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硕士论文高纯度茄尼醇的制备与表征 摘要 茄尼醇作为一种重要的医药中间体，是合成医用辅酶q l o 和维生素k 2 的关键原料。 因其碳链较长、合成步骤多而无法进行人工合成，目前主要由烟草提取得到。 本文采用超临界c 0 2 静态、动态、静动结合和二次静态四种萃取方式对烟叶中茄尼 醇进行粗提取，发现二次静态萃取提取效果较好。通过正交实验，考察了第二次静态萃 取的温度、压力、时间和夹带剂用量等因素对茄尼醇提取综合指标的影响。优化工艺条 件为：以9 5 乙醇为夹带剂，液固比为5 0 m l g ，6 0 、4 5 m p a 下萃取1 h 。此条件下茄 尼醇选择性、提取率和转移率依次为3 1 5 9 ，3 8 1 和9 7 6 9 。 实验还采用改进索氏提取法提取茄尼醇粗品。以无水乙醇为提取溶剂，液固比为 3 0 m l g ，7 0 下回流4 h ，茄尼醇选择性、提取率和转移率依次为2 6 0 3 、2 8 4 和7 2 8 2 。 实验表明，与改进索氏提取法相比，超临界c 0 2 二次静态萃取具有显著优势。 以石油醚乙酸乙酯( 4 ：1 ，v v ) 混合溶液为淋洗剂，由含量为3 1 5 9 的茄尼醇粗品 经柱层析分离得到含量为8 5 0 1 的茄尼醇，再经重结晶得到9 8 6 2 的高纯度茄尼醇。 产品结构经瓜、1 hn m r 、1 3 cn m r 和e s i m s 表征，与目标产物3 ，7 ，1 1 ，1 5 ，1 9 ，2 3 ，2 7 ，3 l ，3 5 九甲基2 ，6 ，1 0 ，1 4 ，1 8 ，2 2 ，2 6 ，3 0 ，3 4 _ 三十六烷九烯1 醇的特征相符。 采用超临界c 0 2 二次静态萃取法对烟叶进行粗提取，茄尼醇提取率和转移率均高于 现有方法，工艺条件缓和且对环境友好，可替代传统的热回流提取；采用柱层析重结 晶联合法制备含量 9 8 的高纯度茄尼醇，总收率为1 5 8 ，可为工业放大提供很好的 指导。 关键词：高纯度茄尼醇超临界c 0 2 二次静态萃取柱层析重结晶液相色谱 质谱联用 硕士论文 a b s t r a c t s o l a n e s o l ，a l li m p o r t a n tp h a r m a c e u t i c a li n t e r m e d i a t e ，i st h ek e ys t a r t i n gm a t e r i a lf o r t h e s y n t h e s i so fc o - e n z y m eq 1 0a n dv i t a m i nk d u et ot h er e l a t i v e l yl o n gc h a i na n dm u l t i p l e s t e p si n v o l v e di nt h es y n t h e t i cp r o c e s ss o l a n e s o lw a sn o to b t a i n e df r o ma r t i f i c i a ls y n t h e s i s ， i i l s t e a di t sm a i ns o h i o i st h ee x t r a c t i o nf r o mt o b a c c ol e a v e s i nt h i sd i s s e r t a t i o n , f o u rt y p e so f s u p e r c r i t i c a lf l u i d ( s c f ) c 0 2e x t r a c t i o n ，s t a t i c ，d y n a m i c , b o t hs t a t i ca n dd y n a m i ca n dt w i c es t a t i cm e t h o d sw a sc o m p a r e d ，a n dt h el a s to n ew a ss e l e c t e d t oe x t r a c tc r u d es o l a n e s o lf r o mt o b a c c ol e a v e s o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g nw a su s e dt o i n v e s t i g a t et h ee f f e c t so ft e m p e r a t u r e ，p r e s s u r e ，t i m e ，e n t r a i n e ra n de t c o nt h ea l l - r o u n di n d e x o fe x t r a c t i n gs o l a n e s 0 1 t h eo p e r a t i o np a r a m e t e r so ft h e2 吣s t a t i ce x t r a c t i o nw e r eo p t i m i z e d w i t h9 5 e t h a n o la se n t r a i n e ra n dal i q u o rt om a t e r i a lr a t i oo f5 o m l ge x t r a c t i o na t6 0 ， 4 5 m p a , l h ，t h eh i g h e s ts o l a n e s o le x t r a c t e dc o u l da r r i v e da t3 8 1 w t 州t h3 1 5 9 w t p u r i t y ( 9 7 6 9 e x t r a c t i o nr a t i o ) s o x h l e t se x t r a c t i o nw a si m p r o v e dt oe x t r a c tc r u d es o l a n e s o lf r o mt o b a c c ol e a v e s ，t o o a n h y d r o u se t h a n o lw a su s e da ss o l v e n t ，a n dt h el i q u o rt om a t e r i a lw a ss e ta s3 0 m l g ，a f t e r r e f l u x i n ga t7 0 f o r4 ht h es o l a n e s o ly i e l d ，s e l e c t i v i t ya n de x t r a c t i o nr a t i oc o u l dr e a c ht o 2 6 0 3 w t ，2 8 4 w t a n d7 2 8 2 r e s p e c t i v e l y o b v i o u s l y , s c fc 0 2 t w i c es t a t i ce x t r a c t i o nh a d as u p e r i o rp e r f o r m a n c eo ne x t r a c t i n gs o l a n e s o l 。 c r u d es o l a n e s o lo f31 5 9 w t w a si s o l a t e dw i t hc o l u m nc h r o m o t o g r a p h yu s i n gam i x e d s o l v e n to fp e t r o l e u me t h e r - e t h y la c e t a t e ( 4 ：1 ，v v ) a se l u e u tt oe n h e n c et h es o l a n e s o lp u r i t yt o 8 5 0 1 ，w h i c hw a st h e nf u t h e rp u r i f i e db yr e c r y s t a l l i z a t i o nt oy i e l d9 8 6 2w t s o l a n e s 0 1 t h e p r o d u c tw a sc h a r a c t e r i z e dw i t hi r ，1 hn m r , 1 3 cn m ra n de s i m ss p e c t r o s c o p i ca n a l y s i s a n dt h er e s u l t sw e r ei n9 0 0 da g r e e m e n tw i t h2 ，6 ，1 0 ，1 4 ，18 ，2 2 ，2 6 ，3 0 ，3 4 - h e x a t r i a c o n t a n o n a e n - l o l ，3 ，7 ，1 1 ，1 5 ，1 9 ，2 3 ，2 7 ，3 l ，3 5 - n o n ( z ，z ，z ，z ，z ，z ，e ，e ) - a m e t h y l b yu s i n gs c ft w i c es t a t i ce x t r a t i o nt ot r e a td e f e c t i v et o b a c c ol e a v e sb o t ht h ey i e l da n d e x t r a c t i o nr a t i oo fs o l a n e s o lw e r eh i g h e rt h a nt h ee x i s t i n gm e t h o d s w i t ht h ea d v a n t a g eo f w o r k i n ga tm i l dc o n d i t i o n sa n db e i n ge n v i r o n m e n t a lb e n i g nt h i st e c h n o l o g yc o u l dr e p l a c et h e t r a d i t i o n a lh e a t r e f l u xe x t r a c t i o n ；h i g hp u r i t yo fs o l a n e s o l ( 9 8 o w t ) w a sp r e p a r e db y c o l u m nc h r o m a t o g r a p hc o u p l e dw i mr e c r y s t a l l i z a t i o nw i t hay i e l du pt o1 5 8 t h i sw o r k c o u l dp r o v i d ead i r e c t i o nf o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o n k e yw o r d ：h i 【g l lp u r i t ys o l a n e s o l ，s u p e r c r i t i c a lf l u i dt w i c es t a t i ce x t r a c t i o n ，c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , r e c r y s t a l l i z a t i o n , l c - e s i - m s n 硕士论文 高纯度茄尼醇的制备与表征 图表目录 图1 1 1 茄尼醇的结构式1 图1 2 1 1 索氏提取装置示意图2 图1 4 1 辅酶q l o 的结构式6 图1 4 2 维生素i ( 2 的结构式6 图2 2 3 1 改进提取装置示意图1 0 图2 2 4 1 超临界萃取装置示意图1 1 图2 2 5 1 柱层析实验装置示意图1 3 图3 1 1 本文常用术语及其关系1 6 图3 1 2 1 液固比对提取效果的影响1 7 图3 1 3 1 时间对提取效果的影响1 8 图3 2 4 1 液固比对萃取效果的影响2 3 图3 2 4 2 温度对萃取效果的影响2 4 图3 2 4 3 压力对萃取效果的影响2 5 图3 2 4 4 时间对萃取效果的影响2 6 图3 3 1 1 时间对皂化效果的影响3 0 图3 3 1 2 碱液浓度对皂化效果的影响3 1 图3 3 1 3 温度对皂化效果的影响：3 2 图3 5 1 1 茄尼醇化学结构3 5 图3 5 1 1 定量分析标准曲线。3 6 附图一索氏提取得到粗提物液相色谱图3 8 附图二改进索氏提取得到粗提物液相色谱图3 8 附图三超临界萃取得到浸膏液相色谱图3 9 附图四重结晶得到茄尼醇液相色谱图3 9 附图五产品核磁共振氢谱4 0 附图六产品核磁共振碳谱4 l 附图七产品红外光谱4 2 附图八产品紫外光谱4 3 附图九产品电喷雾质谱图4 3 表2 1 1 实验试剂与仪器8 表2 1 2 实验仪器与装置：9 表2 3 1 1 高效液相色谱条件1 4 。 n i 图表目录 硕士论文 表2 3 2 1 电喷雾质谱条件1 5 表3 1 1 1 不同溶剂对索氏提取茄尼醇效果的影响1 7 表3 1 4 1 传统索氏提取和改进索氏提取实验结果1 9 表3 2 1 1 超临界c 0 2 萃取工艺条件。1 9 表3 2 1 2 原料皂化对萃取结果的影响2 0 表3 2 1 3 超临界c 0 2 萃取工艺条件2 0 表3 2 1 4 不同颗粒原料对萃取结果的影响。2 0 表3 2 2 1 不同超临界c 0 2 萃取方式的萃取条件2 l 表3 2 2 2 不同超临界c 0 2 萃取方式对萃取结果的影响。2 l 表3 2 3 1 超临界c 0 2 萃取工艺条件。2 2 表3 2 3 2 不同夹带剂对萃取结果的影响2 2 表3 2 4 1 超临界c 0 2 萃取工艺条件2 2 表3 2 4 2 超临界c 0 2 萃取工艺条件2 3 表3 2 4 3 超临界c 0 2 萃取工艺条件2 5 表3 2 4 4 超临界c 0 2 萃取工艺条件2 5 表3 2 5 1 正交实验因素与水平选择2 7 表3 2 5 2 超临界c 0 2 第一次静态萃取工艺条件2 7 表3 2 5 3 第二次超临界c 0 2 静态萃取正交实验设计与结果2 8 表3 2 5 4 正交实验数据分析2 8 表3 3 2 1 石油醚与乙酸乙酯体积比对r f 值的影响3 2 表3 3 4 1 丙酮与石油醚体积比对重结晶效果的影响3 2 表3 4 1 1 产品的1 hn m r ( 5 0 0m h z ，c d c l 3 ，t m s ，啪数据3 4 表3 4 1 2 产品的1 3 cn m r ( 5 0 0m h z ，c d c l 3 ，t m s ，8 c ) 数据3 5 表3 5 2 1 保留时间和峰面积的精密度3 6 表3 5 2 2 茄尼醇的回收率3 7 i v 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：年6 肜日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 七夕年歹月哆日 硕士论文 高纯度茄尼醇的制备与表征 1 绪论 1 1 茄尼醇概述 茄尼醇是一种不饱和的聚异戊二烯醇，属三倍半萜醇( t r i s e s q u it e r p e n o i da l c o h 0 1 ) 。 其结构式如图1 1 1 所示，分子式：c 4 5 h 7 4 0 ，分子量：6 3 0 ，学名叫3 , 7 ，1 1 ，1 5 ，1 9 ，2 3 ，2 7 ，3 1 ，3 5 一九甲基- 2 ，6 ，1 0 ，1 4 ，1 8 ，2 2 ，2 6 ，3 0 ，3 4 _ 三十六烷九烯一l 一醇，为蜡状白色固体，熔点4 2 ，溶 于乙醚、丙酮、烃类等有机溶剂，不溶于水，无旋光活性。 一c 小h 2 - - f c h 2 , , , 户, 、h h 1 h 3 c c c 图1 1 1 茄尼醇的结构式 f i g 1 1 is t r u c t u r eo fs o l a n e s o l 茄尼醇作为一种含有烯键的长链萜醇，是合成辅酶q 1 0 和维生素k 2 不可缺少的重要 天然原料1 。3 1 。作为一种天然的脂肪类抗氧剂，添加到食品中可延长其保质期。因具有刺 激心脏功能还可被用来合成心脏病药物。此外，有研究者发现茄尼醇还具有杀菌、消炎 和抗溃疡等功划卅。目前，茄尼醇的主要来源是从烟叶中提取【刀。有报道【8 1 指出，茄尼醇 是一种致癌芳香化合物的前体，从烟叶中提取出茄尼醇，可减少香烟中的这种有害物， 从而降低吸烟者的患癌风险。 国内市场上茄尼醇工业品有两种，一种是褐色膏状物的产品，茄尼醇含量1 5 ， 常称为茄尼醇浸膏；另一种是白色或黄色粉末状产品，茄尼醇含量 1 7 5 ，常称为茄尼 醇精品。高纯度茄尼醇是指茄尼醇的含量高于9 0 的白色蜡状固体，溶点为4 1 5 4 2 5 。 1 2 茄尼醇提取研究现状 文献报道的茄尼醇粗提方法主要有溶剂热回流提取、超声辅助萃取、微波辅助萃取 和超临界流体萃取法等，粗品提纯主要采用柱层析法。 1 2 1 溶剂提取法 溶剂提取法又称溶剂萃取法，根据被萃取对象的不同可分为液液萃取和液固萃 取。液固萃取又可分为索氏提取、超声辅助提取和微波辅助提取等。 目的溶质容易被提取时，一般采用一次提取，即在回流装置中加入固体混合物和溶 l 高纯度茄尼醇的制备与表征 硕十论文 剂，加热回流一段时间后停止，将混合物过滤后收集滤液，完成一次提取。当目的溶质 不易被提取时，须采用多次萃取。多次提取常使用索氏提取器( s o x h l e te x t r a c t o r ，见图 1 2 1 1 ) ，它是利用溶剂的回流和虹吸原理，对固体混合物中目的溶质进行连续提取。当 提取筒中回流下的溶剂液面超过索氏提取器的虹吸管时，提取筒中的溶剂流回圆底烧瓶 内，即发生虹吸。随温度升高，再次回流开始，每次虹吸前，固体物质都能被纯的热溶 剂所萃取，溶剂反复利用，缩短了提取时间，萃取效率较高。 张德玉【9 】研究了从废烟叶中用正己烷和溶剂油提取茄尼醇的工艺，并取得了专利。 在国内已利用该工艺建立了一些工厂，用烟叶生产出含量为1 6 的茄尼醇粗品。 1 铁架台2 加热包3 力热烧瓶4 索式提取器5 斡凝器进水口 6 冷凝器7 冷凝器出水口 图1 2 1 1 索氏提取装置示意图 f i g 1 2 1 1e x p e r i m e n t a la p p a r a t u so fs o x h l c te x t r a c t i o n 1 2 2 超声辅助萃取法 超声波萃取( u l t r a s o u n d e x t r a c t i o n ，u e ) ，亦称为超声波辅助萃取，是利用超声波辐 射压强产生的强烈空化效应、扰动效应、高加速度、击碎和搅拌作用等多级效应，增大 物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的 进行。早在2 0 世纪5 0 年代，人们就把超声波用于提取花生油、啤酒花中的苦味素和鱼 组织中的鱼油等。目前，超声波萃取技术已广泛用于食品、药物、工业原材料和农业环 境等样品中有机组分或无机组分的分离和提取。 张泽生【i o 】提出超声波辅助溶剂萃取法提取烟叶中的茄尼醇。最优工艺条件为：以丙 酮为提取溶剂，料液比1 ：1 7 5 9 m l ，温度6 0 c ，浸提2 h ，超声波功率1 6 0 w 。此条件下 茄尼醇转移率为9 4 7 。 2 硕士论文高纯度茄尼醇的制备与表征 1 2 3 微波辅助萃取法 微波辅助萃取( m i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n ，简称m a e ) 从2 0 世纪8 0 年代起被 用于从土壤、种子、食品和饲料中萃取各种类型化合物。该方法具有选择性高、操作时 间短、溶剂用量少等特点，但是微波产生的瞬时高温易对热敏性物质具有破坏作用，且 微波萃取过程中的温度和压力的监测控制技术还有待改进。 中科院h u a - y i n gz h o u 和c h u n z h a ol i u 6 】提出用微波辅助萃取烟叶中茄尼醇。在 o 0 5 m 的n a o h 溶液为溶剂条件下，微波萃取的茄尼醇收率为0 9 1 ( 茄尼醇质量烟叶 质量) 。 1 2 4 超i l 缶界流体萃取法 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n , 简称s f e ) 技术【i l , 1 2 是在2 0 世纪6 0 年代逐渐发展起来的一种新型分离技术。该技术是利用处于超临界状态的流体对溶质具 有特殊溶解能力的特性而发展起来的一种对环境友好的、高效的、新型的分离技术。s f e 条件温和，溶剂与产品分离完全，时间短，步骤少。特别是近年来超临界c 0 2 萃取技术 在天然植物药用有效成分提取应用中的发展愈来愈受到人们的关注。 1 2 2 1 超临界萃取的优点 超临界流体萃取法最为显著的优点体现在两方面：一是萃取能力取决于流体的密 度，很容易通过调节温度与压力加以控制；二是操作温度低，能较完好地保存其中的有 效成分不被破坏，特别适合于那些对热敏感、容易氧化分解成分的提取。 1 2 2 2 超临界流体的选择 超临界流体通常根据目的溶质的极性来选择，一般有二氧化碳、乙烷、甲醇等，其 中以二氧化碳最为常见。当二氧化碳处于临界状态( 温度3 l ，压力7 3 m p a ) 以上时 即为超i 临界流体。超临界状态下的c 0 2 流体兼有气体的扩散性和液体的强溶解能力，萃 取效率高、时间短。此外，二氧化碳无毒、无味、不易燃、不爆炸、价格低且可回收循 环利用，萃取出的产品具有纯度高、无溶剂残留等优点。最近十几年，该技术在食品、 医药、香料等天然物质的提取分离方面的应用越来越得到科研人员的重视。 1 2 2 3 超临界萃取夹带剂的选择 夹带剂对超临界流体萃取效果影响显著。它可以从两个方面影响溶质在超临界流体 中的溶解度和选择性，一是溶剂的密度，二是溶质与夹带剂分子间的相互作用。少量夹 带剂的加入对溶剂流体的密度影响不是很大，增大目的溶质溶解度和改善选择性的关键 因素是夹带剂与溶质分子间的范德华作用力或特定的分子间作用，如形成氢键及其它化 学作用力等。 夹带剂与溶质的相互作用类似于液液萃取过程萃取剂与溶质之间的作用规律，其 选择也可从溶解度参数、i 上v , d s 酸碱解离常数等方面来考虑。另外，为了增大脱附和溶 高纯度茄尼醇的制备与表征硕士论文 解这两大控制步骤的速率，夹带剂对基体活性位的覆盖及对基体的溶胀作用也是需要重 点考虑的因素。 所以，夹带剂的选择应综合考虑两个因素，一是在萃取段夹带剂和溶质的相互作用 情况，二是在分离段夹带剂与超临界流体的相互作用及与溶质的分离难易程度。目前， 夹带剂选择主要以实验考察为主，一般选择对目的溶质溶解度较大且不太影响后续产物 分离分析过程的溶剂作为夹带剂。此外，根据体系的需要，还可使用一定组成和配比的 混合夹带剂，这样效果可能会更佳。 超临界c o ：流体萃取烟叶中茄尼醇的文献报道【1 3 j5 】已有很多，但实现工业化生产的 很少。印度的r a g h u n a t hr a o 和j o n n a l a g a d d a 1 6 在1 7 5 b a r 压力，6 0 c 下用超临界c 0 2 流 体萃取烟叶中茄尼醇，得到含量介于4 0 - - 4 3 之间的茄尼醇粗品，再用异丙醇、甲醇、 正己烷和丙酮等溶剂精制得到含量介于9 0 - 9 5 之间的高纯茄尼醇。葡萄牙的a l e j a n d r o r u i z r o d r i g u e z 和m a f i a r o s a r i ob r o n z e 1 7 】等发现，超临界c 0 2 流体萃取烟叶中茄尼醇的 同时，也会将烟碱一并萃取出来。为当萃取温度和压力分别控制在2 5 6 0 和8 2 5 m p a 范围内时，茄尼醇和烟碱收率之比在1 8 - 4 之间，平均收率为1 8 8 ( 茄尼醇质量烟叶 提取物质量) 。四川大学的w 缸h u a n g ，z h e n s h a nl i t l 8 】等采用超临界c o ：流体萃取烟叶中 茄尼醇，以无水乙醇为夹带剂，在4 7 3 6 m p a 下萃取2 6 h ，得到含茄尼醇5 2 3 的粗提 物，茄尼醇的提取率和转移率分别为3 7 4 和9 6 8 。 张海波等【1 9 】研究了超临界c o ：萃取烟叶中茄尼醇的条件，发现萃取压力是主要影 响因素，其次为夹带剂( 7 5 乙醇) 用量、萃取温度和c 0 2 流量，其较佳萃取条件为： 萃取压力2 0 m p a ，萃取温度4 0 c ，7 5 7 , 醇用量为1 5 m o l g 烟叶，c 0 2 流量2 0 k g h ，在 此条件下茄尼醇的转移率达7 9 以上。 1 2 5 其他粗提方法 东北林业大学c h u n j i a nz h a o ，y u a n g a n gz u 2 0 】等采用鼓泡塔提取烟叶中茄尼醇。优化 条件为：以8 0 乙醇为溶剂，液固比为1 3 m l g ，空气流速为7 5 1 m i n 。在取得相同收率 前提下，溶剂浸提法需2 4 h ，索氏提取需6 h ，鼓泡塔提取只需要5 4 m i n 。虽然此法提取 耗时短，但溶剂用量大，设备稳定性差。 1 2 6 柱层析提纯法 柱层析法又称凝胶渗透层析法，是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析 技术。该法通常以粗产品为原料提纯得到高纯度产品。当溶质分子大小不同的样品溶液 通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就 会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒外，因受到的阻滞 作用小而先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络内部洗脱流程长，因所受到的阻滞 作用大而后流出层析床，从而实现分离目的。 4 硕士论文高纯度茄尼醇的制备与表征 印度的u p a r e ，a b h a y 2 1 】等采用硅胶柱层析结晶法，由7 5 的茄尼醇制备9 0 的高 纯度茄尼醇，转移率为8 1 。浙江大学d e s o n gt a n g 2 等以石油醚为溶剂热回流2 h 粗 提烟叶中茄尼醇，再将粗提物用硅胶柱层析提纯，洗脱液为石油醚丙酮( 9 0 ：1 0 ，v v ) 混 合溶液，得到含量为8 3 0 4 的茄尼醇，提取收率为0 3 8 。 1 2 7 其他提纯方法 浙江工商大学y a n gz h a o 4 】等采用低速旋转逆流色谱( s l o wr o t a r yc o u n t e r - c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y ，s r c c c ) 法提纯茄尼醇，此法核心设备为直径5 7 1 m 【n ，容积1 1 0 0 m l 的 聚四佛乙烯盘管。以葵花仔油乙醇混合溶液为溶剂，从含量为1 5 的烟叶粗提物中提 纯提纯得到含量为2 6 8 的茄尼醇，收率为5 0 。 1 3 茄尼醇检测方法 茄尼醇分子量较大，具有一定的极性，根据其分子特性，可采用薄层色谱、库仑分 析仪和高效液相色谱等仪器对其进行定量分析。 1 3 1 薄层色谱法 薄层色谱法( t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 又称薄层层析，属色谱法的一种， 是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。作为一种微量、快速而简单 的色谱法，薄层色谱法兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面，它适用于少量样品的分 离：另一方面，可用来精制样品。若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条 线，可分离多达5 0 0 m g 的样品。因此该方法特别适用于挥发性较小或受热易发生变化而 不能用气相色谱分析的物质。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点 的逐步消失来判断反应是否完成。溶质在固定相上由原点移动至斑点中心的距离与展开 剂由原点移动至前沿的距离之比，称为比移值，用r f 表示，r f 值越大，表明展开剂的分 离效果越好。 薄层色谱法一般用作定性检测分析，特别是对于某些需要避免杂质干扰的检测方 法，薄层色谱法是很好的预分离手段。于华忠【2 2 】等采用t l c 法测定了烟叶中茄尼醇的含 量，方法简便快捷、重复性好。 1 3 2 库仑分析法 库仑分析法( c o u l o m b sa n a l y s i sm e t h o d ，c a m ) 是在电解分析法基础上发展起来的 一种分析方法。它通过测量被测物质在电解过程中所消耗的电量来求得物质的含量。库 仑分析中，电流效率必须1 0 0 ，没有其它的副反应和次级反应发生。茄尼醇是不饱和 醇，能与溴发生加成反应，因而可以采用库仑分析法检测提取物中茄尼醇的含量。库仑 分析法在检测精度上与高效液相色谱相当，但必须先将其它杂质与茄尼醇分离，防止对 5 高纯度茄尼醇的制备与表征硕士论文 检测过程产生干扰，影响检测精度。但库仑分析法检测步骤多，操作麻烦。刘快之【冽 等提出了薄层分离库仑滴定法。 1 3 3 高效液相色谱法 有国外文献报道用气相色谱法测定烟草中茄尼醇的含量【2 4 2 5 1 ，但茄尼醇沸点大于 3 0 0 c ，需要用耐高温色谱柱，条件较为苛刻，不易推广。国内研究人员通常用高效液相 色谱法检测茄尼醇，流动相主要为：正己烷一乙醚、正己烷一异丙醇和正己烷一异丙醚一乙 酸乙酯等，并采用紫外检测器或示差检测器。张明时等【2 6 1 和孙心齐等【2 7 】提出了高效液相 色谱法，武永昆【2 8 1 等提出了反相高效液相色谱法。但有报道【2 9 】指出，茄尼醇在液相色谱 紫外和示差检测器下稳定性较差。 此外，李烈3 0 】等还提出用硅胶高效薄层双波长扫描法对茄尼醇进行定量分析。 1 4 茄尼醇结构表征 对茄尼醇分子结构进行表征的手段主要有红外光谱、紫外光谱、核磁共振波谱和电 喷雾质谱等。张振等【3 2 1 提出用核磁共振法，尹国盛掣3 1 1 提出用红外和拉曼光谱法对茄尼 醇结构进行表征。葡萄牙a l e j a n d r or u i z r o d r i g u e zt 1 7 】等采用g c m s 法对茄尼醇进行结 构确证和定量分析。印度的r n a g e s w a r ar a o 8 1 等采用f t - i r , e s i m s ，1 hn m r 和1 3 c n m r 表征茄尼醇结构。 1 5 课题研究目的及意义 茄尼醇是一种重要的医药中间体，可用于合成医用辅酶q 1 0 ( 结构见图1 4 1 ) 和维 生素k 2 ( 结构见图1 4 2 ) ，因其具有抗氧化功能，还可用作天然的食品添加剂。此外， 在烟草中提取利用价值很高的茄尼醇同时，也降低了香烟中潜在的有毒物质含量，提高 了对吸烟者的安全保护，具有一箭双雕之效果。 m e o m e o o h 图1 4 1 辅酶q l o 的结构式 f i g 1 4 1s n u c t u r eo f u b i q u i n o n eq , o o h 图1 4 2 维生素k 2 的结构式 f i g 1 4 2s t r u c t u r eo f v i t a m i nk 2 辅酶q 1 0 在医药、保健和化妆品领域中应用十分广泛。在医药领域中被用于治疗心 脑血管疾病、病毒性肝炎、十二指肠溃疡和减轻癌症病人化疗副作用等；在保健品领域， 6 硕士论文高纯度茄尼醇的制备与表征 被用于预防多种疾病和减缓衰老等，是一种在欧美国家非常流行的保健品；在化妆品领 域，被用于祛斑除皱、防止肌肤老化等，是高档化妆品的原料。 高纯度茄尼醇是生产辅酶q l o 的关键原料。日本率先从烟叶中提取茄尼醇，进而以 工业化的半合成法制造辅酶q 1 0 ，控制着目前辅酶q 1 0 产品数十亿美元的市场。高纯度 茄尼醇生产技术被日本垄断十多年，至今未公开。国内在高纯度茄尼醇提取技术上与国 外相比尚有差距，且低纯度与高纯度茄尼醇差价很大。日本每年从我国进口数百吨低纯 度茄尼醇产品( 含量1 7 ) 进行二次提纯，又将高纯度茄尼醇产品( 含量7 5 ) 返 销给我国。据统计，我国3 0 余家生产辅酶q 1 0 胶囊的制药厂，其辅酶q l o 原料全部依 赖日本进口。 美国f d a 于2 0 0 4 年3 月份将辅酶q 1 0 的建议用量提高了四倍，使本来就供不应求 的辅酶q l o 市场更加紧俏。在这种国际背景下，我国云南、山东、贵州、四川等地纷纷 上马高纯度茄尼醇项目，然丽投产后发现由于技术不过关，产品无法达到含量9 0 的质 量标准，或者生产成本过高而使企业亏损，个别企业最终选择放弃。目前，国内能够生 产9 0 茄尼醇的企业寥寥无几。 所以，研究以烟草为原料制备高纯度茄尼醇，并能实现工业化生产的工艺路线和方 法，打破国外技术封锁，具有非常重要的现实意义。 1 6 课题研究的内容和方法 本课题拟对改进索氏提取和超临界c 0 2 流体萃取对烟叶中茄尼醇的粗提效果进行 对比，确定合适的粗提方法，再以粗提物为原料制备高纯度茄尼醇，重点考察超临界 c 0 2 二次静态萃取工艺。以由茄尼醇提取率和选择性计算得到的提取综合指标为函数， 设计正交实验对萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂用量等工艺条件进行筛选，确 定优化条件。同时还拟对制备高纯度茄尼醇的关键步骤柱层析联合重结晶工艺条件 进行考察，对高纯产品结构进行了表征，并建立茄尼醇检测方法。 1 7 课题研究的创新性 实验采用超临界c 0 2 二次静态萃取工艺对烟叶中茄尼醇进行粗提，所得粗品中茄尼 醇含量以及茄尼醇的提取率和转移率均高于其他方法。此外，利用l c e s i m s 建立茄 尼醇检测方法，该方法精密度高，回收率良好。 7 高纯度茄尼醇的制备与表征 硕士论文 2 实验部分 2 1 实验原料、试剂及仪器装置 表2 1 1 实验原料及试剂 t a b l e 2 i 1e x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 8 硕士论文高纯度茄尼醇的制各与表征 表2 1 2 实验仪器 t a b l e 2 1 2e x p e r i m e n t a la p p a r a t u s 2 2 实验过程 2 2 1 原料预处理 2 2 1 1 原料破碎 将原料烟叶粉碎过筛，得至u 2 0 - - 4 0 目、4 0 - - 6 0 目、6 0 - - 8 0 和8 0 - - - 1 0 0 目烟叶颗粒，分别 在6 0 真空干燥箱中干燥1 2 h 后，装入样品袋中密封待用。 2 2 1 2 原料皂化 称取1 5 o g4 晰o 目的烟叶置于2 5 0 m l 烧杯中，加入1 0 0 m l 去离子水，室温搅拌 2 h ，抽滤，往滤渣中加入醇碱溶液( 4 9 n a o h ，1 0 0 m l 乙醇) ，6 0 下搅拌皂化3 h 。用 醋酸调节p h 至中性后抽滤，滤渣水洗后6 0 干燥6 h 。 2 2 2 原料中茄尼醇含量测定 参照中国药典，取2 0 9 左右干烟叶研磨成2 0 0 目，称取3 份，每份5 0 8 9 ，分别 加入1 0 0 m l 无水乙醇浸泡2 4 h ，超声2 h 后过滤，将三份滤液作为供试品。为确保实验 结果的准确性，取三份样品的平均值为原料烟叶中茄尼醇含量。通过液相色谱质谱联 用仪，用外标法测得本批次烟叶中茄尼醇质量含量为3 9 0 。 2 2 3 改进索氏提取过程 改进索氏提取装置( 见图2 2 3 1 ) 是在提取器内装上磁力搅拌，使固体原料与溶剂 9 高纯度茄尼醇的制备与表征硕士论文 充分接触，提高烟叶组织内外的浓度差，增加浸提液通过毛细管流到溶媒中的速率，提 高了萃取效率。实验操作步骤如下： 1 )在分析天平上精密称取1 5 o g 原料放入2 原料烧瓶中； 2 )按图2 1 1 1 所示安装连续逆流提取装置；在6 直管和5 弯管处缠上加热带； 3 )量取6 0 0 m l 溶剂加入2 原料瓶中； 4 )溶剂溢流进入7 提取液收集瓶，往瓶中放入沸石，接通冷却水； 5 )开启8 力热套电源，开始加热烧瓶中的溶剂；同时开启磁力搅拌； 6 )当烧瓶中溶剂开始沸腾后，调节加热温度，控制回流液滴速，冷凝液与固体萃 取物料接触，实现液固萃取操作； 7 ) 萃取达到设定时间后，关闭加热套电源，继续通冷却水； 8 )待系统完全冷却后，关闭冷凝器冷却水，取出沸石，将烧瓶和提取器中萃取液 抽滤，将滤液旋转蒸发脱去溶剂得到浸膏； 9 )将浸膏称重，并进行分析检测，处理实验数据。 4 3 2 1 1 电磁搅拌仪2 原料瓶3 提取器4 - 冷凝管5 弯头 6 - 直管7 提取液收集瓶8 加热套9 铁架台 图2 2 3 1 改进索氏提取装置示意图 f i g 2 2 3 1e x p e r i m e n t a la p p a r a t u so fi m p r o v e ds o x h l e te x t r a c t i o n 2 2 4 超临界c 0 2 流体萃取过程 超临界c 0 2 流体萃取方式有多种，基本分为静态萃取、动态萃取、静动结合萃取和 多次静态萃取四种方式。静态萃取在萃取体系达到一定的压力和温度后，开启夹带剂输 送泵，将计算量夹带剂输入萃取釜后将泵关闭，一段时间后打开萃取釜后阀门，c 0 2 从 萃取釜流出时变为气体，同时溶解在其中的产品也将析出；动态萃取是将整个萃取体系 保持在一定的压力和温度下，开启夹带剂泵并打开萃取釜后阀门，一开始就有萃取物流 1 0 硕 ：论文高纯度茄尼醇的制各与表征 出，萃取过程是个动态过程：静动结合是将前两种方式结合起来，通常是先静态再动态； 多次静态萃取通常是二次静态萃取。 超临界c 0 2 流体二次静态萃取分为两步，第一步的静态萃取不加夹带剂，主要利用 烟叶组织中的空气受到压缩，保持定时间后突然减压，此时释放出的强大力量冲破植 物细胞壁，撕裂植物组织，使烟叶结构疏松。在此基础上再进行第二步的萃取，溶剂更 易渗入烟叶组织内部，大幅度增加接触面积，利于溶剂在烟叶颗粒内部运动和输送，从 而改善萃取效果。 2 6 卜液态c