（动物遗传育种与繁殖专业论文）四个猪种间BPI蛋白基因外显子3和4的SNP分析.pdf

摘要中文摘要杀菌通透性增强蛋白( b a c t 硎c i d a 帅e a b i l i 妒i n c r e 鹊i i l gp m t i e i n ，b p d 是人和哺乳动物的内源性阳离子蛋白质，主要存在于多形核白细胞的嗜苯胺蓝颗粒中。它具有很强的杀菌( 主要指革兰氏阴性细菌) 、中和内毒素或脂多糖( 1 i p o p 0 1 ) ，s a c c h 撕d c l p s ) 的活性和调理功能，在动物机体天然防御中起到很重要的作用。目前，人、牛、鼠、的b p i 基因序列都己清楚。人b p l 基因外显子3 和4 区域存在多态性，猪b p i 基因第4 和1 0 外显子的r f l p 多态性与沙门氏菌的易感性有关，并被确定为抗病育种的候选基因。在我们的前期研究中克隆了荣昌猪b p i 基因的全长c d l n a 序列，并发现荣昌猪b p i 基因外显子3 和外显子4 上存在丰富的多态位点。不同猪种( 地方猪种、引进品种和培育品种) 之间b p i 基因外显子3 和外显子4 区域的多态性如何，是否存在差异，是本课题需要在前期研究中需要进一步研究的问题。本研究以渝荣i 号配套猪b 系、a 系、c 系三个专门化品系和荣昌猪为实验对象，应用聚合酶链式反应一单链构象多态性( p o l y m e m s ec h a i l lr e a c t i s i i l 西es 昀n dc o n f 0 咖a t i o np o l y m o r p l l i 锄，p c r s s c p ) 技术，检测四个猪种b p i 基冈第3 和4 外显子的单核苷酸多态性( s i n 西e姗c l e o t i d ep o l y m o r p h i 锄，s n p ) ，并将显示不同带型的p c r 扩增产物克隆测序，利用d n a m 柚分子生物学软件对测序结果进行分析比对，找出b p i 基因外显子3 和外显子4 的突变位点，统计不同猪种的基因型频率，计算等位基因频率和各s n p 位点的优势碱基。通过试验分析得出外显子3 的s n p 结果如下：荣吕猪b p i 基因外显子3 存在两个s n p 位点，即第3 7 6 位的a c 突变和3 9 7 位的a g 突变变。a 3 7 6 c 位突变引起氨基酸由g l n 替换为p r 0 ，氨基酸的疏水性由o 2 8 增加到0 6 0 。a 3 9 7 g 位引起氨基酸由g l i l 替换为a 曜，且产生带正电荷的钯。b 系猪外显子3 存在两个突变，即第3 7 l 位的t c 突变和4 4 5 位的a g ，t 3 7 l c 的突变未引起氨基酸的变化。a 4 4 5g 位引起氨基酸由l 笋替换为a r g ，疏水性减弱。c 系猪产生了一个突变，即4 3 5 的a g 突变，氨基酸由l l e 替换为v a l ，且产生的氨基酸疏水性降低。a 系猪未检测到s n p 位点。外显子4 上的s n p 情况：荣昌猪外显子4 区段共检测到6 个阶四位点，它们分别是第5 1 2 位ct ( c 5 1 2 t ) 、第5 5 l 位t g ( t 5 5 l g ) 、第5 6 3 位c t ( c 5 6 3 t ) 、第5 7 3 位t c ( t 5 7 3 c ) 、第5 9 9 位g a ( g 5 9 9 a ) 和第6 0 7 位t c ( t 6 0 7 c ) 突变。其中c 5 1 2 t ，t 5 5 l g ，c 5 6 3 t ，g 5 9 9 a 为无义突变。t 5 5 1 g 突变使限制性内切酶胁ci 或肋，i 酶切位点( t g g c c a ) 消失。第5 7 3 位的t c 突变，引起了氨基酸由s e r 替换为p r o ，突变引起氨基酸疏水性降低。第6 0 7 位t c 的突变引起了氨基酸由v a l 替换为a l a ，使得氨基酸疏水性降低，s u n i 或s p l i 酶切位点( c g t a c g ) 也消失。荣昌猪b p i 基因外显子4 区段的高度多态性，表明该区段有较大的遗传选择潜力。b 系猪存在3 个s n _ p 位点，即5 1 2 位的c t ( c 5 1 2 t ) 、5 5 1 位的t g ( t 5 5 1 g ) 和5 9 9 位的g a ( g 5 9 9 a )突变。此三个突变未引起氨基酸的变化。t 5 5 1 g 突变使限制性内切酶朋如i 或砌，i 酶切位点( t g g c c a ) 消失。a 系c 系猪仔外显子4 未检测到s n p 位点。从四个猪种外显子3 和外显子4 的s n p s 位点的分析可以看出，荣昌猪的多态信息含量丰富，此外b 系猪也较丰富的多态性，a 系c 系多态性不丰富。本试验检测到的外显子3 和4 区段的某些s n p 位点，可能成为猪机体抗某些革兰氏阴性病原菌或其引起的疾病的分子标记。v矾南人学硕士学位论文v i关键词：杀菌通透性增加蛋白b p is n pp c r - s s c pa b s t r a c ta b s t r a c tb 孔t i 喇c i d a 帅e a b i l i 妒i l l c r e 粥i n gp r o t i e i n ( b p di sah i g l l l yc 撕0 n i cp r o t i e i i lw h i c hi sl o c a t e d姗i n l yi nm ep 曲哪g r a n u l 骼o fp o l 舯。呐o n u c l 掰l 即c o c y t e ( p m n ) b p ih 弱ah i 曲a 蹦哆f o rl p s0 fg 髓m - n e g a t i v eb a c t 舐a b i n d i l l go fb p it 0 蛐s c 印t i b l eb t 甜ai sf o l l o w e db yi i l c r e 舔i n g伽t 盯m e n l b 瑚ep e 姗e a b i l i 哆，i i l l l i b i t i o no f 伊硼l 锄du l t i l i l a t e l y i n v e 鹅i b l el o s so f 访a b i l i 够h la d d i t i 伽，b p ia l s op o s s e s s 髂锄叩s o n 主c 劬c t i 伽b e c 卸s eo ft l l e s ei i n p o n 锄t 觚c t i s ，b p ip l a ) ，s 锄岫删枷r o l ei i lh o s ti i l i t i a ld e 劬s e a tp 嘲钮t ，m e 如l l - l g i l lc d n as e q u c 鹤o fb p ig 锄eh a sb 咖e l u c i d a t e di i ls e v e 仡ls p 屺c i e s ，i n c l u d i i l gh u m a n ，b o 、，i n e ，b r 叭) i r nm t ，m o u s e ，锄dp i g o f r o n g c h 锄g i na d d i t i 伽，s e v e m l 一脚。啦i cs i t e sw e r ef o u n di n 既s3 锄d4o f h u m 孤b p ig 饥e nh 觞b e e ns h o w nt 1 1 a tt l l e 化s t r i c t i o n 眈g i l l tl 饥g t l lp o l 肿。咄i 锄( r f l p ) s i t e si l le x o n s4 锄d1 0o f p o r c i n eb p ig 锄ea 他r e l a t e dt 0t l l e 鲫s c 印曲i l i t ) ，o f 勋砌伽e ，口幽d 尼，h 括i ns e v 啪lp i gb r e c d s t h ep o r c i l l eb p ig 饥ew 舔c o n s i d 删勰ac 觚d i d a t eg eo f b 他e d i n gf 1 0 rd i s e 嬲e 佗s i s t 锄c e w eh a v cf o 啪d v e m lp 0 1 ) r i i l 唧h i cs i t e si i le x o n s3 锄d4o f 枷g c h 锄gp i gi no u ri n v e s t i g a t i o nw eh a v ed e h 鲫，e 、a 鹏d i 仃打吼to fp o l y m o r p l l i 锄o fe x o n s3 锄d4b e 似e e i lr o n g c h a l l gp i g 柚do m e rs 昀i i lp i g s( n a t i v e ，i i i l 】p o n ，c r o s s b r e e dp i g s ) b p ig e n e ，觚da 豫t l l ed i f r c r e n so b v i o u si su n c l e 盯i nm i ss t l l d y ，t l l ep i gb r e e d sb ei n v e s t i g a 刷a 他r o n g c h 锄g ，a ，b 柚dc s 仃a i l lp i g sw h i c hw e 他p u 他b 阳e d se l e c t e db yf 1 0 u rg 锄e 豫t i o n s t l l es n ps i t e si i le x o n s3 柚d4o ft l l i sg e n ew e r ed e t e c t e db yp 0 1 ) ，i i l e r a s ec h a i nr e a c t i o n s i l l g l es 仃觚dc o n f o r m 撕p 0 1 ) ，i l l o 呻i 锄( p c r s s c p ) 觚a l y s i s t l l t l l ep c rp r o d u c t ss h o w i l l gd i 伺f e m l tp a t t 锄sw e 他p 耐f i e d 锄dc 1 0 n e df 研s e q u c i l l g f i n a l l y m e肫q u e i l c i e so fd i f i 研e i l c eg 钮o t y p e sw e r ea c c o u n t e da l l dt l l ea l l e l i cg 鹤6 伽u 锄c i e sw e r ec a l c u l 砷c da c c o r d i n gt 0m ef 0 锄e rr e s u l t 胁e rm o 他，t l l es n ps i t e si i le x o n s3 锄d4w e 陀f o u n db ys e q u 朋c ea l i 舯m 锄to fd i 丘e 玎跚ta l l e l i cg 锄e s f r e q u c i 鹤o ft l l eb a s e s 谢mh i g l l e ra p p e a r 锄c e6 蜘u 饥c yi l lt 1 1 e s es n ps i t e sw c r ec a l c u l 删a c c o r d i n gt 0t l l ed i s t r i b u t i o no fs n ps i t e si i la l lm ea l l e l i cg 饥e s i l lt l l ee x o n3 纳鲫明t ，t h 唧、糯t 、on o v e ls n p s ( a 3 7 6 c ，a 3 9 7 g ) d e t e c t e di nt l l e 懿3o fr o n g c h 觚gp i gb p ig 钮eb yp c r s s c p 1 ka 3 7 6 cm a d eg h l 9 4 p r os u b s t i t i i t i o n ，t l l eh y d r o p h o b i c 时i n 铡淞e 舶吼0 2 8t 00 6 0 血ea 3 9 7 gn m t a t i 伽m a d ea 唱1 0 1 g l ns u b s t i t i l t i 伽t w on o v e ls n p s ( t 3 7lc a 4 4 5 g ) w e 佗d e t t i e di l ll l l e 甑3o fbs 昀i i lp i g sb p ig 饥eb yp c r - s s c p ，t h et 3 71cm u t a t i o n 、) l ，鹳s y n o n y m o 啪s u b s t i t i l t i s m ea 4 4 5 gm u t a 缸0 nm a d el ，y sl l7 a r gs u b s t i t i l t i o n ，锄dt l 他h y 怕p h o b i c 埘d r o p 硒m - o 8 9t o - 1 0 5 t h e r e 、鹪0 n en o v e ls n p ( a 4 3 5 g )曲眈t e di 1 1t l l ee x 3o fc s 舰i i lp i g sb p ig 髓eb yp c r s s c p ，i tm a d eu e1 1 4 v a ls u b s t i t i l t i o n ，m eh y 蛐o b i c i t ) rd r o p 五r o mo 8 3t oo 7 8 t l l e r cw 嬲n on a v e ls n pb ef 0 珊di l lal i n e a g ep i g h l l e 懿彻4 如舯朗t ，s i ) 【n o v e l ( t 5l2 c ，g 5 5lt ，c 5 6 3 t ，t 5 7 3 c ，g 5 9 9 a ，t 6 0 7 c ) o f 卧m sw 唧d 嗽t e d f o l l ro ft h 锄( t 512 c ，g 5 5lt ，c 5 6 3 t ，g 5 9 9 a ) w e r es ) ，i l ) ，i i l 吣s u b s t i t i l t i o n s 1 1 1 eg 5 5ltn o v e lm a d ea 曩鹤t r i c t i o n d o n u c l e 懿e 朋j cio 馏口，i ( t g g c c a ) d i s a p p e a r m en o v e l ( t 5 7 3 c )m a d es 盯l6 0 p ms u b s t i n l t i o n ，蚰dt l l eh y d r o p h o b i c 埘d r o p 舶m0 6t 0o 4 6 t l 圮n o v e l ( t 6 0 7 c ) m a d ev a l l 7 1 a l a 蛐b s t i t i l t i 伽，h y d r o p h o b i c i 够d r o p6 姗一1 2 l t o 1 6 1 1 1 1 r s n p sw h i c hw e 他s 锄ev i l两南大学硕士学位论文w h i mm r e eo ft l l er o n g c h a n gp i g ss n p sw e r ef o u n di nbs t r a i l lo fp i g s ，t l l e r ew e r e t 512 c ，g 5 5lt ，g 5 9 9 a s n p sw e 他n o tf 撕l di naa n dcs 仃a i np i 窒r s t h ea m u tp o l y m o 印h i s mo fe x o n4i n d i c a t ei t sh u g ep o t 饥t i a l 蚵i 1 1g e n 鲥cs e l e c t i s 伽eo ft h es n ps i t c sd e t e c t e di nm i ss t i l d ym a yb ei m p o n 觚tm o l e c u l 盯m 盯k e 幅o fp o r c i l l ed i 嬲e 咒s i s t a n c e ，s p e c i f i c a l l y 陀s i s t a l l tt og m m - n e g a t i v eb a c t c i i 够锄di t sc 卸s e dd i s e s e s 懿k e y w o r d s ：b p ls n pp c r s s c pv h l中英文缩写对照表i i i独创性声明学位论文题目：婴企猹狴闻里里! 蛋自基困处垦壬狸垒鲍墨盟里佥盘本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者：曹秭洋签字日期：7 口。8 年岁月? 1 1 r 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：曹f i 氧牮导师签名：丑互为签字日期：? 口口3 年歹月9 日签字日期：刀易年厂月卵日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：文献综述第1 章文献综述1 1 猪抗病育种候选基因研究进展传统猪的育种工作以追求高产肉性能和快速的生长速度为主要目标，但由于这二者与抗病性状之间表现为遗传负相关，高的产肉性能和快速的生长速度往往使得猪的抗病力下降，疾病的发生率提高。单纯依赖预防接种并不能完全控制或消灭传染病的流行。随着分子生物学技术迅速发展，国内外学者相继提出抗病育种的设想，即用遗传学方法从遗传本质上提高猪对病原的抗病力。对这些传染性疾病抗性相关候选基因或分子标记的深入研究，将有助于在分子水平上对动物进行抗性选育。随着分子生物学等生命科学对动物遗传育种领域的快速渗透，许多控制动物优良性状的候选基因或分子标记得以发现。其中控制猪机体抗病性状的候选基因主要有四类：受体类基因、抗菌肽或蛋白类基因、信号传导类基因、s l a 基因家族，它们都显示出对抗病育种的研究具有重大的价值。1 1 1 受体类基因受体类基因是作为某些病原菌或配体分子特异结合吸附到宿主组织细胞上的结构和功能基因。这类基因的突变或缺失，会引起该受体的结构和功能的改变或缺失，从而使病原菌和配体分子不能结合上去，也就对某些特定的病原菌和某些遗传缺陷病显示出抗性。1 1 1 1i 型兰尼定受体基因猪应激综合症q o r c i n es n 岱ss ) r 1 1 怕m e ，p s s ) 是由i 型兰尼定受体( r y 锄0 d i i l er e c 印t o ri ，r ti ) 基因控制的一种单基因隐性遗传病，可导致猪的应激死亡和产生灰白水样( p a l e ，s o f t ，甑u d a t i v e ，p s e ) 肉。p s s 在皮特兰、长白猪等瘦肉率高的外种猪中发生率较高。1 9 9 3 年，t r a s k 【1 1 等通过f i s h 将r y r l 定位于1 9 q 1 3 1 。1 9 9 6 年，p h i l l i p s 【2 1 等鉴定了该基因的基因组结构，该基因长1 6 0 k b ，含1 0 6 个外显子，编码5 0 3 8 个氨其酸残基，其不同类型突变导致以下两种遗传病。应激敏感猪的r y ri 基因c d n a 第1 8 4 3 位碱基由c 突变为t ，导致受体蛋白第6 1 5 位的精氨酸( 她) 替换为半胱氨酸( c ) ，s ) ，引起结构和功能改变【3 4 1 。当应激敏感猪受到应激因子( 如运输、高温等) 的刺激时，骨骼肌中c a 2 + 大量非正常释放，引起肌肉持续收缩，因而产生应激综合症。该位点突变导致限制性内切酶酶切位点改变，即由协口i 的酶切位点( - 5 t g c g j c 3 一) ，变为魄翻i 的酶切位点( 一5 g t g c t 上c 3 ) ，因而可以通过酶切图谱鉴别氟烷基因型5 1 。这对生产上消除氟烷基因影响很有意义。此外，r y ri 外显子4 4 上的突变( a l a 2 3 5 0 1 1 l r ，她2 3 5 5 1 砷，g 1 ) ，2 3 7 5 a 1 a ) ，显示与人恶性高温症有关【6 】。此突变是否与猪机体相关疾病易感性有关，目前还不清楚。1 1 1 2 肠毒素型大肠杆菌受体基因文献综述是机体天然抗菌活性的增强，那么，机体则表现出对某些病原菌的抗性。1 1 2 1 杀菌通透性增加蛋白( b p i ) 基因b p i 是1 9 7 8 年w e i s s 等从健康人的中性粒细胞中提取得到一种分子量为5 5 1 0 3 、等电点为9 8 的蛋白质，因其对数株革兰阴性菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁的通透性，使正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素d 得以穿过细胞壁而进入菌体，因而称之为杀菌通透性增加蛋白( b a c t i e r i c i d a l p e 咖e a b i l i t y - i n 饿档i n gp r o t e i i l ，b p i ) 。b p i 是由4 5 6 个氨基酸组成的阳离子蛋白，对革兰阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功能，与革兰阴性菌脂多糖( l p s ) 具有较高的亲和力，同后者结合所形成的b p i l p s 复合物能阻止l p s 所引发的宿主细胞免疫应答反应。1 1 2 2 天然抗性相关的巨噬蛋白1 基因天然抗性相关巨噬蛋白l ( n a n 聃l 豫s i s t a i l c e 嬲s o c i a t e dm a c r o p h a g ep r o t e i n l ，n 凡m p l ) 基因是n 凡蝴p 基因家族的一个成员，又称s l c l 认l ( s o l u t ec a r r i e r i l y1 1 am 锄b e r1 ) 基因，该家族至少具有2 3 个成员口6 1 ，编码一个完整膜蛋白，含有1 0 1 2 个跨膜区域，具有离子通道和转运功能的特征阢2 8 1 。动物的n ra m p l 基因主要在吞噬细胞，如巨噬细胞和多核型白细胞中特异表达，而n u 佃2 则在绝大多数组织和细胞中表达【2 9 】。n l 蝴1 基因主要在网状内皮细胞器官的巨噬细胞中表达，可抵抗沙门氏菌、利曼氏原虫、分枝杆菌等多种胞内病原微生物【2 7 3 0 1 。对其功能的分析结果表明，n r a m p l 可能是通过消耗含有胞内病原微生物的吞噬体中二价金属离子，如镁离子、亚铁离子、锌离子等，使病原微生物缺乏增殖所必需的离子而达到抵抗胞内微生物的作用【3 。c 础一2 6 1 等通过筛选脾脏的c d n a 文库克隆了人类的n 黜蝴p 1 基因。1 9 9 7 年，t u g g l e 等同样在猪的脾脏c d n a 文库中克隆出猪n r a m p lc d n a 序列，对序列分析表明人与猪的n r a m p l具有很高的相似性，其蛋白质氨基酸序列一致性高达8 7 。目前，人( 卜n 订0 0 0 5 7 8 ) 、鼠( n m0 1 3 6 1 2 ) 、猪( n m2 1 3 8 2 1 ) 等的卜限a m p l 基因c d n a 序列都己被克隆。人n r a m p l基因被定位于x西南大学硕士学位论文从1 1 个地方品种8 4 头猪的群体中发现了3 个等位基因，且n 删p l 与s s c l 5 上的s 0 0 8 8 、s 0 1 4 9 、s 0 2 8 4 标记紧密连锁。研究显示，不同品种猪中的n r a m p l 等位基因频率差异很大，a 等位基因只存在于白色品种中，相应c 等位基因只在有色品种猪中发现。吴宏梅和王立贤口鲫采用p c r - r f i ，p 法分析了猪n r a m p l 基因第六内含子在长白和中畜黑两品种中的n d e i 酶切片断多态性，并对其与免疫相关指标和生产性状之间的关系进行了研究，认为品种对免疫相关指标无影响，对1 8 0 日龄重影响显著。尽管目前已克隆了多种生物的n i 认m p l 基因，对在动物抗病原微生物侵染中的可能性作用及机制也有了初步了解，但对猪的n r a m p l 基因与抗病力的关系特别是不同基因型与抗病力差异之间的关系还有待进一步研究。1 1 2 3 兀玎1 基因f u t l 基因又称a ( 1 ，2 ) 岩藻糖转移酶基冈，是大肠杆菌f 1 8 受体( e c f l 8 r ) 的候选基因，与仔猪断奶后水肿和腹泻病密切相关，其作用机制是由肠毒素大肠杆菌f 1 8 ( e c f l 8 ) 通过其黏附素黏附于仔猪小肠粘膜上皮细胞刷状缘，产生类肠毒素，并通过渗透引发组织胺的释放，从而导致血管壁损伤，水分因大量渗出而发病。v o g e l i 等h 1 1 采用候选基因法，体外黏附实验及荧光原位杂交将f u t l 基因定位于猪6 q l l 区段，f u t l 开放阅读框( o r f ) 的长度为1 0 9 8b p ，与人类兀j t l 同源性达8 2 3 。m 删砥i l l ( 等采用p c r 1 u 玑p 对该基因进行分析表明，f u t l 基因开放阅读框的3 0 7b p 处存在一个g a 点突变( m 3 0 7 g - a ) 。且g 对a 为显性。采用h i i l 6i 酶内切时会由于a 基因丢失1 个酶切位点而产生三种基因型，即a a 型为e c f l 8 r 抗性猪，g g 型为敏感猪，杂合子a g 型也是敏感猪。施启顺、晏学明等删就国内外猪种在f u t l 基因m 3 0 7 处的多态性情况进行了p c i l r f i p 研究，结果均认为该位点在国外猪种中存在一定的多态，并以敏感型居多，而在国内地方猪种中均不存在多态。姜勋平等报道认为兀j t l 基因对肉质和胴体性状具有显著的正遗传效应，但其检测的从型比例与国内外其他学者的结果具有显著的差异，有关f u t l 基因在国内外猪种中的分布还有待进一步研究证实。1 1 2 4 干扰素基因干扰素( h l t 刮衙o n ，n f ) 具有广谱、高效抗病毒功能，对免疫系统起着关键调节作用。i s 缸c s在进行鸡胚细胞流感病毒感染试验中，首次发现一类能干扰和抑制病毒复制的可溶性细胞分泌物，故取名为干扰素4 6 朋。目前发现的干扰素主要有烈f - a 、b 、d 、k 、i 等i 型干扰素( 酸敏感型) ，i i 型干扰素( 耐酸型) 矾f 吖，以及最近发现的丸干扰素家族。其中，每一种干扰素根据组成氨基酸的差异又可分为多个亚型，不同亚型间同源性很高，但具有生物活性上的差垦【镌 4 9 】丌。目前所发现的猪干扰素包括矾f a 、b 、d 、国和d 师吖，玳f 司未在其它物种中发现，已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括d 师a 、b 、和m f 吖【镌】。体内外试验表明，4文献综述割，同时运用合成肽技术，发现了几个具有l p s 中和活性的肽，主要位于氨基端3 区域( 氨基酸位分别是1 7 4 5 ，6 5 9 9 ，1 4 2 1 6 9 ) ，但是这些肽只保留了完整氨基端的部分活性扫引。j 啪s l a va 【9 8 】等1 9 9 7 年研究表明，b p i 蛋白n 末端区具有b p i 蛋白的全部杀菌活性和中和l p s 的活性，与l p s 结合的功能区位于8 4 1 0 0 氨基酸之间，c 末端区主要起到增强b p i 蛋白的稳定性，以及增强机体细胞免疫的调理作用。b p i 蛋白分子结构的研究和杀菌机理的不断被发现，为b p i蛋白的治疗作用和为分子结构的进一步改进提供了基础。1 2 3b p i 蛋白的杀菌效应的研究通过不断的研究发现b p i 蛋白在治疗由细菌、真菌、原虫等引发的疾病方面有重要作用。斯卡诺恩等1 9 9 7 年取得了关于b p i 蛋白对创伤出血病治疗的专利【9 9 1 。l o 妇圮等也于同年发现b p i 能加强中性粒细胞的噬菌作用，并表明b p i 和中性粒细胞以氧依赖性作用模式相互协同【1 0 0 】。l ( 1 l 锄等于1 9 9 9 年首次发现重组b p i 蛋白氨基端( r b p l 2 1 ) 在体外、或体内对鼠弓形体有抑制作用，而对宿主细胞仅有轻微毒性，与磺胺嘧啶配伍后其体内外抗弓形体作用可增型1 0 1 1 。2 0 0 0 年，v 锄d e rs c h a r 研究发现b p i 蛋白可通过诱导血管内皮细胞的凋亡来抑制血管生成，而且这一作用与浓度显著相关。此发现使b p i 蛋白有望用于治疗癌症或与血管形成有关的疾剜1 0 2 】。同年，n e l l 等在人中耳上皮培养细胞的培养基中加入r b p l 2 l 后观察发现培养细胞的形态发生改变，如粘膜层增厚、分泌细胞数量增多等这些现象的改变会显著减少甚至消失【1 0 3 1 。n e ，l l l 锄等发现b p i 含有抗荚膜组织包浆菌的成分。它的杀灭作用与浓度显著相关，并且和防御素及组织蛋白酶g 间有协同作用【1 0 4 】。n i s h i m u 托等2 0 0 1 年研究发现，b p i 能够通过促进补体活化，提高中性粒细胞2 5 倍的吞噬能力1 0 5 1 。1 2 4b p i 融合蛋白的研究进展近年来b p i 融合蛋白日益成为研究热点，其主要原因是b p i 融合蛋白是将b p i 自身和其它生物活性强大( 如杀菌活性) 的功能性蛋白或蛋白片段有效结合，克服了很多单纯组件缺点，加强了b p i 蛋白的功能。蒂奥芬等于1 9 9 3 年取得了b p i 一免疫球融合蛋白质的发明专利【1 0 6 】。该融合蛋白氨基末端包含有杀菌通透性增加蛋白质或生物活性片断，羧基末端包含至少一种免疫球蛋白重链恒定区，与单纯的b p i 蛋白和免疫球蛋白相比，该融合蛋白杀菌活性大大增加并对于治疗由细菌感染引发的疾病有很好的效果。2 0 0 0 年，中国人名解放军第四军医大学第一附院取得了i g gf a b 。b p i 融合蛋白质的发明专利1 0 7 1 。此发明是在广谱抗内毒素单克隆抗体的基础上，将该抗体的f a b 段基因与分离得到的杀菌通透性增强蛋白n 端基因融合表达于中国仓鼠卵巢细胞( c h o ) ，并成功表达出i g gf a b b p i 融合蛋白。该融合蛋白对各种属细菌l p s 的交叉反应性、中和活性、反应速率、作用时间和针对革兰氏阴性菌及l p s 的靶向性等方面都较单纯的b p i 有进一步的提高。该融合蛋白为治疗临床脓毒症及败血症、内毒素血症等的治疗找到一条新的9西南人学硕士学位论文有效途径螂】。首都医科人学的安云庆等发明一种包含b p i 基因的重组病毒( b p i i i l 2 3 f c y ) ，重组的b p i 或其功能性氨基端片段与天然b p i 具有相同的生物学作用，它们对革兰阴性菌和细菌脂多糖具有很高的亲和力，不仅能广谱杀伤革兰阴性菌还能有效中和细菌内毒素，具有良好的临床应用前景1 0 9 】。由于b p i 融合蛋白不仅具有单纯b p i 蛋白的作用，而且通过增加其它功能性免疫蛋白质( 如球蛋白i g g ) 或增加其他特殊结构，克服了自身蛋白的缺点，增加了非自身组分的很多功能特点，因此b p i 融合蛋白将成为研究的热点，在临床将得到更广泛的应用。2 0 0 5 年，中日友好医院得章璐等发表的论文关于提高重组抗菌蛋白b p i 在e c o l i 中表达水平和复性率的研究，该研究进一步提高了重组蛋白在原核细胞的表达水平。获得了相对高产的功能性目的重组抗菌蛋白，减少了临床实验成本0 1 。郭向华、李晨等研究的w 2 一b p l 7 0 0 f c r l 7 重组病毒导入小鼠对致死量大肠埃希氏菌感染的保护作用机制，成功构建了a a v 2 一b p l 7 f c r l 7 0 0 重组病毒，并通过b p l 7 斯1 7 0 0 目的嵌合基因导入使小鼠对e c d 厅最小致死量感染攻击的抵抗力显著增捌川】。1 2 5b p i 蛋白的作用机制b p l 为带正电荷的阳离子蛋白，其与i 类脂的作用基础是静电作用和疏水作用，即b p i 所带正电与l p s 所带负电之问的作用和b p i 的疏水区与i 类脂a 之问的作用。当b p i 与g 一菌表面l p s 结合后，使l p s 在菌细胞膜上的正常排列破坏，从而导致菌细胞渗透性显著增强和菌细胞的裂解。二者结合后可产生亚致死和致死两种效应。亚致死效应发生在早期，这时细菌外膜会对小的疏水分子通透性增强，细菌磷脂对内源性和外源性的磷脂酶敏感性增强，细菌生长受到抑制，但此过程是可逆的，细菌还可以修复和生长。致死效应发生在晚期，随着b p i 浓度的增加，作用时间的延长，细菌内膜发生结构和功能性损伤，细菌生长发生不可逆抑制，最终导致细菌裂解死亡。这表明b p i 主要作用和产生致死效应的靶部位是细菌内膜。另外，b p i 在促进中性粒细胞吞噬g 菌时，以剂量依赖的方式促进补体裂解片段c i c 沉积于细菌面，c i c 叉细菌表面形成酯或氨基复合物，然后经受体( c r ) 活化途径促进吞噬。现已明确，b p i 可与内毒素结合蛋白( l b p ) 竞争结合l p s ，从而抑制l p s 与效应细胞上的c d 结合发挥其抗内毒素作用1 1 2 】。由于n 端片段的高度阳离子化，当b p i 蛋白与革兰氏阴性细菌胞膜表面带负电荷的l p s结合时，亲和力很强，结合很牢固。在早期，b p i 蛋白与细菌外膜特异性结合后激活一系列酶解系统，促使膜磷脂和肽聚糖降解，使得细菌外膜通透性改变，生长受抑制，但细菌还可以修复和生长。在晚期，随着作用时间延长，b p i 蛋白浓度增加，细菌胞膜屏障被破坏，出现结构和功能性改变，其生长受到不可逆性抑制，最终裂解、死亡【1 1 3 ，4 】。研究表明，n 末端区独立具有b p i 的全部杀菌活性和中和l p s 活性，l p s 结合功能区位于8 4 1 0 0 氨基酸之间【1 1 5 ，1 1 6 1 。c 末端区主要起到增强b p i 的稳定性，以及增强机体细胞免疫的调理作用1 17 1 。1 2 6b p i 蛋白蛋白基因1 0两南大学硕士学位论文1 3 分子标记技术研究进展遗传标记，是指能够用以区别生物个体或群体的特定基因型或特定性状、并能稳定遗传的物质标志，且遵循简单的孟德尔式遗传规律。遗传标记主要包括形态学标记( 如毛色等) ，细胞遗传学标记( 如染色体带型等) 、免疫学标记( 如血型特异抗原等) 、生理生化遗传标记( 如同工酶等) 和分子标记( 微卫星等) 等几种类型。其中，分子标记是在2 0 世纪9 0 年代随着分子生物学技术的发展而发展起来的。d i n a 标记出现以前的各种遗传标记都有简单、明了、易于分析的优点，但是可供利用的标记类型少，多态性不丰富，不能够完全反映遗传物质d n a 多态性，在遗传连锁分析受到很人限制1 2 4 1 。分子遗传标记本质上是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异，它克服了其它遗传标记的诸多缺陷，具有分布j “，多态性丰富，遗传稳定性和准确性高等优点，能够从遗传本质d n a 水平上对基因的结构和功能进行研究，因此，分子遗传标记被广泛应用于遗传分析的各个领域1 2 5 1 。特别是将分子遗传标记技术和常规育种技术相结合，应用标记辅助选择法( m a r k 盱鹤s i s t 锄ts e l c t i o n 。m a s ) 选育动物，能消除传统选育过程中因表型选择带来的环境偏差和抽样误差，可提高选种准确性，减少测定投入，加速优良品种的选育【1 2 6 1 。下面就目前广泛应用于动物遗传育种领域的各种分子标记技术及其研究进展作一简述。1 3 1 限制性片段长度多态性技术限制性片段长度多态性( r e s t r i 甜o nf r a 舯咖l c i l g t hp o l 严。讪i 锄，r f l p ) 技术是最早应用于动植物学遗传研究的分子标记，也称为第一代分子标记【1 2 7 1 。r f i ，p 是由于d n a 分子中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致酶切位点的增减所引起的限制性片段长度的差异。它利用限制性内切酶切割基因组d n a ，形成大小不等、数量不同的分子片段，经电泳分离，通过s o u t l l 锄印迹将分子片段转移至支持膜上，然后用放射性同位素或非同位素( 如地高辛) 标记探针与之杂交，经放射自显影或显示，便会显示出l p谱带，呈现不同程度的多态性。近年来，人们将p c r 技术用于l u 吧p 分析，即p c r r f i j 。该技术先用一对引物特异地扩增基因组内某一高变区，然后酶切扩增产物，电泳检测多态性。这样省去了探针制备、分子杂交等繁锁程序，d n a 需求量也少，大大简化了传统的i 江l p 技术【1 2 引。由于r n ，p 标记具有较高的分辨力，共显性遗传等特征，其结果有着很强的重复性和准确度，在高密度遗传连锁图谱、指纹图谱的构建、群体遗传与系统演化等研究领域具有重要的应用价值1 2 9 1 。目前，r f l p 多用于分析动物的遗传多样性，研究品系、居群间的亲缘关系，起源及分化，检测遗传疾病，寻找与生产性状相关的标记位点等u 3 0 ，1 3 1 ，1 3 2 1 。1 3 2 微卫星标记技术微卫星或称简单序列重复( s i m p l es e q u 锄c er e p e a t s ，s s r ) 是指以少数几个核苷酸( 2 - 6 ) 为单位多次串联重复而成的d n a 序列，如( c a ) n 、( g 1 b ) n 等。它广泛分布于真核生物基因组中，1 2文献综述大约每隔l o 5 0k b 就存在一个微卫星l l ”】。每个特定的微卫星d n a 位点均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧翼区。核心区指串联重复而成的d n a 序列，每个重复单元长1 6 b p 、重复次数是变化的、总序列长度小于3 0 0 岫。重复数变异提供了微卫星位点产生多态性的基础。侧翼区是相对保守的单拷贝序列，具有位点特异性，使其特异地定位于染色体某一位置。因而可根据两端的序列设计一对特异的引物，扩增每个位点的微卫星d n a 序列f 1 3 4 】。微卫星反映着物种的进化历史，共有的等位基因在该物种基因组中最为古老、保守，其余的等位基因则在进化过程中由于插入、缺失等机制所造成，不同品种在同一微卫星座位上等位基因数目和频率的差异体现出其遗传的差异【i ”】。微卫星d n a 在多种生物基因组中具有丰富的长度多态性( s i i n p l es e q u 锄c e g t l lp o l 舯。巾h i 锄s ，s s l p ) ，在群体中变异范围大，杂合性高、种类多、分布广、重组率低，容易筛选和测序。在种群中表现高度的个体特异性、属于不稳定d n a 序列，并且按照孟德尔共显性方式遗传，遗传连锁不平衡，对表型无影响。微卫星d n a 检测容易、重复性较好，耗时少，适合于进行自动化分析【b 6 】。目前，微卫星标记常被用作构建遗传图谱、功能基因及q t l 定位、畜( 禽) 品种资源分类、遗传多样性的评估和保存及个体识别的研究中，以及通过研究微卫星位点等位基因的突变模式来计算遗传距离，进行系统进化研究和重构系统发生树等【1 3 7 ，1 3 8 ，1 3 叭。1 3 3 单核苷酸多态性单核苷酸多态性( s i n g l e 仰c l e 0 6 d ep 0 1 ) ，i i l o 咄i 锄s ，研咿s ) 是d n a 多态性的一种，指d n a 序列中单碱基的差异，由于其数目多、分布广泛且相对稳定，成为继第一代限制性片段长度多态性标记、第二代微卫星标记后的第三代基因遗传标记。它是随着h g p 的实施而发展起来的新一代遗传标记，被认为是人们疾病易感性和药物反应的决定性因素的变化，以及是否会引起对某些疾病的抗性，还有待更深够已鋈翼s ) ，它所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种为非同义c s n _ p s ( n o n s y n y m 伽s c s n p s ) 指碱基序列的改变可使翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的西南大学硕士学位论文位基因( b i a l l e l i c ) 。二等位基因有四种不同类型，包括一种转换c t ( g a ) 和三种颠换c a( g 、叮) 、c g ( g c ) 、t a ( a t ) 。四种s n p s 类型在人类中的发生频率不同，最常见的为c t ( g a ) 转换，约占2 3 ，其它三种颠换类型发生的频率相当。s n p s 可通过电泳、p c r 、酶切、直接测序、生物信息学及d n a 芯片等方法进行检测。以下几种常用方法：p c r - r f l p 【1 ：运用此方法的前提是阶咿的位点必须含由该限制性内切酶的酶切位点。原理是运用限制性内切梅梅切位点的特异性用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一d n a 片断，然后进行电泳检测。p c r s s c p 【1 4 5 1 ：是根据目的基因的核苷酸顺序，合成引物，并用p c r 扩增的靶序列用热或化学方法变性为单链，在一定浓度下进行非变性的聚丙烯酰氨凝胶电永。由于单链d n a 迁移率除了跟教的浓度有关，还与单链形成的空间构象有关，所以由相同长度的单链d n a ，引起顺序或碱基差异，所形成的空间构想就会不一样，在电永中的速度也就不一样。变性高压液相色谱( d h p l c ) 【1 4 6 ，1 4 7 1 ：基本原理是含有突变位点的p c r 扩增产物经变性，逐步降温退货后，将形成同源和异源双链2 种d n a 分子。在部分变形条件下，由于异源双链