（分析化学专业论文）黄芩中黄芩苷的提取分离及测定方法的研究.pdf

硕十研究生毕业论文摘要 摘要 本文在大量文献调研的基础上，研究了黄芩中黄芩苷的提取、分离纯化及 分析测定方法。具体内容摘要如下： 黄芩苷的提取。系统地研究了煎煮提取、水浴回流提取、超声提取和微波 提取法从黄芩中提取黄芩苷的最佳工艺，通过比较四种提取方法所得黄芩苷的 得率，确定微波提取为最佳方法，正交优化试验得到微波提取工艺的最优提取 条件为：取5 9 黄芩加入1 0 0 m l 体积分数6 0 的乙醇溶液中浸泡2 h ，微波提取 8 0 s ，黄芩中黄芩苷的得率为5 7 1 。 黄芩苷的分离纯化。首先选择酸沉法分离得黄芩苷粗品，然后分别用重结 晶和双水相萃取法对黄芩苷进行纯化，得到了最优条件为：聚乙二醇( p e g ) 6 0 0 0 质量分数为2 6 ，k 2 r n 0 4 的质量分数1 8 ，p h 值为7 ，温度为3 0 c 。总 收率达到了9 8 6 。 黄芩苷的分析测定。采用红外光谱法对黄芩苷样品进行定性分析。采用紫 外分光光度法在最大吸收波长2 7 8 n m 下，对黄芩苷进行定量分析，确定最佳测 定条件。浓度在8 0 x 1 0 - 3 m g m l 6 0 x 1 0 2 m g m l 范围内有良好的线性关系。另 外建立了高效液相色谱法( 吼c ) 测定黄芩苷的浓度，色谱条件为流动相： 甲醇：水：磷酸( 4 7 ：5 3 ：0 2 ) ；检测波长2 7 8 n m ；流速1 5 m l _ j m i n ；柱温，2 5 。 进样量l o 邺：1 l ，黄芩苷的进样浓度在8 0 1 a g m l 5 2 t a g m l 范围内呈良好的线性 关系。 通过比较紫外分光光度法和高效液相色谱法测定结果，发现用紫外分光光 度法测定黄芩中所提取黄芩苷的得率，简单方便，准确度和精密度均令人满意。 关键词：黄芩苷，微波提取，双水相萃取，紫外分光光度法，高效液相色谱 法 硕士学位论文 a b s t r a c t a b s l r a c t o nt h e b a s i so ft h el i t e r a t u r e s ，t h ee x t r a c t i o n , s e p a r a t i o n , p u r i f i c a t i o na n d d e t e r m i n a t i o nm e t h o d so f b a i c a l i nf r o ms c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i sw e r es t u d i e d s p e c i f i c s u m m a r y a sf o l l o w s ： e x t r a c t i o no fb a i c a l i n 1 1 l em e t h o d so fd e c o c t i o ne x t r a c t i o n , r e f l u xe x t r a c t i o n , u l t r a s o n i cw a v ee x t r a c t i o na n dm i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o no fb a i c a l i nf r o m s c u t e l l a r i ab a i c a l e m i sw e r es t u d i e ds y s t e m i c a l l v m i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o nw a s c h o s e nf o ri t sl l i g he x t r a c t i o ny i e l do fb a i c a l i n a n dt h eo p t i m a lp a r a m e t e r sw e r e t a k i n g5 9s c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i st ot h e1 0 0 m ls o l v e n t ( e t h a n o l ：w a t e r = 6 0 ：4 0 ，v v ) s o a kf o r2h o u r s n l ee x w a c t i o nt i m ew a s8 0 s u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h ey i e l do f b a i c a l i nw a s5 7 1 s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fb a i c a l i n f i r s t , c r u d eb a i c a l i nw a so b t a i n e db y a d d i n gh y d r o c h l o r i ca c i d t oe x w a c t i o ns o l u t i o n 1 1 1 e b a i c a l i nw a sp u r i f i e db y c r y s t a l l i z a t i o n ；1 h ea q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o nw a se s t a b l i s h e dt op u r i f y 田他 o p t i n l a lc o n d i t i o n sw e r ef o l l o w i n g ：g a t h e rg l y c o l ( p e g ) 6 0 0 0f o r2 6 ( 、枞) ， k 2 h p 0 4 ，1 8 ；p h = 7 ，t h e t e m p e r a t u r e , 3 0 t h e n t o t a l r e c o v e r y w a s 9 8 6 d e t e r m i n a t i o no fb a i c a l i l lm e t h o do fi n f r a r e ds p e c t r u mw a se s t a b l i s h e dt o i d e n t i f yb a i c a l i n a tt h e a b s o r p t i o nw a v e l e n g t ho f2 7 8 n m , u l t r a v i o l e ts p e c t r aw a su s e df o r d e t e r m i n i n g b a i c a l i n s a m p l e s 1 h e d e t e r m i n a t i o no fb a i c a l i nw a sl i n e a ri n 8 0 xl o j m 咖i l l 6 0 xl o z m g m l h p l c ( h i g hp c r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) w a su s e dt od e t e r m i n e b a i c a l i n 1 1 1 e a n a l y s i s e o n d i t i o m w e r e f o l l o w i n g ：c o l u m n , v p - o d s c t s ( 1 5 0 m i n x 4 6 m m ) ；m o b i l ep h a s e , m e t h a n o l - w a t e r - p h o s p h o r i ca c i d = 4 7 ：5 3 ：0 2 ( v v v ) ； d e t e c t i o nw a v e l e n g t h , 2 7 8n m ；f l o wr a t e ，1 5m l m i n ；c o l u m nt e m p e r a t u r e ，2 5 c 1 1 1 ed e t e r m i n a t i o no f b a i c a l i nw a sl i n e a ri n8 o r t g m l - - 5 2 吲m l c o n c l u s i o nw a sd r a w na f t e rc o m p a r i n gt h et w od e t e r m i n i n gm e t h o d s ：n 硷 p r e c i s i o na n da c c u r a c yo f u vw a ss a t i s f a c t i e d k e yw o r d s ：b a i c a l i n , m i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o n ，a q u e o u st w o - p h a e x t r a c t i o n , u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e g y , h p l c 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名： 导师签名：日期：年一月一日 硕士学位论文第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 天然药物来自植物、动物和矿物，以天然植物为主，其中本草纲目就记载了1 8 0 0 多种，本草纲目拾遗又补充了1 0 0 0 多种【i 】。 黄芩又名空心草、黄金茶，多年生草本植物，主根长大略呈圆锥状，外皮褐色在各 种黄芩成份的研究中，经过众多科学工作者十几年的辛苦努力，已分离得到多种黄酮类，甾 醇类，糖类化合物和氨基酸等成分，其中黄酮类化合物被确认为是主要的药用有效成分。 黄芩为唇形科黄芩属植物s c u t e l l m i ab a i c a l e n s i sg e o r g i 的干燥根，是我国常用的大宗药 材之一( 见图1 1 ，图i - 2 ) 。始载于神农本草经，列为中品，其性寒味苦，具有清热燥湿， 泻火解毒，止血安胎等作用，为清凉解热药。 图1 - 1 黄芩植物图1 2 黄芩的根( 药用黄芩) 我国黄芩( s c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i sg e o g r i ) 属植物大约有1 0 0 余种，多为野生，南北均产， 根为黄色可入药的大约有1 0 种左右。药典收载的黄芩为黄芩的根，如图1 1 所示。另外粘毛 黄芩( s h s c i d u l a b g e ) ，丽江黄芩( s l i k i a n g e n s i s d i e l s ) ，滇黄芩( s a m o e n a c h w r i g h t ) ，甘肃 黄芩( s r e h d e r i a n a d i e l s ) ，川黄芩( s h y t x , r i c i f o l i a l e v l ) 等品种的根均入药，且疗效不凡。 黄芩广布于我国东北、华北北部和内蒙高原草原东部，具体分类、分布如表1 1 【3 l 。 硕士学位论文第一章绪论 黄芩b a i c a l e n s i s 滇黄芩s a m o e n a 粘毛黄芩s v i s c i d u l a 甘肃黄芩s r e h d e r i c m a 丽江黄芩s 1 i k i a n g e n , 凼 川黄芩最h y p e r i c i f o l i a 木根黄芩洳e w 韧黄芩s t e n a x 薄叶黄芩s i k o r m i k o v i i 萦背黄芩s d i s c o l o r 阿尔卑斯黄芩s 撕 半枝莲s r i w l a 帕 韩信草$ i n d i c a 空心草、黄金茶、香水水草 西南黄芩 黄花黄芩、下巴子、腺毛黄芩 小黄芩 连翘叶黄芩 北京，甘肃，陕吨，内蒙 ，云南，四川 内蒙，山西，河北，山东 甘肃 云南 四川 辽宁 云南，四川 宁夏、内蒙古东部 尼泊尔中部 意大利 台湾 台湾 1 2 黄芩的生物学性状 1 2 1 土壤适应性 黄芩植物喜温暖，耐高温，耐寒，成株地下根部能耐3 0 低温，植株能耐3 5 1 2 左右的 高温【4 】。在高燥、向阳、雨量中等、排水良好，中性和微碱性的壤土或砂质壤土地块内生长 良好。黄芩性耐旱，怕水涝。在低洼积水或雨水过多的地方，生长不良，易造成烂根死亡。 适宜种植在中性或偏碱j 眭、土层较厚、土质肥沃疏松、e t 照充足的沙质土壤中。人工栽培黄 芩时，单一施用和复合施用氮、磷、钾化肥对提高其根部黄芩苷的含量有显著影响。 1 2 2 生殖特性 黄芩传统的繁殖方式是用种子繁殖，因种子细小，覆土浅，极易因失水导致出苗率不高， 特别是在干早地区或干旱季节播种，常因土壤干旱，出苗困难，而使产量和质量均有所下降。 2 l 2 3 4 5 6 8 9 m n ! b 硕士学位论文 第一章绪论 除了深翻细整和适时播种外，还采取了坐水播种、浸种催芽、覆盖保嫡、育苗移栽等措施， 取得了较好的效果。 1 - 3 黄芩中的化学成分 1 3 1 黄酮和黄酮醇类 黄酮类化合物是指两个芳环通过三碳链相互联结而成的一系列化合物。黄芩中的化学成 分主要为黄酮类成分，从黄芩中获得黄酮和黄酮醇类化合物四十多种，黄酮类成分是其发挥 药理活性的基础，其中黄芩：f f ( b a i c a l i n ) ，黄芩素( b a i c a k i n ) ，汉黄芩苷( w o g o n i n s 汝) 和汉黄 芩素( w o 窖0 n - m ) 是最主要的活性成分伊h 。黄芩苷作为黄芩药材的主要有效成分，在黄芩植株 根、花、叶、茎等器官中均有分布，但在各器官中的含量之间具有显著性差异阍，以根中的 含量最高，其次是花、叶、茎。对于年生植株来讲，根部含量是花的2 7 2 3 倍，是叶的4 7 5 2 倍，是茎的1 2 7 5 4 倍。因此，黄芩苷主要分布在根中，本试验所用原料为黄芩的根部。 0 h o ho 图1 - 3 黄芩昔的化学结构 1 3 2 二氢黄酮和二氢黄酮醇类 黄芩中二氢黄酮和二氢黄酮醇也占有相当一部分，已经发现的有1 7 种，其中主要有二氢 黄芩苷( d i h y d r o l y a i c a l i n ) 刚0 1 ，7 ，2 ，6 三羟基5 甲氧二氢黄耐】 ( 7 2 6 - t r t h y d r o x y - 5 - m e t h o x y f l a v 锄o n e ) ，红花素( c a 础锄i d j n ) f 1 2 1 ，异红花素( i s o n i i a 皿i d i n ) 【1 2 l 等。 硕士学位论文第一章绪论 1 3 3 黄烷酮类成分 4 ，5 ，7 三羟基岳甲氧基黄烷酮( 4 ，5 ，7 - t r i h y d r o x y - 6 - m e t h o x y t l a v a n o n e ) 1 1 3 1 4 1 ，7 ；2 ，6 _ 三羟 基5 甲氧基黄烷酮( 7 2 ，6 t r i h y d r o x y - 5 - m e t h o x y f l a v a n o n e ) 【3 团，2 ，6 357 一五羟基黄烷酮 ( 2 ，6 3 ，5 ，7 - p e n t a h y d r o x y d r o x y f l a v a n o n e ) 【旧，2 ，6 ，5 , 7 四羟基黄烷酮 ( 2 ，6 ，5 ，7 - t e t r a h y d r o x y f l a v a a o n e l l 6 1 ) 。 1 3 4 查尔酮成分 2 , 6 2 ，4 四羟基- 6 一甲氧基查尔酮( 2 触，4 - t e t r a h y - d r o x y - 6 - m e l h o x y c h a l c o n e ) ( i ) 和滇黄芩 苷甲( a m o e n i n a x i l l 1 3 5 苯乙醇苷 最早从黄芩根中分离得到苯乙醇苷为2 彤羟基4 甲氧基苯基) - 基1 o m l 一鼠李糖 i 曼泡时间 微波时间 料液比，其中提取溶剂浓度对黄芩苷提取量的影响 最大，具有显著性的差异。 2 6 小结 由此可见，微波提取有以下优点：投资少，设备简单、重现性好、操作时问短、热效率 高、不产生噪音、不产生污染和易于自动化。尤其是与传统煎煮法相比，克服了药材细粉易 凝聚、易焦化的弊端，有望进行规模化生产。 硕士学位论文第三章黄芩苷的分离及纯化工艺研究 第三章黄芩苷的分离及纯化工艺研究 由于提取过程中的多种作用，黄芩提取液形成了一个既含有许多极细微粒和大分子物质， 如粘液质、蛋白质、鞣质、树胶等，又混有药样微粒、粗纤维等固体杂质的混悬体系，具有 热力学不稳定性和动力学不稳定性，严重影响后续处理，必须经过分离纯化以提高活性成分 的含量。目前，中药活性成分纯化处理技术很多。本试验采用酸沉重结晶法、双水相萃取的 纯化工艺，并对相关工艺参数进行了优化，取得了满意的效果。 黄芩苷的纯度的计算 黄芩苷的纯度= 瓦襄譬鬻藉譬霉誓雾誓t o o 。d ， 3 1 沉淀分离法 3 1 1 仪器与试剂 w 2 0 1 b 恒温水浴锅，上海申生科技有限公司；s m i 循环水式多用真空泵，郑州长城 仪器厂；p h s - 3 c 精密p h 剂，上海精密仪器有限公司；a y l 2 0 电子天平，日本岛津有限公司； d z f6 0 5 0 型真空干燥箱，上海恒科技有限公司；可调节电炉，湖南林松电子。 黄芩药样( 产地湖南) ，购于长沙金沙大药房；无水乙醇，9 5 乙醇分析纯，天津市大茂 化学试剂厂；盐酸分析纯，抹洲开发区石英化玻有限责任公司；n a o h 分析纯，焦作鑫安科 技股份有限公司试剂厂。 3 1 2 实验原理 沉淀分离法是在样品溶液中加入某些溶剂，通过化学反应或者改变溶液的p h 值、温度 等，使分离物质以固相物质形式沉淀析出的一种方法。本试验利用黄芩苷在中性溶液中溶解， 在酸性溶液中沉淀析出，从而与其它杂质分离。 3 1 3 实验部分 称量5 9 黄芩样品微波提取，抽滤后提取液加h c i 溶液调至p h - - 2 ，8 0 c 水浴保温0 5 h 后静置1 2 h ，离心沉淀。沉淀加适量水混悬，用质量浓度为4 0 n a o h 调p h = 7 ，搅拌全溶 硕士学位论文第三章黄苓苷的分离及纯化1 ：艺研究 后加等量9 5 乙醇充分搅拌后抽滤，滤液加h c l 溶液调p h = 1 5 ，水浴5 0 。c 保温0 5 h ，冷却 后抽滤得沉淀在8 0 下干燥6 h 后得到黄芩苷粗品。其具体流程如图3 - 1 所示： 沉 加适量的水搅匀，加4 0 n a o h 调至p h 7 ，再加适量乙醇，过滤 滤渣滤液 l 銎嚣慧：警 厂 黄芩苷粗品 滤液 图卜1 黄芩提取液中分离黄芩苷的工艺流程 滤过叹提 粉j 筝黄 硕士学位论文 第三章黄芩苷的分离及纯化工艺研究 用1 0 0 倍量的9 5 乙醇回流3 0 m i n ，趁热过滤得到的醇液回收乙醇到原体积的l 5 后放 置结晶，母液再次浓缩放置结晶，重复3 次后，所得晶体即为纯化后的黄芩苷。然后配成一 定浓度的溶液，用紫外分光光度法测定黄芩苷的质量( 见4 2 节) ，计算黄芩苷样品的纯度( 其 计算见公式3 1 ) 。 3 1 4 结果与讨论 采用酸沉重结晶法做3 个平行样，结果如表3 1 。 表3 - 1 酸沉结晶分离纯化的平行实验数据 3 2 双水相萃取法 3 2 1 仪器与试剂 磷酸氢二钾分析纯，焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂；聚乙二醇( p e g ) 1 5 0 0 ，p e g 2 0 0 0 ，p 王好3 0 0 0 ，p e g 6 0 0 0 焦作鑫安科技股份有限公司试剂厂；其它仪器同3 1 1 。 3 2 2 实验原理 当两种聚合物或一种聚合物与种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之 间的分子空间阻碍作用，无法相互渗透，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不 互溶的两相，因为使用的溶剂是水，所以称为双水相。当物质进入双水相体系后，由于表面 性质、电荷作用和各种力( 如憎水键、氢键和离子键等) 的作用和溶液环境的影响，使其在上、 下相中的浓度不同，即各成分在两相问的选择性分配，从而达到萃取的目的。当被分离的物 质与双水相体系充分混合后，经静置分层，被分离的成分就富集在双水相体系中的上相或下 相，将此富集了被分离成分的相分离出来，再经过处理后就可得到被分离成分。当相系统固 定时，分配系数k 为常数，与被分离物质的浓度无关。不同的物质在特定的体系中有不同的 分配系数。 有关计算公式有： r f k 5 c 。c d 3 l ( 3 2 ) ( 3 - 3 ) 硕士学位论文 第二章黄芩营的分离及纯化_ t 艺研究 y = 1 ( 1 + l ( r k ) )( 3 - 4 ) 公式中： r - 双水相体系上下相的体积比 k - 黄芩苷双水相体系的分配系数 y 二黄芩苷在上相中的收率 v 广上水相体系上相的体积( i i l l ) v d - 下水相体系下相的体积( f i l l ) c i 广上水相体系上相中黄芩苷的质量浓度( m g m l ) c a - 下水相体系下相中黄芩苷的质量浓度( 1 n i 咖：l l ) 3 2 3 影响因素 影响被分离物质在双水相体系中分配的因素有很多，主要有以下几个方面。 双水相体系的组成成分( 即聚合物的种类) 。同一种物质在不同的双水相体系中的分 配比相差很大。 聚合物的相对分子量大小。同一聚合物的疏水性随相对分子量的加大而增加，分配系 数也随之发生变化。 系线的长度。系线长度趋于零时，上相和下相组成相同，分配系数为1 0 。系线长度 增加，上相和下相相对组成差别增大，被分离物质在两相中的表面张力差也增大，从而影响 分配系数。 p h 值的影响。p h 值的变化会导致组成体系的物质电性发生变化，也会使被分离物质 的电荷发生改变，从而影响分配的进行。 温度也将影响被分离物质在双水相体系中的量。 3 2 a 实验部分 双水相体系按质量配制，各组分用质量分数表示，系统总量为l o g ，混合均匀后，在离 心机中以2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，读取上下相体积v u 和v d ，由公式( 3 - 2 ) 计算得双水相系统 的相比r 分别取样分析上下相中黄芩苷的浓度。由公式( 3 3 ) 计算的双水相系统的分配系 数k ；然后再利用公式( 3 - 4 ) 的黄芩苷的收率y 。 分别改变聚乙二醇( p e g ) 6 0 0 0 ，k 棚 0 4 质量分数，体系p h 值及体系温度确定最优分 离条件。 在最佳条件下，取富含黄芩苷一相，回收纯化得黄芩苷。 硕士学位论文第三章黄芩茴的分离及纯化工艺研究 3 2 5 结果与讨论 3 2 5 1p e g 平均分子量对双水相体系分配平衡的影晌 对黄芩苷在p e g k 2 i - i p o 蹦体系中的分配情况进行研究，实验在p e g 的质量分数均 为1 6 ，k 2 h p 0 4 质量分数为1 8 0 , 6 ，p 冲- 7 条件下，考察p e g 的分子量变化对黄芩苷在双水相 中分配平衡的影响。结果如图3 - 2 ，图3 - 3 ，图3 - 4 所示。 n 7 0 6 0 5 莲 0 4 o 3 2 4 2 3 y 饕2 2 鼬 求 2 1 2 0 1 0 0 02 0 3 0 0 04 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 p e g 的分子量 1 驾3 - 2p e g 的分子量对相比r 的影响 1 0 0 02 0 3 0 4 0 0 05 0 6 0 p e g 的分子量 图3 - 3p e g 的分子量对分配系数k 的影响 硕士学位论文第三章黄芩苷的分离及纯化工艺研究 9 4 薹9 2 菩 g9 0 抽 斡 瓤8 8 髓 1 0 0 0 2 0 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 0 0 0 p e g 的分子量 图3 - 4p e g 的分子量对黄芩苷收率y 的影响 由图3 - 2 ，图3 3 ，图3 _ 4 可见，p e g 的平均分子量愈大，黄芩营愈趋向于上相分配。可 能是因为随着p e g 平均分子量的增加，聚合物分子中亲水基的数目减少，疏水基的数目增大。 两相中亲水性差距增大，黄芩苷在上相中的分配率增大。因此确定p e c 6 0 0 0 为研究对象。 3 2 5 2p e g 6 0 0 0 与k 2 h p 0 4 质量分数对双水相体系分配平衡的影响 选取p e g 6 0 0 0 的质量分数为1 6 ，p h - - 7 0 条件下，考察k 士i p 0 4 质量分数的变化对黄 芩苷在双水相中分配系数的影响。结果如图3 - 5 ，图3 - 6 ，图3 - 7 所示： n o 7 5 o 7 0 o 6 5 叱 嚣哪 0 5 5 o 5 0 0 4 5 0 ，4 0 1 0 1 21 41 61 82 02 2 “拍2 83 0 3 2 k h p o 肛 图3 - 5k 2 h p 0 4 的百分含量时相比的影响 硕士学位论文第三章黄芩苷的分离及纯化t 艺研究 2 6 2 4 2 2 2 0 善1 8 1 蛭1 6 艋 求1 4 1 2 1 0 8 摹 n - 善 譬 扛 输 饭 1 01 2 1 61 8 2 0 2 22 4 2 8 3 2 k h p q 瞄 图3 - 6k 2 h p 0 4 的百分含量对分配系数k 的影响 1 01 2 1 4 1 61 82 02 22 4 俎3 03 2 k h p o 脯 图3 - 7k 2 h i 0 4 的百分含量对黄苓苷收率y 的影响 由图3 5 ，图3 - 6 ，图3 - 7 可以看出，k 2 h p 0 4 的浓度低时，收率y 比较高是由于相比r 较大，k 2 h p 0 4 的浓度高时，分配系数k 减小。因此，在k 2 h p 0 4 的质量分数为1 8 时，k 值最大，萃取率最高。确立k 2 h p 0 4 的质量分数为1 8 为最优条件，在p h = 7 0 的条件下考 察p e g 6 0 0 0 质量分数的变化对黄芩苷在双水相中分配平衡的影响，结果如图3 8 ，图3 - 9 ， 图3 1 0 所示： 舛 g ! 船 盼 舱 鲫 硕士学位论文 第三章黄苓苷的分离及纯化工艺研究 3 5 3 o 2 ，5 e2 0 薰” 1 o 0 5 3 0 2 8 2 6 y 籁“ 谣 疆2 2 求 2 0 1 8 1 6 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 02 2 “2 83 0 3 2 p e c - 6 0 0 0 图3 - 8p e g 6 0 0 0 的百分含量对相比r 的影响 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 22 4 拍2 8 3 2 图3 - 9p e g 6 0 0 0 的百分含量对分配系数k 的影响 硕士学位论文第三章黄苓苷的分离及纯化。【艺研究 1 萎 舟 善 蛊 霖鸵 誓 9 0 1 0 1 2 1 4 1 6 1 82 0 兹2 4 2 83 0 3 2 p e g 6 0 0 0 图3 - 1 0p e g 6 0 0 0 的百分含量时黄芩苷收率y 的影响 由图3 8 ，图3 - 9 ，图3 1 0 可以看出随着p e g 6 0 0 0 质量分数的增大，k 在p e g 6 0 0 0 的 质量分数2 6 时有最大值，黄芩营的萃取率也最高。从分配理论上解释，随着p e g 质量分 数的增大，黏度增大，阻止相分子转移的能力增大，使得黄芩苷大部分分布在p e g 相。 3 2 5 3 p t - i 值对双水相体系分配平衡的影响 在p e g 6 0 0 0 质量分数为2 6 ，k 2 h p 0 4 的质量分数1 8 时，调不同p h 值，考察体系分 配平衡的变化，结果如图3 1 l ，图3 1 2 ，图3 1 3 所示： 图3 - 1 1p h 对相比r 的影响 硕+ 学位论文第三章黄芩苷的分离及纯化工艺研究 3 5 3 0 2 5 z 蒸2 0 墨1 5 1 0 5 0 * 掣 雹 = | 扛 持 粒 6 图3 - 1 2p h 对分配系数k 的影响 8 图3 - 1 3p h 对黄芩苷得率y 的影响 由图3 - l l ，图3 - 1 2 ，图3 - 1 3 可知p r i 值过高对黄芩苷在双水相中分配不利。p h - 7 或偏 酸性有利于黄芩营在双水相中的分配，黄芩苷在碱性环境下容易变质。 3 2 5 4 温度对双水相体系分配平衡的影响 在p e g 6 0 0 0 质量分数为2 6 ，k 2 h p 0 4 的质量分数1 8 ，p h = 7 时，考察温度对双水相 体系分配平衡的影响，结果如图3 1 4 ，图3 1 5 ，图3 1 6 所示： 3 8 硕士学位论文 第三章黄苓苷的分离及纯化t 艺研究 2 4 2 3 世2 2 藿 2 1 2 0 19 y 籁 惴 艋 求 3 54 04 5弱6 0 温度t ， 图3 - 1 4 温度t 对相比r 的影响 3 03 54 04 55 05 5 6 0 温度t ，c 图3 1 5 温度t 对分配系数k 的影响 s宅宕舱m趁侣侣住 硕士学位论文第三章黄芩苷的分离及纯化工艺研究 9 9 0 9 8 5 妻 诗9 8 0 萼【 窨9 7 5 j 缸 挣9 7 0 辍 9 6 5 0 3 03 54 04 55 05 56 0 温度t ， 图3 1 6 温度t 对黄芩苷收率y 的影响 由图3 1 4 ，图3 1 5 ，图3 1 6 可知温度对r 和y 影响不很大，但对分配系数k 影响较大， 在3 0 c l 槲j 于黄芩苷在双水相中的分配。但在实验中发现保温时间不宜过长，否则引起溶 质的扩散作用k 下降，而且温度太高可能会破坏黄芩苷有效成分。 以上实验表明利用p e c v 6 0 ( x ) k 吐q p 0 4 双水相体系萃取黄芩苷时，p e g 6 0 0 0 浓度、k 2 h p 0 4 浓度、d h 值及温度等因素都对双水相体系的相比、分配系数及黄芩苷的收率有一定影响，试 验得出最佳的分离条件为p e g 6 0 0 0 质量分数为2 6 ，k 2 h p 0 4 的质量分数1 8 ，p h 值为7 0 ， 温度为3 0 0 c 。最大的分配系数可达2 9 8 ，最大收率9 8 6 。黄芩苷大部分被分配在p e g 相( 上 相冲。 在此条件下做三份平行样，步骤同3 1 4 ，结果见表3 - 6 。 表3 - 6 双柑嘿优务件下的平行实验 3 3 小结 本试验采用沉淀法分离黄芩苷，然后用结晶法和双水相萃取法分离纯化黄芩苷样品。通 过选择不同的工艺参数和分离纯化条件，最终得到纯度较高的黄芩苷产品。比较两种纯化方 法快捷、简单、便宜，且效率较高，是一种较好的分离提纯方法。我们要深入研究使其在其 它天然产物有效成分分离中得到广泛应用。 4 0 硕十学位论文第四章黄芩苷的分析测定研究 第四章黄芩苷的分析测定研究 4 1 黄芩苷的定性分析 4 1 ；1 仪器与试剂 黄芩苷标准品，云南玉溪万方天然药物有限公司；黄芩苷样品，实验所得； n i c o l e tn e x u s 6 7 0 红外光谱仪 4 1 2 实验部分 分别测黄芩苷标准品与样品的红外光谱图，如图4 1 与图4 2 所示。 图4 - 1 黄芩苷标准品的缸外谱图 4 l 硕士学位论文 第四章黄芩茁的分析测定研究 图4 - 2 黄芩苷样品的红外港图 分析图4 1 和图牝所示谱图：1 4 9 5 7 1 和1 4 7 2 微数位置的吸收，9 0 0 - - 6 5 0 波数位置的 精细结构可以判断化合物有苯环；2 8 5 8 5 7 波数处吸收应该是c h 键的伸缩振动造成的； 3 3 8 8 8 8 的宽峰应该是o h 伸缩振动引起的；1 6 1 1 0 3 和1 5 7 2 4 8 波数附近的强吸收；1 3 0 0 一 1 4 2 0 蝴( 附近的中等强度吸收峰是羧酸的c o 单键的特征吸收；羧基基团中的的c = o 振 动频率在1 7 2 6 5 6 附近；波数1 0 3 6 3 2 位置及它前面的强峰是c o c 的对称和不对称伸缩 振动。 对比图4 1 和图4 - 2 ，黄芩苷的所含基团的吸收峰都有且峰形基本相同。另外4 2 3 1 所 测黄芩苷样品与标准品的紫外吸收扫描波形相同，最大吸收峰波长一致，可以推定样品主 要成分为黄芩苷。 4 2 紫外分光光度法测定黄芩苷的含量 4 2 1 仪器与试剂 7 5 6 m c 紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司； 黄芩苷标准品，云南玉溪万方天然药物有限公司；无水乙醇，分析纯；9 5 y - - , 醇分析纯， 天津市大茂化学试剂厂；甲醇分析纯，天津市大茂化学试剂厂；。 4 2 2 实验部分 4 2 2 1 黄芩苷标准溶液的制备 硕十学位论文第四章黄芩苷的分析测定研究 准确称取o 0 5 0 0 9 黄芩苷标准品，用7 5 乙醇定容于2 5 0 m l 容量瓶中，制成o 2 m 鲈i l l 的黄芩苷标准储备液，待用。 4 2 2 2 黄芩苷样品溶液的制备 准确称取o 0 5 0 0 9 黄芩苷待测品，方法同4 2 2 1 。 4 2 3 结果与讨论 4 2 3 1 最大吸收波长的确定 取黄芩苷标准储备液用7 5 乙醇稀释l o 倍后在7 5 6 m c 紫外可见分光光度计上进行扫描 得图4 - 3 。 认 、 。、 图4 - 3 黄芩苷标准品扫描图 由图4 - 3 可知最大吸收波长为2 7 8 n m 。 将分离纯化后的黄芩苷待测样品溶液用7 5 乙醇稀释l o 倍后用紫外分光光度法进行扫 描得图“。 叭 图4 4 黄芩苷待测样品扫描图 硕士学位论文第四章黄苓营的分析测定研究 对比图4 - 3 和图4 - 4 可知本实验分离纯化后所得的黄芩苷样品和黄芩苷标准品在紫外分 光光度上扫描所得图谱基本一致，最大吸收峰位置相同，在2 7 8 m n 处有一个强吸收，可用紫 外分光光度法在2 7 8 n m 处测定黄芩苷的浓度。 4 2 3 2 标准曲线 分别移取1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0 m l 黄芩苷标准储备液，用7 5 乙醇稀释2 5 倍后于2 7 8 n m 测定吸光度，以黄芩苷浓度作为横坐标，其对应的吸光度a 作为纵坐标，建立标准曲线如图 钙所示。 1 4 1 2 1 ，o 釉 0 6 o 4 681 01 21 41 61 82 02 22 4 拍 c m g m r l x l 0 4 图4 巧紫外分光光度标准曲线图 用最小二乘法进行回归，得吸光度a 与黄芩苷标准溶液浓度cq t l g m l ) 的线性回归方 程a = 0 0 1 0 6 + 0 0 5 6 4 5 c ，r - - 0 9 9 9 8 ，黄芩苷在浓度8 0 x 1 0 3 m g m l 6 x l o 2 m g m l 1 范围内有 良好的线性关系。 4 2 3 3 精密度实验 准确量取同一样品溶液5 份，g - f 91 o o m l ，在2 7 8 n m 下测定，相对标准偏差( r s d ) 为0 8 7 。 4 2 3 a 样品测定及其加标回收率实验 量取1 o m l 已经测定含量的样品溶液3 份，加入一定量的对照品溶液，在2 7 8n m 下测 定吸光度，平行测定三次，计算加标回收率，结果见表4 - 2 ，回收率在9 8 3 1 0 1 8 之间， 由此可知，此方法的回收率能满足分析的要求。 硕士学位论文第四章黄苓苜的分析测定研究 表4 2 加标回收率实验 4 3 高效液相色谱法测定黄芩苷的含量 4 3 1 测定原理 当混合物中各组分在经过个有固定祥和流动相组成的体系时，由于各组分在化学性质 上的差异，在两相中具有不同的分配系数，两相作相对运动时，被分析的混合组分随流动相 一起运动，并在两相中进行多次吸附和分配，使得那些分配系数只有很小差别的组分，在移 动速度上产生很大差别，从而使各组分得到分离。通过检测器扫描色谱峰，由于色谱峰面积 与进样量成正比，故可做定量分析。 4 3 2 仪器与试剂 高效液相色谱仪( s m a d z ，2 0 1 0 a ) ，检测器( s p m m l o a v p ) ，色谱柱( 比i d sc l g 1 5 0 m m x 4 6 m m ，预柱1 0 m m 4 6 m m ) ，日本岛津公司。 黄芩菅标准品( c o _ 9 7 2 1 ) ，云南玉溪万方天然药物有限公司；无水乙醇，9 5 乙醇分 析纯，天津市大茂化学试剂厂；黄芩苷标准溶液，自己配制；样品溶液，自己配制；甲醇色 谱纯，天津市大茂化学试剂厂；磷酸分析纯；高效液相色谱所用水为二次蒸馏水。 4 3 3 实验部分 黄芩苷标准品和样品溶液的制备同4 2 2 节。 4 3 - 4 结果与讨论 4 3 4 1 检测波长及流动相的确定 黄芩苷标准品溶液，用石英比色皿进行紫外扫描，扫描波长从1 9 0 - 4 0 ( o n 。发现在2 7 5 n m 处有最大吸收，因此确定2 7 8 n m 为测定波长。见4 2 31 流动相是高效液相色谱分析中最重要的测定条件，它的组成对分离测定效果的影响很大。 本实验用甲醇水磷酸作流动相，改变各组分体积比进行对比试验，发现甲醇冰一磷酸体积比 硕士学位论文第四章黄苓苷的分析测定研究 为4 7 ：5 3 ：0 2 时，样品各组分的分离效果较好，且峰形完好，分离度满足色谱要求，故选择甲 醇冰磷酸( 4 7 ：5 3 ：0 2 ) 为流动相。 4 3 4 2 色谱条件 色谱柱( o d s c l 81 5 0 m i n x 4 6 m m ，预柱1 0 n u n x 4 6 r a m ) ：柱温2 5 ；流动相为甲醇： 水：磷酸( 4 7 ：5 3 ：0 2 ) ：检测波长2 7 8 n m ；流速1 5 m l m i n 。 4 3 4 3 标准曲线 精确称取黄芩苷标准品2 0 m g ，置1 0 0 m l 容量瓶中，用7 0 甲醇溶解并稀释至刻度，摇 匀，做为黄芩苷标准品的储备液。精密吸取黄芩苷储备液1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 m 1 分 别置于5 0 m l 容量瓶中，用7 0 甲醇稀释至刻度。按4 3 4 2 节中色谱条件分别进样l o 肛l ， 以标准溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，如图4 - 8 所示。 4 0 0 0 3 5 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 嚣2 5 0 0 0 0 旧2 0 0 0 0 0 誊 1 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 01 0 2 03 0 4 05 0 c ( ug m l ) 图4 - 6h p l c 标准曲线图 用最小二乘法进行回归，得峰面积y 与黄芩苷标准溶液浓度c ( p g m l ) 的线性回归方 程y - q 2 4 1 0 3 + 8 3 1 x 1 0 3 c ，r - - o 9 9 9 8 。结果表明，黄芩苷的进样浓度在8 o l l g ，m i ，5 2 嵋m l 之间与峰面积y 之间呈良好的线性关系。 4 3 a 4 精密度实验 按4 3 a 2 节的色谱条件，对同一份样品供试溶液平行测定5 次，各峰( 包括溶剂峰) 的 绝对保留时间基本一致，样品保留时间的相对标准偏差( r s d ) 为0 2 3 ；峰面积的r s d 为 0 5 6 。 硕士学位论文第四章黄苓苷的分析测定研究 4 3 a 5 加标回收率实验 移取经稀释过的已知含量的样品溶液3 份，每份5 0m l ，再分别加入一定量的黄芩苷标 准品，按4 3 4 2 节色谱条件测定3 次，计算加标回收率，以考察测定方法的准确度，结果 如表4 7 所示，可见回收率在9 8 9 1 0 1 - 3 之间。 表4 - 4 加标回收率实验 4 3 4 6 黄芩苷的色谱图 黄芩苷标准的色谱图见图4 7 ，黄芩苷样品的色谱图见图4 8 。 02468 1 21 - 68丑 图4 - 7 黄芩苷标准品色谱图 4 7 硕十学位论文第四章黄芩苷的分析测定研究 o2468口ti蕾 h 慨 图4 1 8 黄芩苷样品色谱图 由图4 8 可以看出，黄芩苷样品的最大峰值的保留时间与图4 - 7 黄芩苷标准品的保留时 间相同，都是5