（生物物理学专业论文）植物激活蛋白的分离、纯化及结构分析.pdf

摘要 本研究以交链孢菌为材料，进行植物激活蛋白的提取、分离、纯化和理化性质鉴定， j 1 ：对糖蛋白的结构和功能进行了初步研究，为进一步研究植物激活蛋白及其作用机理奠 定理论基础。结果如下： 1 交链孢菌在2 8 c 恒温振荡培养7 2 h ，6 6 k d 蛋白质量达到最大。用7 0 、8 0 乙 醇提取，6 6 k d 蛋白质提取量最大，说明6 6 k d 蛋白足醇溶蛋白。2 0 3 0 饱和度的硫 酸铵，沉淀的总蛋白含量最高，约占蛋白总量的4 3 2 3 。双向电泳结果表明，激活蛋白 的等电点大多集中在酸性区域。 2 利用离子交换层析技术进行粗蛋白纯化，用p h 3 5 、p h 4 0 醋酸缓冲液沈脱得到 两个具有生物活性的目的蛋白，其分子量分别为6 6 k d 和4 5 k d 。用离子交换层析梯度 沈脱的分离效果较好，但所需时间k 。初步纯化的6 6 k d 蛋白质通过脱盐处理，以除去 其中的盐类、小分子杂质及降解的小肽段。然后利用分子筛层析进行精细纯化，_ 欹得 6 6 k d 蛋白质，经检测表明具有生物活性。 3 糖蛋白的鉴定。利用1 2 n a t i v e p a g e 和1 2 s d s p a g e 进行蛋白质纯度和分子 量检测，经纯化后获得6 6 k d 和4 5 k d 蛋白质，达银染电泳纯。凝胶经糖蛋白特异性染 色后发现，6 6 k d 蛋白质为糖蛋白。紫外光谱扫描发现，该蛋白质的特征吸收峰为2 5 7 n m 。 测得该糖蛋白糖与蛋白比值为1 7 5 。利用p n g a s e f 酶和b 一消去反应进一步鉴定糖蛋白 的连接方式，证明糖蛋白中存在o 一糖苷键。该糖蛋白对胃蛋白酶敏感，对胰蛋白酶不 敏感，切割后获得约5 3 k d 的肽段和1 0 k d 的小肽。 4 糖蛋白异型鉴定。利用s d s p a g e 、切胶回收，以及等电聚焦技术，进行了糖蛋 白异型鉴定。结果表明，交链孢菌在摇床培养4 8 h 时，糖蛋白异型最为明显，山现三利 异型体，等电点分别约为3 5 、3 7 和4 _ 3 ，与该糖蛋白在离子交换柱上的结果相同。 5 对糖蛋白进行肽指纹图谱分析，在m a s c o t 站点对所得数据进行检索分析，未发 现于之相匹配的肽指纹图谱，提示可能为一新的糖蛋白。 6 蛋白质结构分析。分别用c h 3 0 h ：h 2 0 = 1 ：1 ( v v ) 、c h 3 0 h ：h 2 0 = i ：2 0 ( v v ) 、h 2 0 三种溶剂溶解糖蛋白，在1 9 0 r t m 2 4 0 1 a m 波长范围内，进行圆二色光谱扫描。结果表明 具有c t 螺旋、p 折叠、转角和无规则卷曲四种二级结构类型。用有机棚c h 3 0 h 微扰后， 螺旋结构含量为1 5 8 ，没有发牛变化；p 折叠含量山4 6 1 逐渐变化为4 8 6 ，柏。增 加的趋势；在由有机相向水相过渡的过程中，转角含量由1 3 5 下降至6 2 ，无规则卷 曲含量增加。 7 蛋白质晶体生k 条件的摸索及鉴定。利用c r y s t a ls c r e e n h r 2 - 1 l o 和c r y s t a l s c r e e n t mh r 2 1 1 2 的9 8 种条件作为池液，进行结晶条件的摸索，于1 6 。c ，在c r y s t a ls c r e e n “h r 2 1 1 0 的第1 4 号缓冲液条件下获得蛋白质晶体，由于衍射点较少，未获得理想的衍 射数据。 8 进行糖蛋白的生物活性测定。用糖蛋白液对小麦种子浸泡6 h 后，分别于2 灭后测 定萌发势、5 天后测定幼茁株高。生物活性测定结果表明：2 天后种子萌发势分别为 9 3 6 2 、9 7 8 7 和9 3 6 1 ，与对照萌发势8 7 1 5 相比明显提高，方差分析表明，在p 0 0 5 条什下存在显著性差异，其中2 p g m l 处理效果最佳。经不同浓度处理后，小麦牛k 5 天后植株高度均高于对照。 关键词：交链孢菌，植物激活蛋白，分离纯化，理化性质，晶体，生物活性 l i i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d s t r u c t u r a la n a l y s i s o fp l a n ta c t i v a t o rp r o t e i n a b s t r a c t w i t ha l t e r n a r i as p p ，p l a n ta c t i v a t o rp r o t e i nw a sd i s t i l l e d ，s e p a r a t e da n dp u r i f i e d ，a n d t h e nt h ep r o p e r t i e ss oi d e n t i f i e d f o rt h es t u d yo ft h es t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so fg l y c o p r o t e i n t h i se x p e r i m e n tp r o v i d e dat h e o r e t i c a le v i d e n c ef o rt h ea c t i v a t o rp r o t e i na n di t sf u n c t i o n m e c h a n i s m r e s u l t sa sf o l l o w s 1 ，t h r o u g ht h ec o n c u s s i v ec u l t u r eo fm y e e l i u ma t2 8 co f7 2h o u r s ，t h ey i e l do f6 6 1 0 3 p r o t e i nr e a c h e dt h eh i g h e s tf i n a ll e v e l w h e nd i s t i l l e db y7 0 ，8 0 e t h a n o l ，t h eb a n d o f 6 6 k d w a ss t r o n g e s t ，w h i c hi n d i c a t e d6 6 k dp r o t e i nw a sa ni n o r g a n i cp r o t e i n w h e nd e p o s i t e db y 2 0 3 0 a m m o n i as u l f a t e ，d e p o s i t i o no f t o t a lp r o t e i n sr e a c h e dt h eh i g h e s tf i n a ll e v e l ，a b o u t 4 3 2 3 o ft o t a lp r o t e i n s r e s u l to ft w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i si n d i c a t e dt h ep io f a c t i v a t o r sw e r ef o c u s e do na c i d i cr e g i o n s 2 b ym o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o ni o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ( h i t r a p t ”d e a e ) ，t w o p r o t e i n sw h i c hh a db i o a c t i v i t yw e r eg a i n e di ns e p a r a t i n gp e a ku n d e rc o n d i t i o n so fp h3 5 ， p h 4 0a c e t a t ea c i d i cb u f f e r , w i t ht h em o l e c u l a rw e i g h to f6 6 k da n d4 5 k d g r a d i e n t s e p a r a t i n gh a dah i g h e re x t e n to fp u r i f i c a t i o nw i t ht h ed i s a d v a n t a g eo fl o n g e rt i m e 6 6 k d p r o t e i nw a se l e m e n t a l l yp u r i f i e dw i t hh i t r a p 2 6 1 0d e s a l t i n gc o l u m nt or e m o v es a l t s m a l l m o l e c u l ei m p u r i t i e sa n dd e g r a d a b i l i t i e s t h e nh i t r a ps u p e r d e x7 5 3 0 0w a su s e df o rt h ef u r t h e r p u r i f i c a t i o n 3 d e t e c t i o no fg l y c o p r o t e i n t h ep u f f t ya n dm o l e c u l a rw e i l g h tw e r ed e t e c t e db y 1 2 n a t i v e - p a g ea n d1 2 s d s - p a g e 6 6 k da n d4 5 k dp r o t e i n sa f t e rp u r i f i c a t i o nw e r ep u r e b ys i l v e rs t a i n i n g s p e c i a ls t a i n i n gi n d i c a t e d6 6 k dp r o t e i nw a sag l y c o p r o t e i na n di t s c h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a kw a s2 5 7 n m t h er a t i oo fs u g a ra n dp r o t e i nw a s1 7 5 i tw a s 0 一g l y c o s i d i cl i n k a g ed i f f e r e n t i a t e db yp n g a s efe n z y m ea n d3 - e l i m i n a t i o nr e a c t i o n t h e g l y c o p r o t e i nw a ss e n s i t i v et op e p s i nn o tt op a n c r e a t i o n i tc o n t a i n e d5 3 k da n d1 0 k dp r o t e i n s a f t e rb e i n gc u tw i t hp e p s i n 4 d e t e c t i o no fg l y c o p r o t e i no d d s h a p e s i tw a sd e t e c t e db y1 2 s d s p a g e ，r e c y c l i n g a n di s o e l e c t r i c f o c u s i n ge l e c t r o p h o r e s i s r e s u l ti n d i c a t e di th a dc l e a r l yt h r e et y p e so f o d d s h a p e sw h e nb e i n gs h a m n 班yc u l t l l r e da f t e r4 8h o u r s ，a n dp l sw e r e3 5 ，3 7a n d4 3 ， l l i r e s p e c t i v e l y t h er e s u l tw a si d e n t i c a lt ot h a ti nh i t r a p t ”d e a e 5 t h ea n a l y s i sa n ds e a r c h e so fp e p t i d em a s so ff i n g e r p r i n ti nm a s c o ti n d i c a t e dt h e r e w e r en om a t c h i n gp r o t e i n s ，an e wg l y e o p r o t e i nw a sp o s s i b l e 6 s t r u c t u r a l a n a l y s i s o fg l y c o p r o t e i n a f t e rd i s s o l v i n gi nt h r e es o l u t i o n sa s c h 3 0 h ：h 2 0 = l ：i ( v v ) ，c h 3 0 h ：h 2 0 = 1 ：2 0 ( v v ) a n dh 2 0 ，a n dt h e nb e i n gs c a n l l e di nc i r c u l a r d i c h r o i s ms p e c t r aw i t ht h ew a v e l e n g t hf r o m1 9 0 n mt o2 4 0 n m ，t h er e s u l t si n c l u d e dh e l i x ，b e t a ， r u m a n dr a n d o m a f t e r p e r t u r b a t i o n w i t h c h 3 0 h ，c o n t e n t o f h e l i x w a s k e p t l 5 8 ，w h i l e b e t a c o n t e n ti n c r e a s e df r o m4 6 1 t o4 8 6 c o n t e n to fr u md e c r e a s e df r o m1 3 5 t o6 2 w h i l e r a n d o mc o n t e n ti n c r e a s e dw h e no r g a n i cp h a s et r a n s f o r m e dt ow a t e r yp h a s e 7 s e a r c ha n dd e t e c t i o no fp r o t e i nc r y s t a l sa n di t sg r o w i n gc o n d i t i o n 9 8s o l u t i o n so f c r y s t a ls c r e e nt m h r 2 1 1 0a n dc r y s t a ls c r e e nt mh r 2 1 1 2w e r eu s e dt of i n do u tas u i t a b l e c o n d i t i o nf o rc r y s t a lg r o w i n g a sar e s u l t g l y c o p r o t e i nc r y s t a l sc o u l dg e tu n d e r1 4 t hb u f f e ri n c r y s t a ls c r e e n t mh r 2 1 1 0a t 1 6 。c b u tw ed i dn o tr e c e i v ep e r f e c td a t ab e c a u s eo fl i m i t e d x r ds p o t s 8 d e t e r m i n a t i o no fb i o a c t i v i t yo fg l y e o p r o t e i n w i t ht h es e e d ss o a k e di ng l y c o p r o t e i n s o l u t i o nf o r6h o u r s ，t h eg r o w t hs t a t u so f s e e dg e r m i n a t i o na f t e r2d a y sa n dt h eh e i g h to f w h e a t a f t e r5d a y sw a sd e t e r m i n e d r e s u l t sw e r e 硒f o l l o w s ：t h eg r o ws t a t u so fs e e dg e r m i n a t i o ni n t r e a t e d t e r m s w e r e 9 3 6 2 ，9 7 8 7 a n d 9 3 6 1 ，r e s p e c t i v e l y , h i g h e r t h a n8 7 1 5 o f c k t h e h e i z h t o f w h e a t i n c r e a s e da f t e r b e i n g t r e a t e d w i t h d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f g l y c o p r o t e i n t h e c o r r e l a t i o nt o e 瑶c i e n t si n d i c a t e dt h ed i f f e r e n c e sw e r ea l ls i g n i f i c a n t k e yw o r d ：a l t e r n a r i as p p ，p l a n ta c t i v a t o rp r o t e i n ，s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，p r o p e r t i e s ， c r y s t a l ，b i o a c t i v i t y v 独创性声明 9 5 0 7 2 3 奉人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书砸使用过 的材料。与我一同工作的同志对奉研究所做的任何页献均已在论文中作了明确的说明j r 表示了谢意。 研究生签名： 悯：彻多年锄殆 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 第一导师签名： 迎i 立 帅：砌莎年多月务 时间： 年月目 1 文献综述 1 1 微生物蛋白农药研究进展 微生物蛋白农药是由微生物产生的，对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质 药物。丰要包括b t 杀虫晶体蛋白( i c p ) 、过敏蛋i 刍h a r p i n 、隐地蛋i ；t e l i c i t i n 、激活蛋白 a c t i v a t o r - 等。 1 1 1b t 杀虫蛋白 微生物蛋白农药主要是b t 杀虫晶体蛋白( i c p ) ，由苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ，b t ) 产牛的、具有杀虫作用的晶体蛋i ! l ( i n s e c t i c i d a lc r y s t a l p r o t e i n ，i c p ) 。 苏云金芽孢杆菌于1 9 0 1 年在日奉被发现，1 9 1 1 年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分 离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名。苏云金芽孢杆菌杆菌，是内生芽孢的革 兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n ) ， 昆虫取食后，晶体蛋白( 前毒素) 在昆虫碱性肠道内溶解，经过中肠蛋白酶的消化作用， 将前毒素降解为活性蛋白，活性蛋白插入昆虫中肠细胞膜，形成跨膜离子通道或孔，导 致细胞溶解，最终使昆虫死亡【1 1 。1 9 5 6 年前苏联发表了用液体培养基摇瓶培养苏云金芽 孢杆菌并用于防治菜青虫的报道，1 9 5 7 年苏云金杆菌制剂首次上市销售，中国上世纪6 0 年代也开始了规模化生产】。目前商品制剂已达1 0 0 多种，是世界上产量最大，应用最 广的微生物杀虫剂。据统计，美国利用b t 相关制剂防治蔬菜害虫和玉米害虫的面积分别 占防治总面积的8 0 和5 0 ，其销售额从8 0 年代末的4 0 0 0 万美元上升到9 0 年代的5 亿多美 元。目前国内b t 制剂的生产厂家达6 8 家，年产量达2 万吨至3 万吨，在2 0 多个省市用于防 治粮、棉、果、蔬、林等作物上的2 0 多种害虫，使用面积达3 0 0 万公顷以上 4 。采用基 因工程技术构建药效稳定、防治面较广的b t i 程菌和利用遗传工程技术将b t 杀虫蛋白基 因导入植物足近年来b t 的研究热点。近2 0 年以来，通过基因工程改良微生物农药菌株、 结合现代发酵工程技术的研发途径，使b t 农药产业的技术创新取得了长足的发展，越来 越多的b t 系列农药投入农业生产应用，特别是在b i o s i s 、e c o s c i e n c e 、b i o t e c h 、m y c o g e n 、 e c o g e n ，e d e n 等高新科技公司的推动下，微牛物蛋白农药得到了快速发展，并取得了 卓越的成就，女h m y c o g e n 公司利用基因工程技术，开发出包括m v p ( k u r s t a k i c r y l a c ) 、 m t r a k ( s a n d i e g o c r y 3 a ) 、m c ( a i z a w a i c r y l c ) 等一系列b t 新产品，年销售额达到1 亿 美元【”。 1 1 2 蛋白激发子类农药 近年来，从植物病原菌中发现了具有诱导植物广谱抗性和促进生长的多功能蛋白激 发子类物质。一般生物农药是直接作用于防治对象，而蛋白激发子农药则是通过诱导植 物本身的抗病基因表达从而达到抗病防虫促进生长的作用，是解决了农业生产病虫害问 题的根本途径。新型微生物蛋白农药的研究正逐步成为生物农药发展的一个重要内容。 其中具有代表性的有过敏蛋白( h a r p i n ) 、隐地蛋i ! t ( e l i e i t i n ) 和激活蛋 刍( a c t i v a t o r ) 等。 1 1 2 1 过敏蛋白h a r p i n 1 9 9 2 年，美国科学杂志封面文章报道了美国c o m e l l 大学韦忠民( z m w e i ) 博 士等人研究的植物病原欧氏杆菌( e r w i n i aa m y l o v o r a ) 过敏蛋白的序列及其基因，并首 次提出h a r p i n 激发植物h r 与抗病性的关系，提出了过敏蛋白具有诱导抗病功能，开创 了新型微生物蛋白农药研究的兴起【8 】。 过敏蛋白是由植物病原细菌( e r w i n i aa m y l o v o r a ) 产生的一种引起植物过敏反应的 蛋白质，h a r p i n 多由3 0 0 4 0 0 个氨基酸组成，其分子量约为4 0 k d ，可诱导植物体内一 系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫机制，从而抵御多种病害的侵染和不 良环境的影响，同时具有促生增产等功效。 2 0 0 1 年美国c o m e l l 大学和e d e n 生物科技公司基于过敏蛋白的研究，共同开发和研 制成功了具有抗病防虫功能的广谱性无公害微生物蛋白农药m e s s e n g e r 。该产品是2 0 0 1 年生物农药中最具代表性的新产品之一，也是当前国际上利用高技术手段开发牛物农药 最成功的例子。该产品在多种大田作物、经济作物上应用后，抗病增产效果十分显著， 对多种病虫害防治效果达5 0 8 0 ，增产效果1 0 2 0 。这类农药功能广泛，作用机制 独特，对环境友好，有关研究荣获了2 0 0 1 年度美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学 挑战奖。 国内赵立平博士等也研究证实了细菌蛋白质具有提高植物抗病虫和促进植物增产 的功能【9 】，并进q 亍t h a r p i n 的结构与功能关系、h a r p i n 的固氮工程菌的构建【”】、产h a r p i n 的团成泛菌工程菌的构建等方面的研究【l “。李汝刚、范云六等人进行t h a r p i n 蛋白基因 的克隆及序列分析【l2 】以及表达h a r p i n 蛋白的转基因马铃薯降低晚疫病斑生长率方面的研 究【1 3 。 王金生教授实验室开展了水稻白叶枯病菌h a r p i n 基因的克隆与表达；对水稻黄单胞 菌的h r p 基因簇进行了全序列测定，发现其中含有2 3 个h i p 调节基因和h r p 基因簇( 2 4 个基 因) ；从水稻黄单胞菌和水稻中克隆和分离了1 0 余种抗病激活蛋白编码基因，从水稻黄单 孢条斑病菌( x a n t h o m o n a so r y z a ep v d ，弦耙d 肠) 的i i i 型泌出系统突变体m 5 1 中分离、纯 化到激发烟草过敏性反应的活性蛋白；对来源于水稻白叶枯病菌中编码植物h r 反应激发 子h a r p i n x o o 蛋白的基因h r f a x o o 进行了功能域分析，已从水稻中克隆到1 2 种信号调控基 因；并进行了水稻黄单孢菌两个致病变种( x o o 羊n x o o c ) q b h a r p i n 蛋白的比较遗传学研 究，发掘出编码h a r p i n x 的功能基因，并通过转基因手段实现了基因在植物中的高效表达， 具有显著的防病效果 1 4 4 ”。 1 1 2 2 隐地蛋白e l i c i t i n 隐地蛋( c r y p t o g e i n ，c r y ) 是一种由隐地疫霉( p h y t o p h t h o r ac r y p t o g e a ) 分泌的蛋白类 激发子，白1 9 7 7 年观察n p c r y p t o g e a 的菌体提取物和培养滤液能引起烟草叶片坏死性反 应以来，从产c r y p t o g e a ，pc i n n a m o m i 和pc a p s i c i 中已纯化了分子量约1 0 k d 的多种蛋白 类激发子 1 6 - 1 7 1 。h u e t 等( 1 9 8 9 ) 将这类活性蛋白命名为e l i c i t i n 。e l i c i t i n s 足一类特殊的 外泌、小分子耐热蛋白，等电点为9 8 ，由9 8 个氨基酸组成，在培养液中很丰富 1 7 - 1 8 。 可诱导茄科的烟草和十字花科的油菜和萝h 产生过敏性坏死和诱导抗性等防御反应 1 6 - 1 8 1 。 m c r y p t o g e i n 在极低浓度( 1 0 0 p m o l m l ) 下就能诱导烟草产生h r ，并使植株获得 广谱抗病性，同时产牛与防卫反应相关的物质如乙稀、植物保卫素、p r 蛋白( p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n s ) 等 1 ，所以倍受植物病理学家和育种工作者的重视。c r y p t o g e i n 作为蛋 白类激发子在国外得到了较为系统的研究，在氨基酸序列、空间结构、寄丰与非寄主抗 病性、作用机理、作用靶标、结构与牛物活性的相关性以及抗病基因工程等方面取得了 较大的进展 2 0 - 2 2 。 研究证明，e l i c i t i n 是通过水杨酸介导抗病信号途径，激发植物获得对真菌、细菌等 病原物的系统抗性( s a r ) ，同时产生活性氧自由基、脂过氧化物、植保素、p r 蛋白等 防御反应相关物质。迄今已发现1 7 种疫霉菌中存在e l i c i t i n 香性蛋白，根据等电点和对烟 草的激活反应可分为。【e l i c i t i n ( 酸性) 和d e l i c i t i n ( 碱性) 两类，两种类型蛋白的氨基酸 序列同源性达到6 0 以上。近年来从一些腐霉菌中也发现有e l i c i t i n 类似活性蛋白存在， 并能高效激发番茄的系统获得性抗性 23 1 。法国的t e p f e r 等( 1 9 9 8 ) 首次将隐地蛋白 ( c r y p t o g e i n ) 基因成功导入烟草，植株均表现抗黑胫病作用。 国内也开展了e l i c i t i n 相关研究，研究热点集中在基因的克隆和表达上。蒋冬花、郭 泽建等克隆了隐地蛋白( c r y p t o g e i n ) 基因，构建植物表达载体、转化烟草、表达抗黑胫 病作用 2 ，2 0 0 0 年研究还发现，隐地蛋白1 3 位上的赖氨酸在诱导细胞死亡中起着关键的 作用1 2 5 j ；谢丙炎等在1 9 9 8 年研究了苎麻疫霉诱抗激发蛋白( b o e c h e m r i a e i n ) 的理化特性、 功能及其基因结构，发现该蛋白对辣椒抗疫病有诱导抗性作用，并首次发现e l i c i f i n 基因 存在断裂现象。用低浓度的激发素处理茄科、十字花科等多种非寄主植物可诱导产生h r ， 使植物获得对病原物的系统抗病性犯6 1 。 张宏明从疫霉菌( p h y t o p h t h o r ap a l a m i v o r ab u t l e r ) 的培养滤液中分离出分子量为 1 0 6 k d 的不含糖基的耐热蛋白。这种1 0 6 k d 蛋白能诱导烟草叶片发生过敏性坏死反应。 研究表明用该蛋白处理的烟草叶肉、表皮和保卫细胞，以及悬浮培养细胞在产生过敏性 坏死反应之前，均有h 2 0 2 的大量生成，推测这种1 0 6 k d 蛋白也属于e l i c i t i n 类激发子 2 7 。 1 1 2 3 激活蛋白a c t i v a t o r 激活蛋白是从葡萄孢菌( b o t r y t i s ) 、交链孢菌( a i t e r n a r i a ) 、黄曲霉菌( a s p o r g i l l u s ) 、 稻瘟菌( p y r c u l a r i a ) 、青霉菌( p e n i c i l l i u m ) 、纹枯病菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、木霉菌 ( t r i c h o d e r m a ) 、镰刀菌( f u s a r i u m ) 等多种真菌中筛选、分离、纯化出的一系列新型蛋 白质。研究证明，稻瘟菌激活蛋白的氨基酸和核酸序列不同于过敏蛋白和隐地蛋白。激 活蛋白不激发烟草植株的过敏反应，这与h a r p i n 和e l i c i t i n 的生物活性均是基于植物的 过敏反应不同 2 8 。本室的生测实验结果表明f 2 9 - 3 3 ，激活蛋白对植物烟草花叶病毒病、黄 瓜花叶病毒病等多种病毒病和蚜虫都有较好控制效果，并能提高作物的抗旱能力和提高 作物产量。激活蛋白处理种子能够加快黄瓜、豌豆等种子的萌发，促进幼根的生k 。该 蛋白制剂能够以特定的作用方式成倍地提高b t 对鳞翅目害虫的防治效果。开发新型蛋白 质激发子农药将是今后生物农药发展的一个重要方向】。由此可见激活蛋白具有广泛的 应用前景。激活蛋白质主要通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力：通 过激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长和叶绿素含量提高，从而达到 提高作物产量的目的。 1 1 2 4 其他激发子 张正光等人从引起棉花烂铃的棉疫病菌助y t o p h t h o r ab o e h m e r i a e 培养滤液中纯化了 一种特异的9 0 k d 蛋白激发子并研究了该蛋白激发子诱导烟草过敏反应( h r ) 过程中细胞 死亡和防卫反应酶系活性变化以及对病程相关蛋p r 5 的诱导作用。研究以1 0 n m o l l 激 发子溶液注射处理w 3 8 烟草叶片，h r 枯斑周围5 m m 组织在u v 光下呈现蓝色荧光，对处 理部位进行e v a n sb l u e 染色，结果发现2 0 h 处理部位细胞全部死亡；激发子可诱导烟草防 卫反应中苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 的活性提高；可快速诱导p r 5 基因的转录。上述结果表明 9 0 k d 蛋白激发子可诱发烟草的细胞死亡、苯丙烷代谢和p r 基因的表达等多条信号途径 【3 5 。 2 0 0 1 年v e i t 等在腐霉( p y t h i u ma p h a n i d e r m a t u m ) 细胞壁中分离到一种新的蛋白类激 发子，能诱导双子叶植物产生多种防卫反应，但对单子叶植物物无活性；该蛋白是许多 微牛物如卵菌、细菌、真菌等细胞壁的共有成分 3 6 。 从大雄疫霉大豆专化型滤液中分离出种4 2 k d 的糖蛋白能激发欧芹细胞和原生质 体产牛香豆素植保素，可证明该激发子的活性取决于蛋白部分而不是聚糖部分【3 ”。从大 豆疫霉病病原真菌中即纯化出了大豆植保素生物合成的寡糖类激发子，又分离出了欧芹 植保素积累的糖蛋白激发子。可见，从同一真菌中提取的不同成分可以被不同植物识别 为激发子。 1 2 糖蛋白的结构与功能分析方法 1 2 1 糖蛋白的生物活性 糖蛋白( g l y c o p r o t e i n ) 是指由比较短，往往带分支的寡糖与多肽链某些特殊部位的 羟基或酰氨基共价连接而成的一类结合蛋白质。它广泛存在于动物、植物、微牛物及病 毒中。细胞中的糖蛋白有可溶性的，也有与膜结合的不溶形式，生物体内大多数蛋白质 是糖蛋白【3 ”。糖蛋白中蛋白质是生理功能的主要承担者，糖链对蛋白质的功能起修饰作 用，即糖链影响蛋白质的整体构象，影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生 物活性等，糖链与蛋白质的相互作用介导细胞的专一性识别和调控各种生命过程如：受 精、发生、发育、分化、神经系统、免疫系统恒态的维持等，在炎症及自身免疫疾病、 老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染等过程中起重要作用【3 8 3 。 糖链的合成并不是依据模板的复制过程，而是包含了糖基的供体、糖基的受体、糖 幕转移酶及糖苷酶等因素在内的复杂过程，除受酶基因表达的调控外，还受酶活性的影 响，即便在同种分子的同一糖摹化位点上，糖链的结构也有差异，即糖链有微不均性， 这种不均一性反映了组织、细胞类型、发育和分化阶段的不同，因此对糖链的结构及生 物学作用只能逐个的分别研究( c a s eb yc a s e ) 。糖链结构测定和化学合成也远比核酸和蛋 白质要闲难，各国科学家都在致力于糖链结构分析和合成方法学上的突破，为糖链的功 能分析提供技术支持。 1 2 2 糖肽键类型 在糖蛋白的高级结构中，肽链折叠卷曲成特定的空间结构，肽链上只有某些特殊的 氨基酸序列位点才能与糖链结合，糖链作为侧链和亲水基团暴露在空间结构外面。糖肽 键足糖链和肽链的连接键，是指糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基 或羟基脱水形成的糖苷键。可分为n 糖苷键和o 糖苷键两大类。参与糖肽键的氨基酸残 基丰要有：天冬酰胺( a s n ) 、丝氨酸( s e r ) 、苏氨酸( t h r ) 、羟赖氨酸( h y l ) 幕l l 羟脯氨酸( h y p ) 。 它们可以与n 一乙酰葡萄糖胺、n 一乙酰半乳糖胺、木糖、半乳糖及阿拉伯糖形成5 种主要 的糖肽键，分别是：g - n 一乙酰葡萄糖胺一天冬酰胺( g l c n a c a s h ) 、a - n 乙酰半乳糖胺丝 氨酸苏氨酸( g a l n a c s e r t h r ) 、木糖一丝氨酸( x y l s e r ) 、g 半乳糖一羟赖氨酸( g a l h y l ) 、a - l 一 阿拉伯糖一羟脯氨酸( a r a - h y p ) 。此外，还发现罕见的以n 末端氨基酸残基为连接点的糖 肽键，存在于小鼠血红蛋l 刍a l c 中。 1 2 2 in 糖苷键 n 一糖苷键不仅与氨基酸种类有关，而且与氨基酸顺序有关。带糖链的天冬酰胺残基 附近往往含有一个苏氨酸或丝氨酸残基，即它具有顺序子结构，称为天冬酰胺顺序子： 天冬酰胺，x 苏氨酸( a s h x t h r ) 或天冬酰胺x 丝氨酸( a s h x s e r ) ，其中x 可代表除脯氨 酸以外的任何一种氨基酸残基。 研究表明糖蛋白中能与天冬酰胺残基相连的寡糖链数目是有限的，并非所有天冬酰 胺顺序中的天冬酰胺都发生糖基化，如鸡卵清蛋白。天冬酰胺顺序子不仅与糖基化有关， 可能对糖链的组成与k 短也有控制作用，如顺序子中的x 为极性氨基酸时，常生成复杂 型寡糖链；x 为非极性氨基酸时常形成单纯型寡糖链】。 1 2 2 2 o 糖苷键：主要有4 种类型 4 ”。 ( 1 ) 以a - n 乙酰半乳糖胺丝氨酸苏氨酸残基为起点，此糖肽键是3 一o 一( 2 一乙酰胺2 脱 氧廿d 批喃半乳糖基) 一l 。丝氨酸或( 苏氨酸) 。是粘液糖蛋白的特征键，在某些非粘液型 糖蛋白中也有发现。 ( 2 ) 以木糖一丝氨酸残基为连接点，大多数以木糖残基与肽链上丝氨酸残基结合，形成 o 糖苷键而连接起来。 ( 3 ) 以半乳糖羟赖氨酸残基为连接点，此糖肽键称为5 o 肛毗喃半乳糖基5 羟基l 赖氨酸。是胶原和一些胶原样多聚物的特征结构。在发生糖基化的羟赖氨酸( h y l ) 之后， 紧接着往往是一个甘氨酸( g 1 y ) 。 ( 4 ) 以阿拉伯糖羟脯氨酸残基为连接点，此糖肽键称为4 一o b d 吡喃阿拉伯糖基4 一 羟- 反式一l 一脯氨酸，目前仅在高等植物中发现，丰要存在于绿色植物和绿藻细胞壁的糖 蛋白中。 1 - 2 3 糖链结构 1 2 3 1n 连接的糖链：n 连接的糖链主要有四种组成方式4 。 ( 1 ) n - 糖链通常包含一个五糖核心结构，称为三甘露五糖核心结构，该核心由内 侧的两个g l c n a c 和外侧的三个甘露糖( m a n ) 构成，其中两个0 【m a n ，分别以a 1 3 和1 6 与内侧的p m a n 相连，各种生物体内n 连接的糖蛋白糖链中均含有此结构。根据五糖核 心结构连接其它糖的情况，n 一糖链分为以下几类：( 1 ) 高甘露糖型寡糖链只含有h 露糖和 n 一乙酰氨基葡萄糖，而且只有h 露糖连接在五糖核心区上，如卵白蛋白。 ( 2 ) 复杂型寡糖链除含有甘露糖s w n 乙酰氨基葡萄糖外，在 j 露糖上还连接有半 乳糖、岩藻糖和唾液酸等。a l - - - * 3 m a n 的c 2 和c 4 位，以及a l - - - + 6 m a n 的c 2 和c 6 位上连接外 侧糖连，即天线，可分为二天线型( c 2 c 2 ) 、三天线型( c 2 ，4 c 6 ) 和四天线型( c 2 ，4 c 2 ， 6 ) 。只有极少数是单天线型的，五天线型仅发现于鸟类卵清中。 ( 3 ) 杂合型又称混合型，既有高 j 露糖链，又有n 一乙酰氨基半乳糖链，连接于五 糖核心的两个- m a n 上，如卵清蛋白。 ( 4 ) 核心岩藻糖型五糖核心的最内侧g l c n a c 上以血1 6 连接岩藻糖( f u c ) 。( 5 ) 平分 型b m a n 上连接一个g l c n a c 。 1 2 3 2o 连接的糖链 o 一连接的糖链存在多种形式，如g a l n a c s e r t h r ，g i c n a c s e r t h r ，g a l s e t ， a r a s e 以1 1 r 等。这类糖类结构共同点，是由一种或少数几种单糖与某些含羟基氨基酸连 接，不存在共有的核心结构，但在o g a l n a c 连接的糖链中已发现有4 类核心结构。其中 研究得最多的是粘蛋白、血浆蛋白和膜蛋白一。 1 2 4 糖链分析策略 1 2 4 1 糖蛋白及糖链结构的定性鉴定 样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后用s h i 蹴剂、甲苯胺蓝、硫酸一百里苯酚等染色可以 定性鉴定糖蛋白 4 ”，也可以电泳后进行w e s t e m e n 迹，将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜 上，再以糖蛋白测定试剂盒，进行糖蛋白定性试验 4 “5 1 。凝集素是一类能识别、结合特 异单糖或糖链结构的糖蛋白，糖结合专一性不同的凝集素，可以区别糖残基的连接方式、 分支和修饰情况，因此凝集素不仅能用于寡糖和糖复合物的分离纯化，还能用于糖链结 构分析。常用凝集素亲和层析、亲和沉淀、亲和电泳、酶联免疫( e l i s a ) 、印迹等方法鉴 定分离糖链、糖肽及鉴定糖链结构【4 6 l 。 1 2 4 2 糖蛋白及糖肽的制备 糖蛋白的分离制备常采用离子交换层析、凝胶过滤、凝集素亲和层析等方法；糖肽 的制各首先要用蛋白酶切断蛋白主链，糖蛋白的酶解，酶的用量比纯蛋白的酶解要