（测试计量技术及仪器专业论文）毛细管电泳芯片电动进样的研究.pdf

摘要 毛细管电泳芯片是生物芯片研究领域的一个童要分支，是一种新兴的微量分析装置， 它具有高效、快速、试样用量少等优点。在利用毛细管电泳芯片进行化学分析时，电动 进样是重要的操作步骤之，它将直接影响后面的分离效果。电动进样时，芯片的微沟 道结构将产生复杂的电场分布，而电场分布决定内部样品及缓冲液的流动模式，并最终 影响样品的分离效果。本文首先通过建立数学模型进行计算，对直线型沟道中电动进样 速度轮廓进行了研究，并利用计算机辅助绘图得到平流界面的结论；然后建立数学模型 并采用有限差分法对十字型和双t 型沟道内的电势进行了数值计算，并且得到了电场分 布结果。本文的计算机程序使用方便，只要输入各个端口电压值，可以立刻得到微沟道 内电场分布图，这样在改变电压的时候可以预知微沟道内的电场分布，为减少盲目实验 提供了有价值的参考数据。通过改变电压，分析了不同进样和分离的电压组合结果。最 后通过进行实验来研究电压对进样情况的影响，验证了本文计算方法的正确性。 关键词：毛细管电泳芯片：电动进样；电场分布 a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p t h a t p e r f o r m s c h e m i c a la n db i o c h e m i c a l a n a l y s i s p r o c e d u r e si sa l li m p o r t a n t b r a n c ho f b i o c h i p i th a ss e v e r a la d v a n t a g e ss u c ha sh i g he f f i c i e n c y ， f a s ts e p a r a t i o na n dc o n s u m i n gal i t t l ea m o u n to fs a m p l ea n dr e a g e n t i no r d e rt oc a r r yo u ta n e x p e r i m e n t a lp r o t o c o l ，s a m p l ea n dr e a g e n ta r eg u i d e dt h r o u g ha l la p p r o p r i a t e l yd e s i g n e d m i c r of l u i d i cn e t w o r k e l e c t r o k i n e t i c t r a n s p o r t a t i o n i so n eo ft h e i m p o r t a n ts a m p l e m a n i p u l a t i o n ss t e p si nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p 、a sf o re l e c t r o k i n e t i ct r a n s p o r t a t i o n t h e c o m p l i c a t e dg e o m e t r i e so f m i c r oc h a n n e lm a yc a u s ec o m p l i c a t e de l e c t r i cf i e l dd i s t r i b u t i o n i t i se l e c t r i cf i e l dt h a td e t e r m i n e sl i q u i df l o w , a n di tw i l la f f e c ts a m p l es e p a r a t i o ne f f i c i e n c y t h e e l e c t r o o s m o t i cf l o wi sd r i v e na l o n gt h ed i r e c t i o no fe l e c t r i cf i e l dp o w e tf i r s t l y , t h ev e l o c i t y p r o f i l eo f e l e c t r o o s m o t i cf l o wi ns t r a i g h tc h a n n e li so b t m n e db yc o m p u t a t i o na n dc o m p u t e r p l o t s e c o n d l y , m a t h e m a t i c sm o d e l i sd e s i g n e d b yu s i n gf i n i t e d i f f e r e n c ea l g o r i t h m s ，e x t e r n a l p o t e n t i a lf i e l dd i s t r i b u t i n g c u r v ei nm i c r oc h a n n e li so b t a i n e di nt h i s p a p e r t h ec o m p u t e r c o d ei sb o t hf l e x i b l ea n dh i g h l ye f f i c i e n ts ot h a tt h ee x t e r n a lv o l t a g ec a nb ee a s i l yc h a n g e d t w of u n d a m e n t a lm i c r oc h a n n e ls t r u c t u r e s ，ac r o s sa n dad o u b l e - la r eo fp a r t i c u l a ri n t e r e s t e x t e r n a le l e c t r i cp o t e n t i a lf i e l dd i s t r i b u t i o ni sa n a l y z e da tt h et i m eo fi n j e c t i o na n ds e p a r a t i o n ， a n da p r i o rk n o w l e d g e o f l i q u i df l o wm o d e c a nb eg a i n e d a tl a s t ，e x p e r i m e n t sa r ep e r f o r m e d t or e s e a r c hh o wt h ee x t e r n a l v o l t a g ei m p a c t s o ns a m p l e i n j e c t i o n ，a n d t h er e s u l t so f e x p e r i m e n t sa c c o r dw i t h t h et h e o r yc o m p u t a t i o n k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i sc h i p ；e l e e t r o k i n e t i ei n j e c t i o n ； e l e c t r i cf i e l dd i s t r i b u t i o n 2 毛细管电泳芯片电动进样的研究 1 绪论 1 1 生物芯片的概念提出与发展 “生物芯片”一词在国际上首次出现是在8 0 年代初，形象地把微电子集成电 路技术与生物活性分子功能相结合，提出构建具有生物活性的微功能单元，进行 信息的获取、贮存、处理和传输，达到仿生信息处理的目的。9 0 年代以来，在美 国硅谷又兴起了研究和开发“生物芯片”的热潮。这个时期的生物芯片主要指通 过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细 胞、蛋白质、核酸以及其它生物化学组分的准确、快速、大信息量的检测。基因 芯片是重要的一种生物芯片，芯片上集成的成千上万的网络状密集排列的基因探 针，能够在同一时间内分析大量的基因，使人们可迅速地读取生命的篇章，准确 生物芯片 子与生物 子电子器件 生物检测 分析芯片 d n a 探针阵列型 生物芯片 毛细管电溅型 生物芯片 图卜1 ：生物芯片的主要类型 f i g u r e l l ：k i n d so fb i o c h i p 高效地破译遗传密码。这将是继 大规模集成电路之后的又次具 有深远意义的科学技术革命。 广义上生物芯片可以分为 二大类：生物电子器件和生物分 析微芯片。如图1 1 所示，前者 可以制备成分子开关、分子贮存 器、分子导线，可实现高速信息 处理、能量转换、高密度信息存 贮以及仿生信息处理等功能。 而后者通过微电子加工技术，在 芯片上制造微型流体分析系统， 实现对细胞、蛋白质、基因以及 生物参数的准确、快速、大规模 测量，实现生物分析系统的微型 兰圉l | | 一 毛细管电泳芯片电动进样的研究 化和芯片化，又称之为芯片实验室( l a b o nac h i p ) 。 本文下面所谈到的生物芯片都是指生物检测分析微芯片。 1 9 9 1 年a f f y m a x 公司f o d o r 领导的小组对原位合成制备的d n a 芯片作了首 次报道1 2j 。他们将光刻技术与光化学合成技术相结合制作了检测多肽和寡聚核苷 酸的微阵列( m i c r o a r r a y ) 芯片，用该方法制作的d n a 芯片可用于药理基因组研究 与基因重复测序工作，这一突破性的进展使生物芯片技术在世界范围内开始得到 重视。随着近些年来各种技术的进步，生物芯片的应用范围不断扩大。科学家们 采用微电子工业及其他相关行业的各种微加工技术在硅、玻璃、塑料等基质材料 上加工制作了各种生物芯片，其加工制作采用了集成电路制作过程中半导体光刻 加工的缩微技术，将生命科学中许多不连续的化学分析过程( 如样品制备、化学 反应和检测等步骤) 移植到芯片中并使其连续化和微型化，这与当年将房屋大小 的计算机缩微到现在只有书本大小的笔记本计算机有异曲同工之效，这种基于微 加工技术发展起来的生物芯片，可以把成千上万乃至几十万个生命信息集成在一 个很小的芯片上，对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析，用这些生物芯片所 制作的各种不同用途的生化分析仪和传统仪器相比较具有体积小、重量轻、成本 低、便于携带、防污染、分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸 多优点。目前生物芯片已不再局限于基因序列测定和功能分析这样的应用，新派 生的一批技术包括：芯片核酸扩增技术1 3 】、芯片细胞分析技术【4 】以及采用芯片作 平台的高通量药物筛选技术【5 等。这类仪器的出现将为生命科学研究、疾病诊断 和治疗、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品卫生监督、航空航天等领域 带来一场革命。 目前，世界上普遍认为2 l 世纪将是生命科学的世纪，生物芯片将像计算机 芯片一样成为2 l 世纪即将来临的又一次新兴技术革命的奠基石。2 1 世纪，生物芯 片将进入家庭，并广泛地应用于生命科学研究的各个领域。生物芯片技术是项 综合性的高新技术，它涉及生物、化学、医学、物理、材料、微电子技术、生物 信息、精密仪器等领域，是一个学科交叉性很强的研究领域。经过近十年多的不 懈努力，生物芯片技术已开始从不成熟逐步走向成熟，并已开始对生命科学研究 的许多领域开始带来冲击甚至是革命。美国商界权威刊物f o r t u n e l 6 l 在1 9 9 7 年3 月刊中有这样一段话：“微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变，给 人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的 2 毛细管电泳芯片电动进样的研究 影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世 界的面貌”。 1 2 生物检测分析芯片的分类 根据检测方法的不同，生物检测分析芯片被分为两类，即毛细管电泳型生物 芯片和dna 探针阵列型生物芯片。 d n a 探针阵列是把寡核苷酸探针以一定的次序固定在硅、玻璃等基体表面 构建二维的探针阵列。与待测d n a 进行杂交反应，冲洗去非特异性的d n a ，然 后检测在哪些位点上有杂交信号，再通过一定的算法就可以得到待测的dna 序 列。一般有合成探针后再放置到基体上的离片合成法，如应用平板照相印刷术 ( p h o t 0 1 i t h o g r a p h y ) 以及直接在基体上制备探针的在片合成法，如改进的喷墨印 刷机探头技术两种方法。 芯片毛细管电泳法以毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 序列分析为 基础，在充满电解质的毛细管两端施加电压，具有不同泳动速率的分子便得以分 离。在序列分析时，先用末端终止或化学裂解法获得序列中不同长度的d n a 片 断，然后用毛细管电泳检测这些片断，得到序列信息。 芯片毛细管电泳法首先由杜邦公司p a c e 开发，研究始于1 9 8 8 年。p a c e 等在 一个直径1 0 0 m m 、厚o 5 m m 的单晶硅片上刻出类似毛细管的装置，用来进行序 列分析。瑞士c i b a - g e i g y 公司和加拿大a l b e r t a 大学合作，由m a n z 等【7 1 利用玻璃 芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸的分离。其后，在m a t h i e s 8 1 的领导下，美国加 州大学伯克利分校的研究人员首次以玻璃为基体制作类毛细管阵列电泳，完成了 对d n a 突变和对d n a 进行测序的检测工作。 1 3 毛细管电泳芯片研究现状 1 3 1 毛细管电泳芯片和微全分析系统 毛细管电泳芯片( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p ，c ec h i p ) 作为生物芯片领域的 一个重要分支，是近几年才出现的微量分析装置，是在常规毛细管电泳( c e ) 原 理和技术的基础上，利用微型制造技术在硅、玻璃、塑料等基体上刻蚀出扁平的 毛细管电泳芯片电动进样的研究 管道和其它功能单元，通过不同的管道网络、功能单元的设计，实现样品的进样、 反应、分离和检测，是一种多功能化的快速、高效、低耗的微型实验装置。 c ec h i p 的出现是与u t a s ( m i c r o t o t a la n a l y s i ss y s t e m ) 的提出和发展紧密 相关的。t a s 是现代分析样品的常用技术，它存在耗时长、试样用量多等缺点一， 随着现代科学技术的发展，特别是微电子技术的发展，人们越来越希望改进t a s 技术。1 9 8 9 年，瑞士的c i b a g e i g y 公司第一次提出u t a s 的概念。他们认为t a s 是周期性的将化学信号转变为电信号的系统，而u t a s 则是：能在距检测点很近 的地方完成样品所有处理步骤的系统。u t a s 概念的提出将t a s 技术和集成化 技术结合起来，推动了分离技术的发展，将整个实验过程集成到尽可能小的平台 上完成，不仅减少了实验耗时和样品用量，而且由于其实验装置体积小而轻便， 易于控制，也适用于需要实地采样和分析的工作。c ec h i p 是u t a s 发展的个 重要的分支，1 9 9 1 年6 月，在巴塞尔举行的高效液相色谱会议及在洛杉机举行的 1 9 9 1 年i e e e ( i n s t i t u t eo f e l e c t r i c a la n de l e c t r o n i c se n g i n e e r s ) 传感器会议上，发表了 用玻璃做基体的毛细管电泳芯片的实验结果，从而宣布了c ec h i p 的正式诞生 1 1 1 2 1 。虽然c ec h i p 诞生至今不过1 0 年左右的时间，但是已经开始在免疫测定 【、d n a 分析和测序1 “、氨基酸和蛋白质的分离限1 ”、生物细胞研究18 等方 面崭露头角。 1 3 2 毛细管电泳芯片的结构 及其研究进展 c ec h i p 由高压电源、毛 细管槽、贮液池、底板、盖片、 盖 检测器等几部分组成，如图1 2 所示。 由于使用了微型制造技 术，芯片的设计变得更加灵活， 不仅管道网络的布局可以根据 需要来设置，还可以加入如柱 前、柱后反应器i ”】这样的功能 单元；在应用于生物样品分析 图3 - 2 ：毛细管电泳芯片示意圈 f t g u r e l 一2 ：s c h e m a t i cd i a g r a mo fac a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sc h i p 4 毛细管电泳芯片电动进样的研究 时，还可以将聚合酶链式反应器( p c r ) 和连接酶链式反应器( l c r ) 等集成在 芯片上【2j ，充分体现了芯片技术所希望达到的目标一芯片上的实验室( l a bo n c h i p s ) 。由于装置微型，集成度高( 正在朝这个方向努力) ，因此能比较容易的与 各种检测器联用。虽然到现在为止，采用激光诱导荧光检测( l 1 f ) 13 l 8 ”】f ”1 的 较多，但也有相当一些研究者在电化学检测 2 ”】、化学发光检测、质谱检测和紫 外吸收检测方面得到一些结果。 到目前为止，c ec h i p 芯片的材质主要有晶体硅、玻璃5 】 16 1 1 8 1 【2 i 】等，其 中又以玻璃的居多。晶体硅具有强度好、价格适中、纯度高、耐腐蚀等优点【”】【2 ”， 但硅是半导体，实践表明，用于绝缘外加电压和硅之间的绝缘薄膜在不到1 0 0 0 v 时便会被击穿1 2 3 1 。玻璃有一定的强度，透光性比较好，绝缘性能较强【2 “，很适合 通常的样品分析。 c ec h i p 内部管长一般为1 1 0 c m ，宽为1 0 - - 5 0 “m ，深为1 0um 左右”1 ” 而c e 的管长几十厘米，内径多为7 5um 。c ec h i p 的沟道截面积比c e 的小，比表 面积大，所以c ec h i p 比c e 散热速度快，焦耳热的影响小。实践证明”“，在电 场强度为2 5 0 0 v c m 功率耗散为2 3 w m 的条件下，没有产生热效应。 1 4 电动进样技术 1 4 1 电动进样技术的研究进展 样品注入( 进样) 是样品分析过程的重要操作步骤之一，c ec h i p 进样方式 绝大多数是电动进样。早期设计的进样“注射器” 6 1 15 2 i j 都是直接在直的分离沟 道的两端加电压，将样品驱动进入分离区，这样很难对进样进行精确控制。在毛 细管电泳芯片中，通过设计沟道的几何形状，将准备注入的样品限制在一定的体 积范围内，这样，就会消除电泳迁移率不同产生的样品成份的偏差。最简单的沟 道几何形状设计就是将两个直的沟道垂直相交，如图1 2 所示，交叉口处的形状 会限制注入样品的体积【2 ”。通过在沟道的四个端口分别加上电压就可以驱动样品 在沟道中运动，改变电压就会改变样品和缓冲液的运动路线，这样，不需要阀门 等装置就可以控制液体的流动。 无阀的流体驱动在沟道的交叉口处会产生液体泄漏，这是由扩散所引起的现 象，需要从流体力学的角度来分析。f a nhz 等【2 4j 的研究发现，对于要注入的样 毛细管屯泳芯片电动进样的研究 品来说，沟道交叉口处的体积会限制样品溶液的形状，究竟沟道的形状以及体积 如何影响所要注入的样品溶液形状，这是非常复杂的，单从扩散的角度很难解释 清楚。参照图l - 2 ，f a n h z 使用的芯片沟道尺寸为：样品池与样品废液池距离为 8 r a m ，其中样品池与交叉口的距离为1 6 m m ；缓冲液池到分离端终点的距离为 16 r a m ，7 其中缓冲液池到交叉口的距离为3 m m ，沟道宽度为3 0u1 y l 。通过在样品 池和样品废液池之间加5 0 0 v 的电压，将一段用荧光素标记的碘酸盐溶液驱动通 过交叉口，延时一段时间以后将电压断开，再在缓冲液池和分离终端加l5 0 0 v 的 电压将交叉口处的样品驱动进入分离沟道，这时，从检测波形来看，注入的时间 在1 秒- - 4 秒的范围时，荧光素曲线和x 轴围成的面积与时间的平方根成正比。 如果开始不加5 0 0 v 的注入电压，而仅仅在延时一段时间后加分离电压，则检测 到的荧光素波峰面积随着延迟时间的增加而增加，这与h a r r i s o ndj 等的研究结 果副是一致的，充分反应了液体扩散的影响。对于1 秒的注入时间，实验中观察 到：在分离样品时检测到的波峰面积是随着注入电压的增加而线性增加的，这完 全在他们意料之外，因为先前他们认为所要注入的样品体积是被限制在交叉口处 的，注入多少样品与所加电压是无关的。显然，由交叉口注入样品的复杂特性是 由所加的进样电压引起的，然而，在电泳迁移率为2 2 x 1 0 。c m 2 s v ，所加电压为 1 0 0 v 时，荧光染料移动2 7 5um 的距离，这将补偿在分离时样品沟道内的任何损 耗，这表明分离时由于外加电压而使得样品进入分离沟道。 既然注入样品的形状和尺寸是影响区带展宽的主要因素，那么控制进样过程 就会提高分离效率。例如在注入电压一定的时候，注入的延迟时间不同，分离效 率也不同。早期的研究1 2 1j 已经表明：在分离的过程中，缓冲液有百分之三被样品 溶液“污染”，然而，这种泄漏值又依赖于沟道的形状和几何尺寸，这是因为不同 毛细管的几何尺寸对流体的阻力不同。当被染料标记的样品溶液在外加分离电场 的作用下由样品沟道进入分离沟道时，由于在交叉口处两股液体的交汇，会产生 由对流所引起的漩涡以及溶液混合，这将会加大在交叉口处形成的塞状样品的扩 散。当主沟道中的电渗流在旁边的沟道中引起对流时，旁边沟道中的流体轮廓将 不再是塞形，有可能在流体前端产生抛物线型形状，这是人们所不希望的。对这 类现象还在进一步的研究。 总之，荷电物质在微沟道内的运动是相当复杂的，很多现象人们还正在研究 之中。 毛细智电泳芯片电动进样的研究 1 4 2 进样沟道的形状 目前，c ec h i p 内进样沟道的形状主要有十字型1 2 “、双t 型2 ”。十字型沟道 如图1 2 所示，双t 型沟道如图1 3 所示，其中h 的大小与沟道的宽度在一个数 量级。f a nzh 等 2 4 1 人利用一块玻璃基片上集成的十字交叉沟道，在4 秒钟内完 成了对三种氨基酸的分离，其中玻璃基片的大小为1 2 c m 。e f f e n h a u s e r 等人【2 5 首次采用双t 型的进样结构以增加进样量，对f i t c 标记的六种氨基酸在15 秒内 实现了很好的分离，进样交叉处到检测窗口的距离为2 4 m m ，分离场强为 1 0 6 0 v c m 。在采用收缩进样的时候，双t 型进样沟道可以增加进样量，这将在后 文详细描述。 图1 3 ：双t 型微沟道示意图 f i g u r e l 一3 ：s c h e m a t i cd i a g r a mo f d o u b l e tm i o r o c h a n n e l 1 4 3 门迸样和收缩进样 电动进样又分为门进样( g a t a e di n j e c t i o n ) 和收缩进样( p i n c h e ds a m p l e l o a d i n g ) 两种”。 门进样可以这样进行，如图1 4 所示。进样前，在u l 和u 3 之间加一定的电 压，为了遏制样品溶液向两旁扩散，在u 2 和u 4 上也加一定的电压，使样品溶液 主要从u 1 流向u 3 。进样时在u 1 和u 2 之间加电压，同时u 3 和u 4 仍保持一定 的电压，于是一段样品就从交叉口进入分离槽，此过程保持0 1 10 秒，由时间的 毛细管电泳芯片电动进样的研究 长短来改变所进样品的体积。分离时，在u 4 和u 2 之间加一定的电压，使样品进 入分离沟道进行分离。 a ! 进样前 b ：进样时 c ：分离时 图1 - 4 ：门进样示意图( 阴影代表样品) f i g u r e l - 4 ：s c h e m a t i cd i a g r a mo f g a t e di n j e c t i o n ( s h a d o w s t a n d sf o rs a m p l e ) u 2 道 收缩进样如图1 5 所示。这种进样方式比较简单，即进样的时候直接将十字 交叉口处的样品推入分离沟道进行分离。这样所进样品的多少是由沟道交叉口处 的体积大小决定的。收缩进样的体积不依赖于场强和时间，引起的空间展宽最小、 基本没有“歧视”效应。而门进样可以实现连续进样，这对于需要不断进行样品 载入和分离的模式，如柱后反应是十分有用的。收缩进样可以在十字型槽中实现， 也可以在双t 型的槽中实现i l 。 a ：进样时 b ：分离时 图1 5 ：收缩进样示意图( 阴影代表样品) f i g u r e l 5 ：s c h e m a t i cd i a g r a mo f g a t e di n j e c t i o n ( g h a d o ws t a n d sf o rs a m p l e ) u 2 道 毛细管电泳芯片电动进样的研究 1 5 计算机数值模拟在毛细管电泳中的应用 到目前为止，对c ec h i p 进样的研究大多数都是通过实验来进行的，对于c e c h i p 的进样和分离还缺乏理论指导，但是，由于c ec h i p 的原理和常规c e 的原 理基本相同，所以对c ec h i p 的研究可以借鉴一些c e 的理论。 由于常规c e 的迸样过程比较简单，有关c e 方面的大量文献报道主要从离子 角度研究物质的化学分离过程，而对于进样过程的研究较少。近几年开始出现了 有关利用常规c e 进行物质分离的计算机数值模拟方面的报道，虽然提出了描绘 电泳分离过程的差分方程，但是直到e r m a k o v 的一系列文献发表1 2 6 | | ”j ，才出现 了较好的数值解法来解这些方程。e r m a k o v 的解法表明，人为增加对流方程的离 散量，可以大大改进仿真的结果，消除了数值抖动和分散。e r m a k o v 发现出现抖 动的原因与以下因素有关：所用的数值方法、方法中的参数、时间与空间的网络 尺寸。为了加速计算的过程，在不产生抖动和溶液负浓度的条件下，网络的尺寸 要尽量大，这些参数的最优值取决于电泳状态的选择( 主要是离子强度和电流密 度) 。当增加电场强度时，在分离的不同阶段最优离散网格尺寸是不同的。虽然有 许多可以利用的数值方法，但是在即要求对实际情况的适应又要求计算速度的情 况下有一定的限制。另一方面是现在存在的程序都缺乏实用的用户界面，这使得 用户不能像使用w o r d 那样方便的使用这些软件【2 。 对c ec h i p 分离过程的研究可以借鉴传统c e 内电泳传输的模型。大多数对 电泳传输的研究都是借鉴了b i e r 等人 2 9 1 建立的计算机模型，这些研究所建立的模 型都是一系列的偏微分方程，并且是依据对流规则建立的。模型基本上都是一维 的，少数是建立在二维基础上的，比如基于不均匀的势产生的不均匀的电渗流 建立的模型【3 0 1 。a n d r e e v 和l i s i n 8 】为一维的毛细管电泳建立了数学模型，分析电 渗流外部轮廓形状对分离效率的影响。另外，f a n 和h a r i s o n 还报道了样品注入的 持续时间对分离效率的影响，正如前面所提到的那样，分离效率依赖于注入样品 的形状，而注入样品的形状又依赖于交叉口处的电渗流模式。他们观察到在开始 一小段时间内，分离效率随着进样时间的增加而增加，但当某一特定的时间过后， 分离效率达到稳定值，产生这种想象可能是由于流场的不稳定以及流体( 样品) 充满交叉口需要一定的时间。 毛细管电泳芯片电动进样的研究 1 6 本文的主要任务 综上所述，由于样品分离过程涉及到生物化学反应和粘性流体动力学等问题， 因此对于具体粒子电动输运过程的理论研究是相当复杂的。本文将主要从电场的 角度研究c ec h i p 的进样，而不研究特定荷电粒子的输运过程。简言之，本文把 握的是电动输运整体行为( 共性行为) ，而不是具体粒子的个性行为。 对于c ec h i p ，由于进样方式灵活，所以进样情况对分离效率的影响很大。 本文首先对注入样品的速度轮廓进行了理论计算研究。 随着沟道几何结构的复杂，控制进样也变得复杂。由于是电场力驱动液体流 动，所以，如果可以精确地控制沟道内部的电场，就可以控制微沟道内部液体的 输运，也就可以精确控制进样和分离过程。因此在沟道几何尺寸和形状确定的条 件下，沟道内的电场分布是决定进样情况的主要因素。无论是十字型还是双t 型 进样沟道，沟道内部的电场分布都是由外部四个端口的外加电压决定的，本文将 通过计算机数值计算求得各种进样过程的电场分布情况，从而得知液体在复杂沟 道中的运动情况。 本文最后通过具体实验来研究外加电压对所注入样品的控制，从而验证了理 论计算的正确性。 0 毛细管屯泳芯片电动进样的研究 2 毛细管电泳理论 c ec h i p 源于常规c e ，二者基本原理是相同的，本章对常规c e 中的一些概 念和理论进行介绍。 2 1 电泳法基本原理 当带电粒子以速度v 在电场中移动时 f = q e 所受电场力为 式中巧为电场力，q 为溶质粒子所带的有效电荷 时所受到的阻力，即为摩擦力为： ( 2 - 1 ) e 为电场强度。带电粒子运动 f = f v ( 2 2 ) 式中f 为摩擦力，v 为溶质粒子在电场中的迁移速度，f 为摩擦系数，f 的大小和 荷电粒子的大小、形状以及介质粘度有关。对于球形粒子，f = 6 7 r r r ，对于棒型 粒子，f = 4 z r q r ( 其中r 是溶质粒子表观液态动力学半径；_ 为电泳介质的粘度) 。 当平衡时，电场力和摩擦力大小相等、方向相反，所以q e = f v ，由此得到： v ：丝：j l e 或。：丝：卫e( 2 3 ) ，4 ，r r r ，6 1 r q r 从式( 2 3 ) 可知，荷电粒子的电泳速度除了与电场强度成正比外，还与其有效电荷 成正比，与其表观液态动力学半径( r ) 及介质粘度( _ ) 成反比。不同物质在同 一电场中，由于它们的有效电荷、形状、大小的差异，它们的电泳迁移速度不同， 所以可能分离。也就是说，物质粒子在电场中迁移速度的不同是电泳分离的基础。 2 2 毛细管电泳电渗现象和电渗流 2 2 1 电渗流 当固体与液体相接触的时候，如果固体表面带一种电荷，则因静电引力使其 周围液体代另一种电荷，在固液界面形成双电层，二者之间有电势差c 当在液体 两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动。这种液体相对于固体表 毛细管电泳：片电动进样的研究 面移动的现象就是电渗现象。 电渗现象中液体的整体移动叫电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，简称e o f ) 。 目前，高效毛细管电泳中所用的毛细管绝大多数是石英材料。当沟道内电解 质溶液的p h 值大于或等于3 的时候，管壁的一s i o h ( 硅羟基) 开始部分解离为 一s i o ，使管壁带负电荷，当管壁和溶液相接触时，为了与管壁表面固定化的负 电荷达到电平衡，在管壁表面会形成稍微过量的反电荷薄层，这一电荷薄层一般 被分为两部分，与固体表面非常接近的过量电荷和在表面有效的固定化的离子被 称之为紧密层，紧密层的厚度约为1 2 个离子的厚度。这一部分的过量电荷和离 子不会对电动力学产生影响。另一部分过量电荷可以与溶液中的离子自由交换， 这一部分过量电荷被称之为双电层中的扩散层。与平衡离子相关的过量电荷密度 随着与固体表面的距离增加而迅速降低，降低到s e ( 占是缓冲液的介电常数， = 4 m ，岛是真空介电常数，为8 8 5 x 1 0 “2 c2 n ! ，s ，为相对介电常数，如 水在2 5 摄氏度时s 为7 8 ) 时的距离称之为双电层的厚度，通常以1 k 表示，其 中l k 是d e b y e 长度。在外加电场的作用下，固、液两相间的相对运动发生在紧 密层与扩散层之间的滑动面上，此处的电势称为电动电势，也称为f ( z e t a ) 电势。 带正电荷的溶液表面及扩散层的阳离子向阴极移动，由于这些离子是溶剂化的， 它们将带动沟道内的液体一起向阴极移动。这就是毛细管电泳中的电渗现象。在 电渗力驱动下毛细管中整个液体的流动，叫毛细管电泳中的电渗流。 电渗流是毛细管电泳中非常重要的物理现象，其大小直接影响分离情况和分 析结果的精密度和准确度。 1 电渗流的大小和方向 电渗流的大小用电渗流速度表示。其大小取决于电渗淌度。和电场强度 e ，即： v 。= l 。+ e ( 2 - 4 ) 电渗淌度1 。，决定于电泳介质及双电层的z e t a 电势，即： 玩，= ( 岛) 带 ( 2 - 5 ) 式中s 。为真空介电常数，为电泳介质的介电常数，f 为毛细管壁的z e t a 电势， 它近似等于扩散层与吸附层界面上的电位。z e t a 电势为：f = ( 4 ；r b ；e ) 占，式中e 是 毛细管内壁扩散层单位面积的过剩电荷数，5 为扩散层厚度，其大小与溶液组成 及离子强度有关。溶液离子强度越大，扩散层厚度越薄。 毛细管电泳芯片电动进样的研究 电渗流的方向决定于毛细管内壁表面电荷的性质。一般情况下，石英毛细管 内壁表面带负电荷，电渗流的方向为由阳极到阴极。但是如果将毛细管内壁表面 改性，比如在壁表面涂渍或键合一层阳离子表面活性剂，或者在内充液中加入大 量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁表面带正电荷。壁表面正电荷因静电 引力吸引溶液中的阴离子，使溶液表面带负电荷，在外电场力的作用下，整个液 体向阳极移动，即电渗流的方向由阴极流向阳极。 2 电渗流的作用 电渗流是伴随电泳而产生的一种电动现象。一般情况下，电渗流流向阴极， 电渗流速度约等于一般离子电泳速度( v 。) 的5 7 倍。所以，各种物质在毛细 管中的迁移速度为： v + = v r 。+ v c ， ； v 一= v 州一v “ ； v 0 = v p n 式中v + 是阳离子运动速度；v 是阴离子运动速度。在一般情况下电渗流可以 带动阳离子、阴离子、中性物质以不同的速度流动。所以说，电渗流在高效毛细 管电泳分析中起着非常重要的作用： 电渗流在毛细管电泳中起到像泵一样的作用，在一次电泳操作中可以同时 完成各种离子的分离。 改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性，这是优化分离的 重要因素。 电渗流明显影响各种电性物质在毛细管中的迁移速度，电渗流的微小变化 就会影响分离测定结果的重现性。电泳中影响电渗流的因素很多，因此有 效的控制电渗流是电泳分析中及其重要的任务。 2 2 2 影响电渗流的因素 把公式( 2 5 ) 带入公式( 2 4 ) ，可以得到电渗流速度表达式： 一， v 。，= 型兰e( 2 - 6 ) 7 7 电渗流速度( v 。，) 和电场强度( e ) 、管壁z e t a 电势( f ) 、电泳介质的介电常数 成正比关系，和电泳介质的粘度( 叩) 成反比关系。而管壁z e t a 电势和毛细管的 材料、表面特性、电泳介质的组成及性质有关。 ( 1 ) p h 值对电渗流速度的影响 毛细管电泳芯片电动进样的研究 在电泳介质中，溶液的p h 值对电渗流速度有很大的影响，电渗流正比于毛 细管内壁的z e t a 电势。对于相同材料毛细管，管中溶液的p h 值不同时它们的 表面电荷特性不同，毛细管壁的z e t a 电势不同，其电渗流的大小也不同。以常用 的石英毛细管为例：当内充液的p h 值增高时，避表面的硅羟基电离带负电荷的 一s i o 一数增多，使壁表面的负电荷密度增大，管壁z e t a 电势增大，电渗流增大； 当溶液的p h 值达到7 时，壁表面的硅羟基完全电离，使壁表面的负电荷密度达 到最大，电渗流达到最大。随着溶液的p h 值减少，壁表面的硅羟基电离受到抑 制，使壁表面的负电荷密度减少，管壁z e t a 电势减小，电渗流减小；当p h 值减 少至3 以下时，壁表面带负电荷的一s i o 一完全被氢离子中和，使壁表面呈电中性， z e t a 电势趋于零。因此溶液p h 值的稳定，对于保持电渗流稳定、保证电泳分离 分析结果的重现性极为重要。所以，电泳操作一定要在适当的缓冲液中进行。 ( 2 ) 介质成份和浓度对电渗流的影响 电泳介质的成份和浓度对电渗流有明显的影响，由于各种离子的形状、大小、 带电荷多少不同，它们的电导率也不同。由不同离子构成的相同浓度的缓冲液， 在相同工作电压下毛细管中的电流会有很大差别，使毛细管中的焦耳热不同，毛 细管中缓冲液温度不同，粘度不同，导致电渗流大小也不同。 ( 3 ) 离子强度对电渗流的影响 电泳介质的溶液离子强度影响壁表面双电层的厚度、溶液粘度和工作电流， 因而明显影响电渗流大小。一般而言，随着缓冲液离子强度的增加，不同缓冲液 的电渗流都呈下降趋势。 ( 4 ) 温度对电渗流的影响 毛细管内温度升高，使溶液浓度下降，电渗流增大。 ( 5 ) 添加剂对电渗流的影响 为改善电泳分离的效率和选择性，常常往缓冲液中加入某些添加剂，如中性 盐类、两性离子、表面活性剂、有机溶剂等，把加入的试剂统称为缓冲溶液添加 剂。当向缓冲溶液中加入浓度较大的中性盐类( 如硫酸钾) 时，溶液离子强度增 大，使双电层的厚度变薄，使z e t a 电势减小，电渗流下降：当加入两性离子( 如 四甲基氯化铵) 时，两性离子可以使溶液粘度增大、溶液p h 值减小，使z e t a 电 势减小，电渗流下降。 缓冲液中加入表面活性剂能够明显得改变毛细管内壁表面的电荷特性，从而 毛细管电泳芯片电动进样的研究 可能改变电渗流的大小和方向。因静电引力，阳离子表面活性剂可能被吸附到毛 细管内壁表面，中和部分带负电荷的s i o 一，使z e t a 电势减小，电渗流下降：当 阳离子表面活性剂浓度增加到能全部中和带负电荷的s i o 一时使壁表面呈电中 性，z e t a 电势为零，电渗流等于零：当再增大阳离子表面活性剂浓度时，壁表面 带净正电荷，形成流向阳极的电渗流，并且电渗流随着阳离子表面活性剂浓度增 大而增大。 不同阳离子表面活性剂对电渗流的影响不同。烷基链越长，阳离子表面活性 剂对电渗流的影响越大。所以常用不同烷基链长的阳离子表面活性剂作为缓冲液 的添加剂，通过改变阳离子表面活性剂的浓度或种类，来控制电渗流的大小和方 向。 加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠( s d s ) ，可以使壁表面负电荷 增加，使z e t a 电势增大，电渗流增加。 有机溶剂对电渗流的影响也十分明显。一些有机溶剂可以使溶液离子强度下 降，使双电层变厚，z e t a 电势增大：另外一些有机溶剂( 如甲醇) 可以使溶液粘 度减小，使电渗流增大。但是，有时有机溶剂也可能通过氢基键合到管壁上，使 壁表面的净负电荷减少或改变双电层的局部粘度，这些作用又往往使电渗流减小。 2 2 3 毛细管电泳中电渗流的控制 有效的控制电渗流，对于提高分离效率、改善分离度、尤其是提高电泳分离 的重现性具有非常重要的意义。毛细管电泳中常用来控制电渗流的方法有： 调节缓冲液p h 值，改变缓冲溶液浓度或种类。 加入添加剂，改变电泳介质。 改变电泳介质的温度。 处理毛细管壁表面。用物理或化学方法使毛细管内壁改性，改变壁表面硅 羟基数目，使壁表面电荷特征变化，可明显改变电渗流的大小和方向。 通过精确的控制外加电场来控制电渗流的大小和方向。 2 3 淌度 在电化学中把单位电场强度下的平均电泳速度称为物质粒子的电泳淌度 ( e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y ) ，简称淌度，用表示，即：卢= v e ，所以由式( 2 - 3 ) 有， 毛细管电泳芯片电动进样的研究 “= q f6 a r r 或p = q f 4 x r r 。 对于给定的介质，溶质粒子的电泳淌度是该物质的特征常数。因此电泳中常 用淌度描述荷电粒子的电泳行为。 物质粒子在电场中的迁移速度决定于粒子淌度和电场强度的乘积，所以淌度 不同是电泳分离的内因。物质所处的环境不同，其形状、大小及所带电荷多少都 可能有差别，则淌度也可能不同。 淌度的分类： 1 绝对淌度 绝对淌度是指无限稀释溶液中荷电粒子在单位电场强度下的平均迁移速度， 绝对淌度表示一种离子在没有其它离子影响下的电泳能力，是该离子在无限稀释 溶液中的特征物理量。各种离子的绝对淌度可以在化学手册中查到。 2 有效淌度 在实际工作中，不可能在无限稀释的溶液中进行电泳，某种离子在溶液中不 是孤立存在的，必然要受到其它离子的影响，其形状、大小及所带电荷多少都可 能发生变化。把物质在实际溶液中的淌度叫做有效淌度。所以有效淌度是指在实 验中测得的离子淌度，用。表示。有效淌度和离子形状、离子半径、介质的介电 常数、溶剂的粘度、离子的电荷数、离子的解离度以及溶液酸度。温度等因素有 关。 3 表观淌度从。 在毛细管电泳中，离子在电场中的迁移速度不仅取决于离子的有效淌度和电 场强度，而且还与电渗流速度有关。把离子在实际电泳中的迁移速度叫做表观迁 移速度，这里用v 。表示，则：v ，= e ，其中，= ( 订。) 不同物质在电泳中的表观淌度不同，使它们的表观迁移速度不同，因而得以 分离。 总结： 通过前面的介绍，我们知道：在电场力作用下，微沟道内荷电物质的运动规 律是极其复杂的，与电压的大小、沟道的形状、缓冲液的p h 值、微粒的荷质比、 溶液的粘度、环境温度等诸多因素有关。根据分析的目的不同，可以适当对上述 的条件进行取舍，抓住主要矛盾进行分析。 对于c ec h i p 而言，当实验的具体条件( 即微沟道材质、实验温度、溶液p h 毛细管电泳芯片电动进样的研究 值、溶液成份等) 确定时，电