（生物物理学专业论文）磁性固定化漆酶的制备及其应用研究.pdf

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连氮- 双( 3 乙基苯并噻唑一6 磺酸) 】对染料的脱色有明显的促进 作用，而次甲基蓝只有在a b t s 存在下才能被脱色。孔雀绿和结晶紫的脱色效率最高， 反应2 4 ；j 时分别能达到9 3 3 和9 0 6 ，加入小分子物质a b t s 后甚至分别可以在l 小时和 1 2 d 时内达到1 0 0 ；甲基橙和甲酚红次之，脱色率分别能达n 8 5 3 和6 6 7 以上；次甲 基蓝的降解率最低，固定化漆酶在2 4 小时内几乎不能直接降解次甲基蓝，加入a b t s 后 也最多能达到4 0 。 关键词：漆酶磁性固定化漆酶 苹果汁除酚染料脱色 l 文献综述及本研究的目的和意义 1 1 磁性高分子微球的研究进展 磁性高分子微球一般是指内部含有磁性金属或金属氧化物( 如铁、钻、镍及其氧化物) 的超细粉末而具有磁响应性的高分子微球，它是近二十年来发展起来的一种新型功能高 分子材料。磁性高分子微球可以通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反 应性功能基( 如羟基、羧基、醛基、氨基等) ，并可进一步通过共价键结合酶、细胞、抗 体等生物活性物质。在外加磁场的作用下，进行快速运动或分离。因而，磁性高分子微 球作为新型功能高分子材料，在生物医学( 临床诊断、酶标、靶向药物) 、细胞学( 细 胞标记、细胞分离) 及生物工程( 酶的固定化) 等领域有着广泛的应用前景。 1 1 1 磁性高分子微球的结构类型 磁性高分子微球一方面要求具有较强的磁性，另一方面需要表面携带能与亲和配基 共价键合的有机活性功能基团，生物来源的磁性高分子微球一般很难获得，有机化合物 磁性材料尚处在实验室探索阶段，目前普遍采用的是无机磁性超微颗粒与有机高分子化 合物形成的复合材料。 磁性颗粒的种类很多，较常用的有金属合金( f e ，c o ，n i ) 、氧化铁( y f e 。0 、f e ，0 ) 、 铁氧体( c o f e 0 b a f e 。0 。) 、氧化铬( c r o ：) 和氮化铁( f e ，n ) 等，其中f e m 0 ( m a g n e t i t e ) 是应 用最多的磁性颗粒，它很容易在水溶液中沉淀制备，亚铁盐溶液在碱性条件下氧化沉淀 可以获得大粒径( l o o n m ) f e 籼颗粒，亚铁盐溶液与高铁盐溶液按一定比例在碱性条件下 共沉淀合成的纳米级( l o n m ) f e 抑。具有超顺磁性。 与磁性颗粒复合并提供活性功能基团的有机高分子化合物分天然的和合成的两种， 常用的天然高分子有蛋白质、纤维素、壳多糖、葡聚糖和磷脂类等，合成亲水性高分子 如聚乙二醇、聚丙烯醛、聚丙烯酰胺等，疏水性高分子如聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等，此 外硅烷衍生物也是包裹磁性颗粒的一类重要有机硅化合物。磁性颗粒与有机高分子形 成的复合结构与磁性高分子微球的制备方法有关，图l 示出t - - - 种常见的磁性高分子微球 结构类型”。 ( a )( b ) ( c ) ( a ) 核壳型，( b ) 混合型，( c ) 多层型 图2 磁性高分子微球的结构类型 f i g ，2t h es t r u c l u r et y p e so f m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e s 1 1 2 纳米f e ，0 。的制各方法”1 1 1 2 ，1 沉淀氧化法 将f e 与适量的碱性溶液混合反应牛成f e ( o h ) ：沉淀，其反应式为： f e 。+ 2 0 h 。= f e ( o h ) ! 在搅拌的情况下，分另i j 以向f e ( 嘣) ! 沉淀中鼓入空气和加入双氧水两种方法使 f e ( o h ) ：部分氧化并最后生成f e 。0 ，其反应式如下： 3 f e ( o h ) 2 + 0 = f e = l v l 0 + 3 h 1 0 用沉淀氧化法制备的f e ：；0 晶体粒径般大于3 0 n m ，而且分布不均匀，不太适合合成 磁性微球所需( 粒径 3 0 r i m ) 。 1 2 2 2 共沉淀法 将f e 和f e “按照一定比例混合，然后在搅拌的情况下加入碱性溶液与之反应生成 f e , ，o ，沉淀，其反应式如下： f e + 2 f e l + + 8 0 h 。= f el o | + 4 h 。0 用共沉淀法制备的f e 。0 超微粉，它的粒径较小，而且分布较窄，适合于合成磁性微 球所需( 粒径 1 0 n m ) 的具有超顺磁性的f e 。0 ，超微粉。 1 1 3 磁性高分子微球的制各 磁性微球的制各方法主要包括包埋法、单体聚合法、活化溶胀法和生物合成法四类。 1 1 3 1 包埋法 包埋法是将磁性粒子分散于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得 到磁性高分子微球。d e k k e r 4 1 崎磁性粒子f e 3 0 4 悬浮于聚乙烯亚胺( p e i ) 溶液中，通过过 滤干燥处理得到外包p e i 的磁性微球：g u y p t e r i s l 等用磷脂处理纳米级的磁性粒子，制 得磁性脂质体微球；y e n l 6 1 等制备了功能性磁性粘多糖( 如壳聚糖) 微球。其方法是在f e c l z 和f e c l 3 的酸性水溶液中溶解壳聚糖，然后通过控制p h 值得到磁性壳聚糖微球，其粒径 的大小和溶液中粘多糖的浓度成正比关系；b a h a r 口i 等将悬浮有f e 3 0 4 的油相倒入水相、 搅拌，然后在室温下蒸发出油相溶剂氮仿，制得带有反应性醛基的磁性聚苯乙烯微球， 并将其用于固定化葡萄糖淀粉酶的研究。 i 1 3 2 单体聚合法 单体聚合法是在磁性粒子和有机单体存在的条件下，加入引发剂、表面活性剂、稳 定剂等物质聚合而成的核壳式磁性高分子微球。制造高分子微球的常规方法，如悬浮聚 合、乳液聚合( 包括无皂乳液聚合、种了聚合) 、分散聚合等，均可用于磁性高分子微球 的制备。 ( 1 ) 悬浮聚合t s u r u t a 【8 】首先制得了磁流体、单体、引发剂、分散剂的悬浮液，在 搅拌的同时施加低频超声波分散，然后聚合得到粒径范围为o 1 至数十个微米的磁性高 分子微球，其粒径大小随超声波的频率而变化。d a n i e l t g l 等采用微悬浮聚合得到了粒径范 围为0 0 3 “m 一5 “m 的憎水磁性高分子微球，但所得磁性微球中的磁性无机微粒倾向于迁 移至微球的四周。c h a r m o t t l o l 等同样采用微悬浮聚合合成了粒径范围为o 0 5 b t m - - 1 0 p m 的 憎水交联复合磁性微球。在该发明中，磁性微粒集中于复合磁性微球的内部，壳体几乎 不含磁性微粒。 ( 2 ) 乳液聚合乳液聚合是目前应用较多的一种制备磁性高分子微球的方法，它还 包括无皂乳液聚合、种子乳液聚合等方法。s o l c “1 在分散有磁性粒子的水相体系中乳化 单体，得到稳定的乳化体系，然后应用乳液聚合得到了胶体尺寸的疏水磁性高分子微球。 邱广明等【1 2 1 对乳液聚合法进行了改进，采用吸附- 浴胀的方法、得到了单分散性好，具有 良好机械稳定性和耐酸性的磁性高分子微球。 磁性高分子微球在生物医学领域的应用较广，如用作诊断试剂等，但该领域对磁性 高分子微球的要求较高，不仅要求其单分散性好，并且应无非特异性凝聚因素( 如乳化剂 等) 。而乳液聚合制备的磁性高分子微球无法满足这些要求，因此人们又开发了无皂乳液 聚合技术。无皂乳液聚合是指在不含乳化剂或仅含微量乳化剂( 其浓度小于临界胶束浓度 c m c ) 的条件下进行的聚合反应。y a n a s e l l 3 1 等在磁流体存在的条件下，不外加表面活性 剂，制得了磁性聚苯乙烯微球。并详细地讨论了磁流体中的表面活性剂、引发剂用量、 单体、添加剂( c a c l 2 、荧光染料) 等对聚合反应和微球特征的影响。h w e e 等”“1 采用一 步无皂乳液聚合技术，在磁流体存在的条件下，合成出平均粒径为3 0 n m 的磁性高分子 微球，他们发现，用丙烯酸钠( n a a a ) 代替甲基丙烯酸( m a a ) 不但能提高磁性微球的单分 散性，还能提高其表面羧基含量。 ( 3 ) 分散聚合分散聚合是指一种由溶于有机溶剂( 或水) 的单体通过聚合生成不溶 于该溶剂的聚合物，而且形成胶态稳定的分散体系的聚合方式。李孝红等人【”】平0 用分散 聚合法，以水7 , 醇为分散介质，合成了含有c o o h 、- o h 、- c h o 等不同表面功能基的 核一壳型磁性复合胶乳微球，并研究了分散介质、引发剂、聚合单体、种子粒径等因素 对复合微球形成的影响。随后，其课题组还制备出热敏性的磁性聚苯乙烯，a t 一异丙基丙 烯酰胺( p ( s 价4 i p a m ) ) 微球1 6 1 7 。 r i c h r d 等d s 在磁流体、有机溶剂、单体、稳定剂、共稳定剂、引发剂共存的条件下 利用分敬聚合法合成了粒径范围为o 1 岬一5 “m ，磁含量0 5 一5 0 ，粒径分布标准偏 差不大于1 5 的单分散疏水磁性高分子微球。作者认为，为了得到单分散微球，制备过 程中必须满足以下条件：( 1 ) 成核阶段快，所有核应同时形成；( 2 ) 在微球成长的阶段，连 续相中的所有齐聚物自由基在达到临界凝聚尺寸之前必须被体系中已存在的微球所捕 获。以避免形成新的微球：( 3 ) 在微球的成长阶段必须避免微球间彼此的凝聚。 ( 4 ) 辐照聚合张律辉等在磁流体存在的条件下，采用6 0 c 0 7 射线源，于常温下 辐照引发聚合水溶性的丙烯酰胺和烯丙胺，制得了具有良好理化性能的磁性微球，并将 其用于固相放射免疫分析及微量蛋白质亲合富集，收到了较好的效果。 r e m b a u m 等【2 叫开发了一种制备单分散好、纯净度高的磁性高分子微球的“无容器环 境法”( c o n t a i n e r l e s se n v i o r o n m e n t ) 。所谓“无容器环境法”是指与乳液聚合、分数聚合 等方法根比较而言，在制各过程中单体液滴并不与容器壁相接触。其原理是，在一个充 满惰性气体或高真空狭长容器中，喷射分散有磁粉的单体液滴，在单体液滴下落的过程 中，用紫外线或7 射线引发聚合。这是一个简单的一步制备方法，可合成粒径范围为 0 o l 啦n - - l o o g m 的磁性高分子微球。 1 1 - 3 3 活化溶胀法 活化溶胀法( a c t i v a t e d w e l l i n g ) ，也称u g e l s t a d 法，是u g e l s t a d 等1 创立的一种 制备混合结构型单分散超顺磁性聚合物微球的有效方法。u g e l s t a d 法制备磁性聚合物微 球一般包括四个步骤：( 1 ) 采用种子聚合技术制备单分散大孔型聚苯乙烯微球，( 2 ) 对微球 孔内、外进行磺化( 一s o 。) 或硝化( - n o ：) 以使其具有亲水性界面，( 3 ) 浸泡微球于铁盐水溶 液中，在适当的反应条件下使超顺磁性f e 。0 。或y f e 。0 ，在孔内合成，( 4 ) 选用一种含活性 功能基团的单体对微球进行溶胀、聚合、包被，使微球孔道封闭，表面功能化a 重复第 三步操作可以使微球中的磁性颗粒含量达到需要的水平。 用上述方法处理后得到了粒径均匀、悬浮性好的磁微球。该方法和上述方法比较而 言，具有以下几个优势：( 1 ) 因在磁化过程中，单分散聚合物微球的粒径和粒径分布不变， 因此最终所得的磁性高分子微球具有良好的单分散性；( 2 ) 具有超顺磁性的无机微粒均匀 地分散在整个聚合物微球中且每个微球含有相同浓度的磁性微粒，从而保证所有磁性 微球在磁场下具有一致的磁响应性，( 3 ) 可以制备各种粒径的致密或多孔磁性高分予微球 ( 最佳为0 5 岬一2 0 岬) ，且可制备磁含量大于3 0 的高磁含量微球。 u g e l s t a d 法是目前制备磁性聚合物微球最好的方法，用此法制备的磁性聚合物微球 单分散性好，磁性颗粒含量均匀而且可以控制，目前己有商品化产品d y n a b e a d s 出售， f u 是，由于此法的制备过程十分复杂，商品的价格特别昂贵。 1 1 3 4 生物合成法 自然界中存在一些趋磁微生物，它们沿着地球磁力线移动时可以在体内合成生物膜 包被的直径2 0 1 0 0 n m 的超微磁粒体。将其从菌体中分离出来用于固定化酶可以获得很高 的酶活性2 2 1 ，也可连接抗体用于免役检测【2 3 】。细菌磁性粒子具有形状小、均匀、机体造 应性好的特点。生物来源的磁性分离载体由于大规模发酵、培养尚存在一些问题，分离 也比较困难，目前主要应用于分析研究，在靶向药物载体方面的应用前景看好。 1 1 4 磁性高分子微球的表面功能化 磁性载体表面必须含有反应性功能基团，如一o h 、一c h o 、- c o o h 、- c o n h ：、一n h ：等，以 便通过适当的有机化学反应与特异性亲和配基或酶偶联，形成满足各种应用需要的磁性 亲和分离载体。 天然或合成的亲水性有机高分子化合物本身含有丰富的活性功能基团，如多糖 ( 一o h ) 、聚丙烯醛( 一c h o ) 、聚丙烯酸( 一c o o h ) 、聚丙烯酰胺( - c o n h 。) 、聚乙烯亚胺( 一n h 。) 等，它们与磁性颗粒直接复合形成的磁性分离载体不需要功能化。羟基、氨基、环氧基 硅烷包裹的磁性颗粒也含有相应的活性功能基团。 疏水性单体聚合法制备的磁性聚合物微球的表面一般不含功能基团，通常有两种功 能化方法： 种是与含功能基团的亲水性单体共聚法，例如苯乙烯( s t ) 与甲基丙烯酸羟乙酯 ( h e 淞) m 7 、( 甲基) 丙烯酸( m a a a a ) 。”。等单体的共聚可以产生含羟基和羧基的磁性聚合 物微球。研究指出。“，简单的一步共聚法只能使很少数功能基团定位在聚合物微球表面， 而绝大多数功能基团被包埋在微球内部，为了使功能基团定位在微球表面，己提出许多 改进方法，如亲水性单体后加法等，然而并没有获得预期的效果。尽管如此，由于共聚 法简单方便，无须后功能化，在一些对配基偶联效率要求不高的分析检测和实验研究中 仍广泛使用，但对于制备规模的亲和分离来说，配基偶联效率不高会导致分离效率下降。 另一种聚合物微球表面功能化的方法是高分子化学反应，大多数离子交换与吸附树 脂采用这种方法，典型的反应如聚苯乙烯的磺化、硝化、氯甲基化等。”此类反应虽然能 获得高容量的表面活性功能基团，但是。高温强酸性等剧烈反应条件对聚合物微球中磁 性氧化铁的分解限制了这一方法的使用，目前尚未见磁性聚合物微球通过高分予化学反 应来功能化的文献报道。 1 1 5 磁性高分子微球的应用 由于磁性微球粒径小，比表面积大，故而偶联容量大，悬浮稳定性好，便于高效地 与目标产物偶联：又因磁性高分子微球具有磁性，在磁场作用下可定向运动到特定部位， 或迅速从周围介质中分离出来。这些性能使其具有极广阔的应用前景，因而在细胞分离、 靶向制剂、固定化酶、免疫分析、核酸的分离、蛋白质提纯等诸多领域有着广泛的应用 前景。 1 1 5 1 细胞分离 磁性微球作为不溶性载体，在其表面接上具有生物活性的吸附剂或其它配基( 如抗 体、外源凝结素等) 。利用它们与目标细胞的特异性结合，在外加磁场的作用下将细胞分 离分类。 细胞的标记与分离是磁性高分子微球最早的应用研究之一，自7 0 年代以来便有众多 的学者致力于该领域的研究。如，r e m b a u m 等【2 9 l 将磁性聚戊二醛微球标记分离人血红细 胞，可分离除去超过9 5 的采标记细胞；m o l d a y 等将平均粒径为4 0 h m 的磁性微球用 于脾脏细胞中b 细胞的分离。另外，f r i e d l 等应用p o l y c l o n a la n t i - f a b 抗体修饰的磁性 微球成功地对人体c d 4 、c d 8 、c d l 9 、c d 3 4 等细胞进行了分离，分离效率达9 9 9 以 上：br i s g o e 掣3 2 1 利用磁性微球成功地在骨髓移植过程中对骨髓中的t 细胞进行了提纯， 使之应用与进一步的分离、培养、功能研究和流式细胞术等。 1 1 5 2 靶向制荆 磁性药物微球是磁性药物制剂的一种类型，是靶向给药系统的新剂型。在磁性纳米 粒子表面涂覆高分予，再与蛋白质相结合。以这种磁性纳米粒子作为药物的载体，然后 静脉注射到动物体内，在外加磁场下通过纳米微粒的磁性导航使其移向病变部位，就 可达到定向治疗的目的。磁性微球给药载体的特点：( 1 ) 将药物随着载体被吸附到靶区 周围，使靶区很快达到所需浓度，在其它部位分布薰相应减少，因此可以降低给药剂量； ( 2 ) 药物极大部分在局部作用，相对减少了药物对人体正常组织的副作用特别是降低 对肝、脾、肾等造血和排泄系统的损害；( 3 ) 加速产生药效，提高疗效。 w i d d e r 等人p 习制成一种磁性自蛋白微球，使其在外磁场的引导下集中于治疗部位， 缓慢释放药物。实验研究表明，未加磁场控制时，肝脏代谢4 0 ，脾脏代谢4 5 ；施加 磁场控制时，肝脏代谢仅5 ，脾脏代谢l o 。这说明磁控制可减轻化疗药物对脏器的 毒副作用。m i t r a 等人【3 4 1 制成一种磁性微球，在外磁场作用下药物定位于病变区，减轻 了化疗药物对脏器的毒副作用。 1 1 5 3 固定化酶 运用磁性高分子微球作为结合酶的载体，具有以下优点：有利于固定化酶从反应 体系中分离和回收，操作简便。对于双酶反应体系，当一种酶的失活较快时，就可以用 磁性材料来固载另一种酶，回收后反复使用，降低成本：磁性载体固载酶放入磁场稳 定的流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的操作。适合于大规模连续化操作： 利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式， 提高固定化酶的催化效率。m u n k 0 1 3 5 将c e l l u l o s e - - - f e 3 0 4 、p o l y a c r y l a m i d e - - - f e 3 0 4 、 n y l o n - - f e 3 0 4 等磁性微球用于凝乳化蛋白酶的固定，详细考查了不同壳层、不同磁核及 粒径对酶活性及固定量的影响。邱广亮等1 3 q 采用乳化复合技术制得磁性淀粉复合微球， 并以此微球为载体，采用溴化氰共价结合法、戊二醛交联法、物理吸附法固定化a 乙酰 乳酸脱羧酶，并将其用于啤酒发酵具有明显降低双乙酰的效果，而且由于其具有磁性， 可通过施加外磁场方便简单地与酒液分离，而不影内啤酒风味，缩短生产周期，大大降 低成本。 1 1 5 4 免疫分析 研究者利用磁性高分子微球比表面大，易分离，表面可功能化等优点将其用于免疫 测定。利用磁性微球结合的抗原或抗体进行兔疫分析，具有特异性高，分离快、重现性 好等特点，就灵敏性而言，c l a r k 等【3 7 】用抗兔l g g p s 磁性微球对a b 的测定效果增加近 4 0 倍。s o l e 等 3 8 】先将连接有鼠i g g 的磁性微球固定在离子敏感场效应晶体管表面制成流 动注射免疫传感器，再加入朦酶标记的羊抗鼠t g g 抗体和尿素，从而用安培检测法对鼠 l g g 进行测定。 1 1 5 5 核酸的分离 传统的核酸分离技术有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等。如目前实验室纯化质粒 d n a 最常用的啡啶溴红氯化铯密度梯度平衡超离心方法，分析和提纯r n a 和d n a 的 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等，这些纯化方法步骤繁杂、费时长、收率低。 磁性微球分离核酸，是基于碱基a e 对原则，通过偶合与目标核酸碱基互补的一段引物链 而达到分离目标核酸的目的，这种分离方法简单、快速、选择性高。例如，偶合有d n a 碎片的磁性微球可以用作d n a 探针或者序列反应的模板。由于其迅速分离的特性，磁 性微球用来代替传统的亲和色谱法，提纯d n a ，含有双链识别序列的磁性微球，只需通 过三次吸附一解吸循环，在不到l h 的时间内即可从酵母原始溶液中得到均匀的核因子 ( i i i c ) ；含有单链d n a 的磁性微球可用来分离，纯化d n a 和r n a ，单分散键合有多 聚( d t ) 3 6 的磁性微球用来纯化m r n a ，可得到高的产率，同时，其操作处理步骤大为减 少，所用时间也相应缩短。 i 1 5 6 生物传感器 核酸杂交技术是分子生物学研究中最常用和最基本的检测方法之一，因此，围绕该 技术的新方法研究直是人们感兴趣的问题。近年来，随着电子学、微电子学及计算机 技术的发展，相继有一些新的核酸检测方法的建立。杨清娟等呻报道了用戊二醛将氨基 修饰的寡核苷酸探针固定于氨基磁珠表面制成核酸传感器。传感器与生物素标记的d j 蛆 杂交，再利用亲和素一生物素偶合系统，偶联上亲和素标记的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶 催化底物a 一萘酚磷酸酯( a 1 1 4 a t p ) 水解形成具有电化学活性的d 一萘酚，再用示差脉冲伏 1 0 安法测定杂交结果，此法测得短链d n a 片断的浓度线性范围为1 0 一1 0 0 0 u g l ，最低检测限 为3 u g l 。另外。磁性微球还可制成酶传感器“”。 1 2 漆酶的研究进展 漆酶( 1 a c c a s e ) 又称苯二醇：氧氧化还原酶( e c l 1 0 3 2 ) ，是一种含铜的多酚氧化酶， 与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属蓝色多铜氧化酶( b l u e m u l t i c o p p e ro x i d a s e ) 属于同一亚族，在结构和功能上有许多相似之处。它能催化一系 列有机和无机化合物发生一个电子氧化，同时伴随有氧还原成水“。漆酶以氧作为终电 子受体，其作用底物的专一性不强，基本上与对苯二酚( p d i p h e n 0 1 ) 结构相似的化合物 都能被其氧化如多种酚类、胺类及其它金属复合物等。在一定条件下，少数真菌漆酶 还能以单酚( 甲酚) 和抗坏血酸为底物，使其发生氧化反应。 c 4 ，黛球厣戚；鼍簟和摹雒帕髟鹰 图t 潦酶的典型反应：酚类氧化 f i g 1t y p i c a lr e a c t i o no fl a c c a s e ：o x i d a t i o n o fp h e n o l s l2 1 滚酶的分布 1 8 8 3 年日本学者y o s h i d a 首次在日本漆树( r h u sv e r n i c i f e r a ) 树汁中发现漆酶，后来 证实，漆酶除了存在与植物中。还更广泛地存在于真菌中。此后的许多年里，又分别在 细菌“、昆虫“”中检测到了漆酶的存在，而且最近的研究表明，漆酶在细菌中的分布可 能还比较广泛1 。白腐真菌是自然界中最主要的漆酶生产者，约有7 0 种不同来源的白腐 真菌菌株已经被鉴定能产生漆酶，其中绝大部分为担子菌( 约占8 0 6 ) ，其次为子囊菌( 约 1 5 ) - 极少数为半知菌和其他低等真菌( 约4 ) 尚未在酵母菌中发现有内源性漆酶。到 目前为止，仅有7 株细菌被鉴定能合成漆酶样活性蛋白质，且细菌漆酶在理化性质上与真 菌漆酶有较明显差异“。 1 2 z 真菌漆酶的一般理化性质 漆酶一般是由约5 0 0 个氨基酸组成的分子量为5 0 8 0 k d a 的酸性单体蛋白质( 漆树漆 酶为碱性蛋白) ，拥有四个铜原子，等电点p i 值为3 5 4 5 、含糖约1 5 3 0 “，但来自 二孢蘑菇( a g a r i c y u sb i s p o r u s ) 和a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 的漆酶则是由2 个相同亚基构成 的二聚体，其全酶分子量分别为1 0 0 和1 1 0k d a “。“；而禾顶囊壳菌( g a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s ) 和子囊菌( p o d o s p o r aa n s e r i n a ) 漆酶各由3 个和4 个亚基构成，其分子量分别为 1 9 0 和3 9 0 k d a ”3 。铜是真菌漆酶发挥催化作用不可缺少的辅基，漆酶含有4 个铜原予， 根据光谱和磁学特征可将它们分为i 、i i 和i i i 型，其中，i 、i i 型铜各一个，是单电子受 体。i 型铜由于在6 1 4 n m 左右有光吸收，使漆酶呈现“蓝色”；i i 型铜没有可以检测的光 吸收：i i i 型铜两个，是双电子受体，在3 3 0 n m 左右有一宽的吸收峰3 ”。也有一些真菌漆酶 分子中仅检测到2 个铜原子，如来自射脉菌( p h l e b i ar a d i a t a ) 和侧耳菌( p l e u r o t u s f l o r l d a ) 等菌株的漆酶，它们拥有i 、i i 型铜，但缺乏i i i 型铜的信号“2 。8 ”。而在木腐真菌 p h e l l i n u s r i b i s 中，其漆酶拥有1 个铜原- 了，1 个锰原子和2 个锌原子，缺少i 型铜1 。在 p 1 e u r o t u so s t r e a t u s ，其漆酶p o x a i 拥有1 个铜原子，1 个铁原子和2 个锌原子，在4 0 0 n m 有明显吸收峰1 。由于缺少i 型铜，这2 个酶均不能显示漆酶特征的蓝色，而是“白漆酶”。 来自p h l e b i ar a d i a t a 的漆酶由于被木素衍生物“修饰”，则成为“黄漆酶”1 。 不同来源的真菌漆酶在底物专一性、最适反应温度和p h 值以及热稳定性等方面存在 较大差异，其催化反应的动力学常数因所选择底物不同而改变。漆酶作用的底物相当宽 泛，按化学结构不同可将其分成7 类”，包括( 1 ) 酚类及其衍生物：主要为对苯二酚和邻苯 二酚等多元酚及其衍生物。( 2 ) 芳香胺及其衍生物：结构类似于酚类底物，主要为多氨基 苯及其衍生物。( 3 ) 多环芳烃和杂环类化合物：如蒽( a n t h r a c e n e ) 、苊( a c e n a p h t h e n e ) 、 芴( f l u o r e n e ) 及咔唑、n 一乙基咔唑等。( 4 ) 羧酸及其衍生物：一般指在芳环羧酸基的邻位 或对位连有羟基、氨基或烷氧基的芳香酸，碳链上连接有酚或非芳胺基团的非芳香酸， 如原儿茶酸和对香豆酸等。( 5 ) 甾体激素和生物色素，如a 一卵胞激素和雌三醇等。( 6 ) 偶 氮类人工合成色素，如活性橙9 6 ( r e a c t i v eo r a n g e9 6 ) 、活性黑5 ( r e a c t i v eb l a c k5 ) 和活性紫5 ( r e a c t i v ev i o l e t 5 ) 等。( 7 ) 金属有机复合物及其他非酚型底物，如二茂铁及 其衍生物等。人工合成化合物丁香醛连氮( s y r i n g a l d a z i n e ) 和a b t s ( 2 。2 - a z i n o - d i ( 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n es u l f o n i ca c i d ) 是大多数真菌漆酶的最适作用底物，其催化这 两个底物反应的k m 值在微摩尔级。2 ，6 一二甲氧基苯酚、丁香酸和愈创木酚也常用于漆酶 活性测试，是某些真菌漆酶的较适宜作用底物。酶催化愈创木酚氧化的l ( i i l 值则在毫摩尔 级。 漆酶的最适反应温度和最适p h 值随所作用底物和缓冲液不同而变化。报道的大多数 真菌漆酶的最适反应温度通常在4 0 - 5 5 之间，有较好的耐热性能。木素降解真菌 p m l ( b a s i d i o m y c e t ep m lc e c t 2 9 7 1 ) 漆酶i 是热稳定性最好的真菌漆酶，当以愈创木酚为 底物时，该酶的最适反应温度是8 0 。在6 0 条件下保温t 小时，酶活性未见明显减少， 并随着反应温度升高，酶活随之增加”1 。而来自p h a n e r o c h a e t ef l o v i d o a l b a 菌株漆酶 的最适温度在3 0 左右，具有相对较差的热稳定性”。多数真菌漆酶的最适p h 值偏酸性， 在4 0 - 6 o 之间，且在此p h 值范围内稳定性较好。来自担子菌的r i g i d o p o r u sl i g n o s u s 漆酶是少数最适反应p h 值接近中性的漆酶之一“，而来自紧缩斑褶菇菌( p a n a e o l u s p a p i l i o n a c e u s ) 的漆酶使用a b t s 作底物时，测得的最适p h 值是3 0 ：当使用2 ，6 一二甲氧基 苯酚为底物时，酶催化的最适反应p h 值为8 0 3 。 1 2 3 漆酶的应用 1 2 3 1 生物合成 研究表明，漆酶在真菌色素合成中有重要作用，并可能参与菌索的形成，它也能在 细胞间催化酚类化合物的聚合粘连来固定菌丝。人们已经利用漆酶的这种功能进行化工 行业的开发研究。在酶的催化作用下，用制浆废水中的木素为原料可以生产术屑板等产 品，同时也有利于水的净化。还可以根据漆酶的催化特性，设计漆酶参与高分子化合物 合成的过程，漆酶参与了氧化固醇类激素芳香环的过程。该反应依赖于温度、酸碱度、 漆酶浓度和所用有机溶剂的类型，在这种条件下，漆酶的活力可以维持数天，在不大的 反应体积中有很高的转移率 6 2 o 1 2 3 2 造纸工业中的应用 漆酶在造纸工业中的应用包括生物制浆和生物漂白。在降解纸浆中木索的真菌酶系 中，漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶是起主要作用的三种酶，漆酶能够脱甲基和 部分溶解纸浆中的木素。与另两种酶相比，有其自身优点：漆酶更稳定，固定化后能更有 效的发挥作用：不需要过氧化氢的参与；有些漆酶可以组成型产生，且表达量较高；可 以有效的脱氯，从而能达到减少污染，降低能耗，增加纸张强度，提高纸张白度等目的 旧” 1 2 3 3 有毒化合物的生物消除 漆酶可以降解多环芳烃、氯代酚、多氯联苯、二氯苯胺、有机磷杀虫剂、人工合成 染料等化合物。c o l l i n s 等1 证明t r a m e t e sv e r s i c o l o r 漆酶能氧化葸和致癌剂苯并芘， 介体a b t s $ 1 3 培养液中的小分子物质可明显增强这种作用，蒽被氧化的终产物为葸醌。后 来又证明t r a m e t e sv e r s i c o l o r 的漆酶能在体外氧化五氯酚( p c p ) ，从而有效地将其去 除”。最近，a b a d u l i a 等呻1 研究表明固定化漆酶不仅可以对有毒纺织染料进行脱色，而 且还可以对其进行脱毒。a r a i t a i 等时3 首次阐明白腐菌漆酶对有机磷杀虫剂0 ，o - - - 7 基一s 一 ( n ，n 一二异丙胺乙基) 磷酰硫醇( d i p r a m t i o n ) 和神经毒剂0 一乙基一s 一( n ，n - 二异丙 胺乙基) 甲基磷酰硫醇( v x ) 和0 一异丁基一s 一( n ，n - 二异丙胺乙基) 甲基磷酰硫醇( r v x ) 氧化牛物降解的机制。由于这类化合物含有可以抗水解的p s 键，所以用漆酶氧化的方法 降解具有特殊的意义。s c h u l t z 等”最近证明真菌( p y c n o p o r u sc i n n a b ar i n u s ) 漆酶对氯 代羟基联苯还具有脱卤作用。 1 2 3 4 生物检测 漆酶在催化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易被转化为电信号而高灵敏地得到 检测。己有不少漆酶在生物检测中应用的报道，包括免疫检测、生物传感器等。在免疫 检测中，漆酶有望替代辣根过氧化物酶成为新的标记酶，因为它有以下优点：氧气作为第 二底物，不形成非产物型的酶一底物复合物；相比于过氧化物酶，漆酶对介质中不同价 态的金属离子浓度的敏感性较低；无需特殊的仪器和试剂。运用纤维质的d 卧e 一纤维素 固定漆酶制成的高活力稳定的传感器，已用来检测煤炭、石油、天然气、造纸等工业污 水中的木素、酚类等物质”“。而将真菌漆酶吸附在碳上制成固定化酶电极，能有效催化 负极氧化还原，可精确测量浓度在0 2 7 o n u n o l l 范围的多酚、多胺基苯等底物“”。 1 2 3 5 食品工业 在生产实践中，啤酒、果蔬汁等饮料在贮存期间往往出现浑浊或沉淀，这与其中含 有酚或芳胺类物质有很大关系，蛋白质与酚类物质形成的蛋白质一酚类化合物的大分子 聚合物更是目前产生果汁二次混浊的最难控制的因素。利用漆酶氧化处理果汁可专一性 去除酚类，改善果汁的色泽及防止发生混浊，有助于天然果汁的稳定m 1 。并且漆酶酶法 稳定果汁具有显著优点：果汁及浓缩果汁澄清、色浅、稳定；不需用澄清剂及助滤剂： 不需用p v p p ( 聚乙烯毗咯烷酮) 、活性炭及吸附剂处理；污染少，方法简单，易于自动化。 1 3 本实验的目的和意义 磁性高分子微球一般是指内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末而具有磁响应 性的高分子微球，它是近二十年来发展起来的一种新型功能高分子材料。近年来磁性高 分子微球在生物医学( 临床诊断、酶标、靶向药物) 、细胞学( 细胞标记、细胞分离) 及牛物工程( 酶的固定化) 等领域的应用受到越来越广泛的关注。由于具有相当宽泛的底 物专一性和较好的稳定性，漆酶在造纸工业、废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、 牛物传感器构建及食品工业等方面具有重要应用价值。但是，因为环境条件变化而导致 漆酶在使用过程中变性失活，特别是游离酶与反应产物混合在一起，难以实现重复利用 等都限制了漆酶制剂的产业化应用。因此，改善漆酶稳定性，并使酶制荆重复连续使用 显得尤为重要。酶固定化技术是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段。近年来， 国际上对真菌漆酶的固定化进行了较深入研究，国外这方面的研究主要是利用环氧活化 的载体刚多孔玻璃来固定，但以磁性微球作为载体固定化漆酶还未见报道。磁性微球 与其它载体相比，更利于分离和回收，因此磁性微球固定化漆酶对于漆酶的工业化应用 更具现实意义。 本实验采用硫酸铵分级沉淀和凝胶层析等方法分离纯化粗毛栓菌诱变菌株所产的漆 酶，并通过戊二醛交联法将漆酶固定于聚苯乙烯磁性微球上，最后通过比较磁性微球固 定化漆酶和游离漆酶的酶学性质，揭示磁性微球固定化漆酶的优越性。最后将固定化漆 酶应用于苹果汁除酚和染料脱色。 2 材料与方法 2 1 漆酶的分离纯化 2 1 1 材料与试剂 材料：诱变菌株s a h 一1 2 ：粗毛栓菌野生型菌株经紫外光诱变后，经初筛选、复筛选 得到，由四川农业大学生化实验室提供。 主要试剂：a b t s ( s i g m a ) 、考马斯亮蓝g 2 5 0 ( f l u k a 进口分装) 、考马斯亮蓝r 2 5 0 ( f l u k a 进口分装) 、s e p h e d e xg - 7 5 ( s i g m a ) 、丙烯酰胺( s i g m a ) 、甲叉双丙烯酰胺( s i g m a ) 、 t e m e d ( n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺) ( 上海华舜生物有限公司) 、s d s ( s e r v a ) 、牛血清白蛋 白( 上海长阳3 制药厂) 、分子量标准蛋白( 中国科学院上海生物化学所) 、硫酸铵( 成 都科龙化工试剂厂) 等。 2 1 2 仪器 u v 一2 1 0 2 p c s 型紫外可见光光度计( 尤尼柯上海仪器有限公司) 、h g 3 0 3 - 4 型恒温培养 箱( 南京电器三厂) 、y x q s g 4 1 2 8 0 型电热手提压力蒸汽消毒器、b s 一1 0 0 型自动部分收 集器( 上海泸西机电厂) 、d y c z 一2 8 a 型垂电泳仪及胶板装置( 北京六一仪器厂) 、t g l 一1 6 g 高速台式离心机( 上海安亭科学仪器) 、d y y 一1 0 0 0 型稳流压电泳仪( 上海伊利仪器制 造有限公司) 、h h s 型水浴锅( 江苏省医疗器械，一) 、超净工作台( 上海仪器厂) 等。 2 1 3 方法 2 1 3 1 培养基的配制 ( 1 ) p d a 培养基 马铃薯l o o g葡萄糖2 0 9琼b 目l b g 水1 0 0 0 m l ( 2 ) l m ，( 高氮低碳高无机盐) 液体培养基 酒石酸铵l o o m l 葡萄糖( 1 0 ) 5 0 m l大量元素1 5 0 m l 微量元素1 5 0 m lv b - 3 0 m l 双蒸水2 0 m l 大量元素每升含2 0 9 k h z p o t 、1 3 8 9 m g s o 。7 h ：0 、l o g c a c l 2 和0 6 9 n a c l ，微量元素每升 含0 3 5 9 m n s o , h 扣、6 0 m g f e s 0 4 7 1 t 0 、ll o r e g c o c l 2 6 h 2 0 、6 0 m g z n s o “7 h 2 0 、9 5 m g c u s o * 5 h 妇、 6 m g a t k ( s o ) “1 2 h o 、6 m g h 3 8 0 3 和6 m g n a 2 m o o “2 m 0 。 2 1 3 2 菌种的培养 6 斜面菌种的培养：将菌种接种于p d a 斜面培养基上，置于恒温培养箱中2 8 培养6 天， 4 c 保存备用。 平板菌种的培养；将新转接过的菌种从斜面转接至p d a 平板的中央，置于恒温培养箱 中2 8 c 培养6 天，使菌丝长满平板。 2 1 3 3 粗酶液的提取 在i o o m l z 角瓶中装 2 5 m l 的培养液，1 2 1 灭菌3 0 m i n ，在已灭菌的三角瓶中，加入 直径 c m f 4 j 菌片3 个，2 8 。c 恒温培养2 0 d ，收集菌液，真空泵抽滤，的得粗酶液。 2 1 3 4 硫酸铵分级分离：每个离心管中8 m l 粗酶液，在搅拌和冷却条件下缓慢加入固 体硫酸铵，使其饱和度分别为4 0 、4 5 、5 0 7 6 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 ，混匀，4 c 静 置过夜，5 0 0 0 r p m 离l 、3 0 m i n ，测定上清