i l k i m 最先提出来的1 6 1 。最早见诸于1 9 9 5 年7 月的 e l e e t r o p h o r e s i s 杂志上，它是指一个基因组所表达的全部蛋白。随着蛋白质组研究的 快速发展，2 0 0 1 年y a t e s 提出了蛋白质组学( p m t e o m i c s ) 的概念n 它被定义为- - f l 表 征和分析生物体内的全部蛋白质、蛋白质问的相互作用以及蛋白质修饰的科学分支。 当前蛋白质组学研究主要有两种策略，一种是“b o t t o mu p ”疆9 1 法，即首先对提取 的蛋白质混合物进行酶解，然后经液相色谱分离和在线质谱鉴定，搜索蛋白数据库和 人工释图，最后确定鉴定结果 1 0 - 1 3 1 。这种策略相对简单，比较成熟，获得了应用广泛， 但是这种策略有一定的局限性。主要表现为：1 ) 由于蛋白酶解产生大量的肽段，致 使原始样品的复杂度显著增高；2 ) 不同实验室之间很难获得高重复性；3 ) 蛋白质鉴 定依赖于对少数肽段的分析，可能导致蛋白质修饰信息的丢失；4 ) 高丰度蛋白掩盖 低丰度蛋白的检出；5 ) 鉴定结果假阳性率较高。另外一种可替代的策略是 t o p d o w n “体1 6 1 ，即对蛋白质混合物分离后在蛋白水平上直接进行质谱鉴定分析。当前有 几种因素限制这种策略的广泛应用：1 ) 目前分离技术还不能把较复杂的蛋白混合物 分离成单个蛋白质组分或简单蛋白质混合物后进行质谱鉴定；2 ) 现阶段质谱能够直 接鉴定的蛋白质分子质量最大能到2 2 9k d a l l 7 1 ；3 ) 自动化程度低；4 ) 费用高、耗 5 中国医学科学院中周协和医科大学硕l ：学位论文 费时间。虽然 t o pd o w n 策略受到以上几点因素的限制，但其在提高蛋白质结果可信 度，研究存在复杂的剪接体变化和翻译后修饰的真核生物蛋白质组1 1 8 i 方面，并在提高 复杂生物体系中蛋白质分离效率的前提下，这种策略是非常有希望的。 血清蛋白质是血液的重要成分，在维持内环境稳定、承担物质的运输、免疫防御、 凝血以及抗凝血等方面具有重要作用。根据其来源和功能可分为：1 ) 组成性蛋白， 主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它们在血清中发挥作用，如白蛋白、纤维蛋白原等； 2 ) 免疫球蛋白，血清中大约含有上千万种抗体；3 ) “远程”受体和配体，如胰岛素、 促红细胞生成素等各种多肽和蛋白激素；4 ) “局部”受体和配体，如i l 8 等细胞因子； 5 ) 一过性通过蛋白，如溶酶体蛋白酶；6 ) 组织渗漏蛋白，如心肌球蛋白；7 ) 异常 分泌蛋白，如p s a 等肿瘤相关蛋白；8 ) 外来蛋白，如病毒蛋白等1 1 9 1 。在人体组织和 器官的疾病发生发展以及治疗过程中，来自病变组织或细胞的蛋白可进入到血液系 统，从而影响血清蛋白质的组成，表现为蛋白质在种类及丰度水平上的变化。正因为 血清中蕴藏着与疾病发生机制、早期诊断及愈后评估密切相关的巨大信息，使得血浆 艚成为临床蛋白质组学中最为常见且最为重要的研究对象。 鉴于研究血清蛋白质的重要意义，国际人类蛋白质组组织( h u p o ) 于2 0 0 2 年 首先选择了血浆蛋白质组作为人类蛋白质组首期执行计划之一。至2 0 0 5 年h u p o 一 共鉴定了3 0 2 0 个高可信度蛋白【加】，并建立了血浆蛋白质数据库。同时世界上许多研 究小组【2 l - 2 4 1 也在进行血清蛋白质组的研究，并且获得了大量的数据，可是在海量数据 中具有应用价值的结果却很少，主要是因为其鉴定结果的假阳性率较高。 综上，本课题的主要工作就是建立复杂生物体系中蛋白质的分离分析方法，进行 血清蛋白样品的分离。通过提高血清蛋白样品分离效率，为以后蛋白质鉴定结果的高 可信度打下牢固基础；并且通过应用建立的色谱方法分离不同来源血清，比较血清蛋 白谱间的差异，努力使这一色谱分离方法成为一种有效的诊断工具，用于疾病差异蛋 白质组学研究，为将来疾病生物标志物的寻找奠定基础。 6 中国医学科学院中国协和医科大学硕i ：学位论文 参考文献： 1 c h u r c h w e l l ，m i ；t w a d d l e ，n c ；m e e k e r , l ；d o e r g e ，d r ，i m p r o v i n gl c m s s e n s i t i v i t yt h r o u g hi n c r e a s e s i n c h r o m a t o g r a p h i cp e r f o r m a n c e ：c o m p a r i s o n so f u p l c e s m s ，m st oh p l c - e s ，m s m s jc h r o m a t o g rb a n a l y tt e c h n o lb i o m e dl i f e s c i2 0 0 5 ，8 2 5 ，( 2 ) ，1 3 4 - 4 3 2 n e o p t o l e m o s ，j p ；d u n n , j a ；s t o c k e n , d d ；a l m o n d ，j ；l i n k , k ；b e g e t , h ；b a s s i ， c ；f a l c o n i ，m ；p e d e r z o l i ，p ；d e r v e n i s ，c ；f e r n a n d e z - c r u z , l 9l a c a i n e ，f ；p a p ，a ； s p o o n e r , d ；k e r r , d j ；f r i e s s ，h ；b u c h l e r , m w ，a d j u v a n tc h e m o r a d i o t h e r a p ya n d c h e m o t h e r a p yi nr e s e c t a b l ep a n c r e a t i cc a n o e f ：ar a n d o m i s e dc o n t r o l l e dt r i a l l a n c e t 2 0 0 l ，3 5 8 ，( 9 2 9 3 ) ，1 5 7 6 8 5 3 g u o ，x ；c u i ，z ，c u r r e n td i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to fp a n c r e a t i cc a n c c l i nc h i n a p a n c r e a s2 0 0 5 ，3 1 ，( 1 ) ，1 3 - 2 2 4 王丽，杨功焕，李辉，陆星华1 9 9 1 - - 2 0 0 0 年中国胰腺癌病死率的变迁中华内科 杂志，2 0 0 5 ，4 4 ( 7 ) ：5 0 9 5 1 3 ， 5 c h a n g , c y ；h u a n g , s p ；c h i u , h m ；l e e ，yc ；c h e n , m f ；l i n , j t ，l o w e f f i c a c y o fs e n l ml e v e l so fc a1 9 - 9i n p r e d i c t i o n o fm a l i g n a n td i s e a s e si n a s y m p t o m a t i ep o p u l a t i o ni nt a i w a n h e p a t o g a s t r o e n t e r o l o g y2 0 0 6 ，5 3 ，( 6 7 ) ，1 - 4 6 w i l k i n s ，m i 乙；s a n c h e z , j c ；g o o l e y , a a ；a p p e l ，& d ；h m p h e f y s m i t h , i ； h o e h s t r a s s e r , d f ；w i l l i a m s ，k ，lp r o g r e s sw i t hp r o t e o m ep r o j e c t s ：w h ya l lp r o t e i n s e x p r e s s e db yag e n o m es h o u l db ei d e n t i f i e da n dh o wt od oi t b i o t e c h n o lg e n e te n g r e v1 9 9 6 ，1 3 ，1 9 - 5 0 7 y a t e s ，j ，p r o t e o m i c sw o r k s h o pa th p c e2 0 0 1 ，b o s t o n , m a2 0 0 1 8 m c d o n a l d , w h ；y a t e s ，j 1 乙，3 咄s h o t g u np r o t e o m i c sa n db i o m a r k e rd i s c o v e r y d i s m a r k e 塔2 0 0 2 ，1 8 ，( 2 ) ，9 9 1 0 5 9 w o l t e r s , d a ；w a s h b u r n , m p ；y a t e s ，j r ，3 r d ，a na u t o m a t e dm u l t i d i m e n s i o n a l p r o t e i ni d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g yf o rs h o t g u np r o t e o m i e s a n a lc h e m2 0 0 1 ，7 3 ，( 2 3 ) ， 5 6 8 3 9 0 1 0 l e u n g , k y ；w 越t ，；w e l s o n , s y ；y a h , j x ；a b r a h a m , d j ；b l a c k , c m ；p e a r s o n , 7 中圉医学科学院中囝协和医科犬学硕 学位论文 j d ；d u n n , m j ，ar e f e r e n c em a po fh u m a nl u n gm r c 5f i b r o b l a s tp r o t e i n s 吲l l g i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t - i s o e l e c t r i ef o c u s i n g - b a s e dt w o - d i m e n s i o n a le l e e t r o p h o r e s i s p r o t e o m i e s2 0 0 1 ，l ，( 6 ) ，7 8 7 - 9 4 11 w a i t ，i l ；g i a n a z z a , e ；e b e r i n i ，i ；s i r o n i ，l ；d u n n , m j ；g e r n e i n e r , m ；m i l l e r , i ， p r o t e i n so fr a ts t r a i n , u r i n e ，a n de e r e b r o s p i n a lf l u i d ：v i f u r t h e rp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o n s a n di n t e r s t r a i nc o m p a r i s o n e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 1 ，2 2 ，( 1 4 ) ，3 0 4 3 - 5 2 1 2 d a v i d s s o mp ；p a u l s o n , l ；h e s s e ，c ；b l c o n o w , k ；n i l s s o n , c lp r o t e o m es t u d i e so f h u m a ne e r e b r o s p i n a lf l u i da n db r a i nt i s s u e u s i n gap r e p a r a t i v et w o - d i m e n s i o n a l e l e e t r o p h o r e s i sa p p r o a c hp r i o rt 0m a s ss p e c t r o m e t r y p r o t e o m i e s2 0 0 1 ，l ，( 3 ) ，4 4 4 - 5 2 1 3 p i u b e l l i ，c ；g a l v a n i ，m ；h a m d a n ，m ；d o m e n i c i ，e ；r i g h e t t i ，pg ，p r o t e o m ea n a l y s i s o fr a t p o l y m o r p h o n u c l e a rl e u k o c y t e s ：at w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s m a s s s p e c t r o m e t r ya p p m a e ke l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 2 ，2 3 ，( 2 ) ，2 9 8 - 31 0 1 4 c h a m p i o n , i cm ；a m o l t , d ；h e n z e l , w j ；h e r m e s ，s ；w e i k e r t , s ；s m l t s ，j ； v a n d e r l a a n , m ；k r u m m e n , l ，at w o - d i m e n s i o n a lp r o t e i nm a po fc h i n e s eh a m s t e r o v a r yc e i l s e l e e t r o p h o r e s i s1 9 9 9 ，2 0 ，( 4 5 ) ，9 9 4 1 0 0 0 1 5 p o u t a n e n , m ；s a l u s j a r v i ，l ；r u o h o n e n , l ；p e n r i l a ，m ；k a l k k i n e n , n ，u s eo f m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e - o f - f l i g h ti n a s sm a p p i n ga n dn a n o s p m y l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y e l e c t r o s p m yi o n i z a t i o nt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r ys e q u e n c et a g a n a l y s i s f o r h i g hs e n s i t i v i t y i d e n t i f i c a t i o no f y e a s tp r o t e i n ss e p a r a t e db y t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s r a p i dc o m m u nm a s ss p e c t r o m2 0 0 1 ，1 5 ，( 18 ) ， 1 6 8 5 9 2 1 6 s h a w , a c ；g e v a e r t , k ；d e m o l ，h ；h o o r e l b e k e ，b ；v a n d e k e r c k h o v e ，j ；l a r s e n , m 凡；r o e p s t o r f f , p ；h o l m , a ；c h r i s t i a n s e n , g ；b i r k e l u n d , s ，c o m p a r a t i v ep r o t e o m e a n a l y s i so fc b l a m y d i at m c h o m a t i ss e o v a ad a n dl 2 p r o t e o m i c s2 0 0 2 ，2 ，( 2 ) ， 1 6 4 8 6 1 7 h a r t , x ；j i n , m ；b r e u k e r , i c ；m c l a f f e r t y , ew ，e x t e n d i n gt o p - d o w nm a s s s p e c t r o m e t r yt op r o t e i n sw i t hm a s s e sg r e a t e rt h a n2 0 0l d l o d a l t o n s s c i e n c e2 0 0 6 ，3 1 4 ， ( 5 7 9 6 ) ，1 0 9 1 2 3 中国瞬学科学院中国协和医科大学硕 ：学位论文 1 8 g u e r r e r a , i c ；k l e i n e r , o ，a p p l i c a t i o no fm a s ss p e c t r o m e t r yi np r o t e o m i c s b i o s e i r e p2 0 0 5 ，2 5 ，( 1 2 ) ，7 1 9 3 1 9 a n d e r s o n , n l ；a n d e r s o n , n c t ，t h eh u m a np l a s m ap r o t e o m e ：h i s t o r y , c h a r a c t e r , a n d d i a g n o s t i cp r o s p e c t s m o lc e l lp r o t e o m i c s2 0 0 2 ，1 ，( 1 1 ) ，8 4 5 - 6 7 2 0 o m e n n , gs ；s t a t e s ，d j ；a d a m s k i ，m ；b l a c k w e l l ，t w ：；m e n o n , i l ；h e r m j a k o b ，h ； a p w e i l e r , 1 l ；h a a b ，b b ；s i m p s o n ，j ；f a d e s ，j s ；k a p p ，e a ；m o r i t z ，rl ； c h a n , d w ；r a i ，a j ；a d m o n , a ；a e b e r s o l d , i l ；e n g ，j ；h a n c o c k , w s ；h e f i a , s a ；m e y e r ，h ；p a i k , yi 己；y o o ，j s ；p i n g ，p ；p o u n d s ，j ；a d k i n s ，j ；q i a i l ，x ；w a n g , i l ；w a s i n g e r , v ；w u , c y ；z h a n ，x ；z e n g ，1 l ；a r c h a k o v , a ；t s u g i t a , a ；b e e r , i ； p a n & y , a ；p i s a n o ，m ；a n d r e w s ，p ；t a m m e n , h ；s p e i c h e r , d w ：；h a n a s h , s m ， o v e r v i e wo f t h eh u p op l a s m ap r o t e o m ep r o j e c t ：r e s u l t sf r o mt h ep i l o tp h a s ew i t h3 5 c o l l a b o r a t i n gl a b o r a t o r i e sa n dm u l t i p l ea n a l y t i c a lg r o u p s ，g e n e r a t i n ga c o r ed a t a s e to f 3 0 2 0p r o t e i n sa n dap u b l i c l y - a v a i l a b l ed a t a b a s e p r o t e o m i c s2 0 0 5 ，5 ，( 1 3 ) ，3 2 2 6 - 4 5 2 1 r e n , y ；h e ，q y ；f a n , j ；j o n e s ，b ；z h o u , y ；x i e ，y ；c h e u n g ，c y ；w u , a ；c h i n , j f ；p e i r i s ，j s ；t a m p - ，t h eu s eo f p r o t e o m i c si nt h ed i s c o v e r yo f s e r u mb i o m a r k e r s f r o mp a t i e n t sw i t h $ f i v c r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e p r o t e o m i e s2 0 0 4 ，4 ，( 1 1 ) 3 4 7 7 8 4 2 2 a g r a n o f f , d ；f e r n a n d e z r e y e s ，d ；p a p a d o p o u l o s ，m c ；r o j a s ，s a ；h e r b s t e r , m ； l o o s e m o r e ，a ；t a r e l l i ，e ；s h e l d o n , j ；s c h w e n k , a 9p o l l o k , ；r a y n e r , c f ；k r i s h n a , s ，i d e n t i f i c a t i o no fd i a g n o s t i cm a r k e r sf o rt u b e r c u l o s i sb yp r o t e o m i cf m g e r p r i n t i n go f 靶盯珊l a n c e t2 0 0 6 ，3 6 8 ，( 9 5 4 0 ) ，1 0 1 2 2 1 2 3 s u n d s t e n , t ；e b e r h a r d s o n , m ；g o r a n s s o n , m ；b e r g s t e n , p ，t h e u s co fp r o t e o m i e si n i d e n t i f y i n gd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e ds e n l mp r o t e i r ai nh u m a