（生物化学与分子生物学专业论文）磁性微粒富集糖蛋白糖肽新方法的研究.pdf

西北大学硕士学位论文 磁性微粒富集糖蛋白糖肽新方法的研究水 摘要 鉴于糖基化与所修饰蛋白的结构、功能之间及蛋白糖基化程度与细胞健康状 态之间的紧密相关性，蛋白质糖基化和糖蛋白质组学的研究越来越受到人们的重 视。分离富集糖蛋白糖肽并对其糖基化位点糖蛋白进行鉴定成为了蛋白糖基化 研究的重点内容。蛋白质组学相关技术已初步应用于糖基化研究中，但糖基化发 生的特点决定了它对相关分析技术的高要求性。现有相关分析技术还不够成熟和 完备，糖蛋白分析研究要求新的技术突破 本研究对分离富集糖蛋白糖肽的新方法进行了研究。试验中分别将肼化学 和凝集素与磁性微粒( 磁粒) 相结合，分别制备出了肼功能化磁粒和g n a 功能 化磁粒，优化了肼功能化磁粒富集糖肽的条件和g n a 固定的条件，并通过标准 蛋白样品对两种方法的富集特异性和有效性进行了验证试验表明：两种方法富 集糖蛋白糖肽的特异性和有效性均表现良好本实验还将肼功能化磁粒富集糖 肽方法与糖肽酶酶解、生物质谱等方法相结合，建立起了一套可用于糖蛋白糖 肽分离富集并进行糖蛋白糖基化位点鉴定的新体系 研究表明，本试验所建立的肼功能化磁粒和g n a 功能化磁粒分离富集糖肽 方法具有操作简单、分离快速等优点由于肼功能化磁粒在分离富集糖蛋白的过 程中去除了非糖蛋白和糖蛋白中的非高甘露糖型糖蛋白，肼磁粒富集糖肽方法去 除了非糖蛋白和糖蛋白中的非糖基化多肽，两者都极大的降低了样品的复杂性， 本课题受国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 计划，课题编号n o 2 0 0 4 c b 5 2 0 8 0 2 ) 及国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划，课题编号n o 2 0 0 7 a a 0 2 2 4 1 3 ) 资助。 西北大学硕士学位论文 因而降低了后续数据处理的难度，进而亦有望实现糖蛋白鉴定中的高通量和自动 化。本试验为该方法用于糖蛋白组学中复杂样品的蛋白糖基化研究奠定了基础。 关键字：磁性微粒；肼化学；凝集素；糖肽；糖蛋白 i i 西北大学硕士学位论文 a b s t r a c t p r o t e i ng l y c o s y l a t i o na n d g l y c o p r o t e o m i c sa r eg r o w i n gf i e l d so fi n t e r e s td u et ot h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ng l y c o s y l a t i o na n dt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fg l y c o p r o t e i n sa s w e l la st h a tb e t w e e ng l y c o s y l a t i o nd e g r e ea n dt h eh e a l t hs t a t u so fc e l l s t h e e n r i c h m e n to fg l y c o p e p t i d e s g l y c o p r o t e i n sa n di d e n t i f i c a t i o no fg l y c o s y l a t i o n s i t e s g l y c o p r o t e i n sa l ei m p o r t a n tc o n t e n t si ng l y c o p r o t e o m i c s m a n yt e c h n o l o g i e so f p r o t e o m i c sh a v eb e e na p p l i e dt ot h ea n a l y s i so fg l y c o s y l a t i o np r i m a r i l y , b u tt h e c h a r a c t e r i s t i co ft h eg l y c o s y l a t i o nd e t e r m i n e st h eh i 曲r e q u i r e m e n tt ot h ea n a l y s i s t e c h n o l o g i e s s i n c et h et e c h n o l o g i s en o w e x i s t e di ss t i l li n s u f f i c i e n t ，n e wt e c h n o l o g i e s f o rg l y c o p r o t e i n sa n a l y s i sa r es t r i n g e n tn e c e s s i t y h e r ew ed e v e l o p e dt w on e wm e t h o d sf o rt h ee n r i c h m e n to fg l y c o p r o t e i n s g l y c o p e p t i d e s b o t hm e t h o d sc o m b i n e dt h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e st e c h n o l o g yw i t h h y d r a z i d ec h e m i s t r ya n dl e c t i n ，r e s p e c t i v e l y t h eh y d r a z i d e f u n c t i o n i z e dm a g n e t i c m i c r o s p h e r e s a n dg n a f u n c t i o n i z e d m a g n e t i cm i c r o s p h e r e s a r e p r e p a r e d c o r r e s p o n d i n g l y t h ec o n d i t i o nf o rc a p t u r i n gg l y c o p e p t i d e sb yh y d r a z i d e - f u n c t i o n i z e d m a g n e t i cm i c r o s p h e r e sa n di m m o b i l i n gg n ao n t ot h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw a s e v a l u a t e da n do p t i m i z e d ，a n dt h e s p e c i f i c i t ya n dv a l i d i t yo ft w om e t h o d sw a s d e m o n s t r a t e db yu s i n gs t a n d a r d g l y c o p r o t e i n ss a m p l e t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a tt h es p e c i f i c i t ya n dv a l i d i t yo ft w om e t h o d sw a sa l lr i g h t an e wa n a l y s i s s y s t e mf o re n r i c h m e n to fg l y c o p r o t e i n s g l y c o p e p t i d e sa sw e l la st h ei d e n t i f i c a t i o no f g l y c o p r o t e i n s g l y c o s y l a t i o ns i t e sw a sa l s oe s t a b l i s h e db yc o u p l i n ge n r i c h m e n to f g l y c o p e p t i d e sb yh y d r a z i d e - f u n c t i o n i z e dm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw i t hr e l e a s eo f p o l y s a c c h a r i d ec h a i n sb yp n g a s efa n dm a s ss p e c t r o m e t r ya sw e l l e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg l y c o p r o t e i n s g l y c o p e p t i d e se n r i c h m e n t m e t h o dd e v e l o p e dh e r ei ss i m p l ea n dr e p i d s i n c et h en o n g l y c o p r o t e i n sa n dn o n h i g h m a n n o s et y p eg l y c o p r o t e i n sw e r er e m o v e di nt h ep r o c e s so fb o t h g l y c o p r o t e i n s e n r i c h m e n tb yg n a f u n c t i o n i z e dm a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ，a n dt h en o n g l y c o p e p t i d e s i i i 西北大学硕士学位论文 w a sa l s om o v e da w a yb yh y d a r z i d ec h e m i s t r ym e t h o d ，t h ec o m p l e x i t yo ft h es a m p l e w a sr e d u c e dh u g e l yb yb o t hm e t h o d s ，w h i c hw o u l dr e d u c et h ed i f f i c u l t yo fp o s t e r i o r d a t ap r o c e s s i n g s oi tm a ya c h i e v et h eh i g l la n da u t o m a t i z a t i o no fi d e n t i f i c a t i o no f g l y c o p r o t e i n s t h es t u d yl a y e daf o u n d a t i o nf o rb o t hm e t h o d st ob eu s e di nt h e g l y c o s y l a t i o na n a l y s i so fc o m p l e xs a m p l e s k e y w o r d s m a g n e t i cm i c r o s p h e r e ，h y d r a z i d e ，l e c t i n ，g l y c o p e p t i d e s ， g l y c o p r o t e i n i v 西北大学硕士学位论文 英文缩略表 v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：圣k 生指导教师签名：夺琦 1 0 d 8 年6 月1 2e l功q 8 年月j z 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：刭、士立 砂0 8 年否月胁日 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在 校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本 人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学 位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：指导教师签名： 年月日年月日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名： 年月 西北大学硕士学位论文 第一章引言弟一早ji 商 蛋白质的糖基化修饰是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一【u ；它不仅 影响所修饰蛋白质在细胞内的折叠、运输、定位、蛋白质的结构和生物活性等【2 】， 而且通过糖一蛋白间的特异识别作用调节生物体内的各种生物学过程，如细胞间 识别、粘连与融合；信号传导、免疫应答；细胞调控；细胞转化、分化与反分化 等【3 7 】；糖基化现象普遍存在于诸如膜蛋白、细胞外分泌蛋白和体液中的各种蛋 白质中，蛋白质糖基化程度及糖链结构的异常变化常是癌症及其他疾病发生发展 的重要标志【8 ，明；许多癌症诊断标志物及治疗的靶标如乳腺癌中的h e r 2 n e u 、前 列腺癌中的前列腺特异性抗原、卵巢癌中的c a l 2 5 等都是糖蛋白【1o 1 1 】，有些糖基 化发生改变的糖蛋白己应用于人类疾病的诊断、分期和预后评估。近几年来，蛋 白糖基化研究的很多重大理论突破及应用价值吸引着越来越多的科学家投身于 这一领域，使得糖生物学上、中、下游各研究领域逐渐呈现全面繁荣的景象，糖 生物学研究也正在成为继核酸、蛋白质之后生命科学领域中又一极具潜力的研究 领域。 1 糖蛋白概述 综述一糖蛋白组学研究进展 1 1 定义及主要类型 糖蛋白是一类由一个或多个寡糖链与蛋白质的多肽骨架共价相连构成的结 合蛋白。广泛存在于动物、植物、微生物及病毒中。根据所连糖基的不同，大致 可分为以下4 类【1 2 1 3 】： ( 1 ) n 糖蛋白：糖链通过n - 乙酰葡糖胺与处于保守序列n x s t ( x 可以是 西北大学硕士学位论文 除脯氨酸外的任意氨基酸) 中的天冬酰胺相连：n 连接的糖链都含g l c n a c 2 m a n 3 组成的核心结构，根据其外围分支的不同又可分为高甘露糖型、杂合型和复杂型 3 种，后2 种是在高甘露糖型的基础上经进一步加工形成的；n 型糖蛋白主要存在 于血浆蛋白和分泌蛋白等，又称为血浆型糖蛋白。 ( 2 ) o 糖蛋白：糖链与蛋白中的丝氨酸或苏氨酸相连；o 连接的糖链要复杂的 多，组成从一个单糖到巨大的磺酸化的多糖不等，没有一个统一的核心结构，糖 基化位点也没有一个保守的氨基酸序列：0 糖蛋白在黏液，免疫球蛋白等中广泛 存在。 ( 3 ) 与糖磷脂锚( g p ia n c h o r ) 相连的糖蛋白。g p i a n c h o r 是一种糖脂，通过酰 胺键与蛋白质的羧基端相连，从而将该蛋白固定在膜上。 ( 4 ) c 糖基化：是一种单糖与膜或分泌蛋白表面色氨酸残基相连。 目前以n 糖蛋白和0 一糖蛋白研究较多。 a s p a r a g m e n 叫k e 刚矛眦a r n i 嗽 a s e r i m i n e ( x 黛h ) t h r e o n i n e ( x = = c h si n a c 啊y 弛山c 协h ，妇 b 图1 1糖链与蛋白连接示意图a ：n - 连接；b ：o 连接 2 西北大学硕士学位论文 f i g 1 1 t h el i n k a g em o d eo fg l y c o s y l a t e dc h a i n st ot h ep r o t e i n 1 2 糖基化发生的特点及其对分析技术的影响 蛋白质糖基化具有不均一性和多样性。糖基化的发生不受d n a 的直接控制， 而是由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大， 造成糖基化发生过程中会产生一系列结构相关的糖链( 微不均一性) 以及同一糖 蛋白中的不同糖基化位点连接有不同的糖链( 点不均一性) ，即使同一个位点也会 有糖基化程度不同的产物1 4 ，15 1 。而在所有符合n 糖基化位点保守序列的n x s t 中也不是全部的位点发生了糖基化【1 6 ，1 7 】，这种糖基化程度的不同使同一肽链因所 带糖基的不同而呈现多种多样的“糖形 ，从而造成了蛋白糖基化的多样性。糖 基化的不均一性和多样性给糖蛋白的分离分析带来了很大的困难：首先，不同糖 形的同一糖蛋白会在s d s p a g e 上呈现弥散的条带或在双向电泳上呈现多个深 浅不同的点，造成同一蛋白在不同的点上得到鉴定或者由于信号的分散造成较低 丰度的蛋白得不到鉴定【1 8 】：糖基化的不均一性同样会造成糖蛋白在色谱中不能得 到良好的分离【1 们。其次，在质谱分析中，由于糖基化不均一性的影响，糖蛋白经 常表现为一簇分辨率很差的峰，得不到准确的分子量；在利用肽质量指纹图谱 ( p m f ) 法鉴定蛋白质时，同一肽段由于带有不同的糖链会表现为多个不同的质荷 比( m z ) ，从而干扰蛋白的鉴定【2 0 】；在用液相色谱一串联质谱( l c m s m s ) 法进行 蛋白质鉴定时，同一肽段的信号同样会因分散而减弱，得不到好的二级图谱。 蛋白质糖基化研究的另一个难点在于与肽相连的糖基在c i d 或p s d 的条件下 非常脆弱，p s d 或c i d 分析糖肽最常见的碎片离子对应于失去糖基后的完整肽段， 其他带糖或不带糖的碎片离子都很少见，提供的结构方面的信息很少，丢失了糖 基化位点的信息，也造成了蛋白鉴定的困难2 1 , 2 2 】。此外，糖基化程度高的蛋白特 别是那些有着成簇的0 糖链的蛋白经常对蛋白酶作用有抵抗力，造成酶解效率下 降；而且不能被考马斯亮蓝很好地染色，因而在分析时有可能被忽略【2 引。虽然估 计有超过5 0 的蛋白发生了糖基化，但现有数据库条目中只有约1 0 注释为糖蛋 白，也从另一方面反映了蛋白质糖基化研究的难度【2 4 1 。 1 3 蛋白质糖基化研究的内容和策略 全面的蛋白质糖基化分析，其研究内容与目标大致如下【1 4 】：确定蛋白糖基 化的存在与否；富集糖蛋白，即糖蛋白的分离纯化；蛋白糖基化位点糖蛋 西北大学硕士学位论文 白的鉴定；糖链结构研究：包括糖链的单糖组成，糖苷键在糖环上的连接位置； 单糖的差向异构、绝对构型以及环型，单糖的连接顺序，糖链上非糖取代基( 磷 酸基或磺酸基等) 的连接位置等糖蛋白的功能研究，即弄清糖蛋白的作用机制， 以及对生物体影响。糖蛋白的应用研究，根据糖蛋白的功能进行人工改性，以 满足人类的需要。上述目标使分析工作面临巨大的挑战，目前还没有任何一种 分析技术能解决以上所有问题。 在糖链结构解析方面应用最广泛的是质谱( m s ) 技术和核磁共振( n m r ) 技术 1 7 , 2 5 】，两种技术各有利弊，在应用中经常可以互补。近年来侧重糖蛋白中糖链部 分的分析方法有一些相关报道，但一直没有突破性的进展，当前还不具备规模化 直接分析糖链组成、结构的技术条件，这也是长期以来糖类研究滞后于核酸、蛋 白研究的一个主要原副2 们。虽然还存在许多问题和不足，蛋白质组学已经形成了 包括电泳、色谱，生物质谱及生物信息学工具在内的自成体系的一套技术平台。 以生物质谱为核心的这套体系在糖结构分析方面尽管有其局限性，但在蛋白质 多肽分析中已经取得了巨大的成功。 鉴于此，当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系分离富集糖蛋8 糖肽，酶解或化学方法除去糖链后，以糖蛋8 糖肽中的蛋8 多肽部分为重点研 究对象，消除糖基化的不均一性及其对质谱分析的影响。质量标记糖基化位点， 从而扬长避短，利用现有技术体系实现大规模高通量糖蛋白及糖基化位点的鉴 定。 2 糖蛋白质组研究技术 分析技术的进步在糖生物学发展过程中始终是直接的推动力。正是由于前所 未有的分析技术进步才最终导致了糖生物学研究的全面繁荣。蛋白质组学技术的 出现为包括糖生物学在内的许多传统学科的发展注入了新的活力，近来在蛋白质 组学背景下进行的糖生物学研究一糖蛋白组学已经取得了可喜的进展。 2 1 凝胶上糖蛋白研究技术 由于蛋白样品中糖蛋白量的有限性及糖蛋白中糖链的不均一性，应用一维或 二维凝胶电泳分离并分析糖蛋白受到了挑战。然而技术作为蛋白质组经典技术， 4 西北大学硕士学位论文 具有简便、直观、易于比较的优势【2 6 】。所以人们针对糖蛋白的一些特性，进行了 许多优化发展。市场上出现了许多基于糖高碘酸盐氧化作用，以及夹层抗体或生 物素链霉亲和素等显色方法发展起来的产品。在用双向电泳技术( 2 d e ) 分析人 乳腺癌标本中，使用植物血凝素( p h y t o h e m a g g l u t i n i n ，p h a ) 键合技术，比较了乳 腺癌与正常对照及乳腺良性疾病的糖蛋白质组的差异，发现了多个可能有意义 的糖蛋白【2 7 】。 随着荧光染色技术的发展，在同一张胶上可顺序染上不同的荧光素，通过荧 光扫描仪可将磷酸化修饰蛋白、糖基化修饰蛋白和总蛋白分别显影并进行比较 【2 8 l 。s i h l b o m 等【2 9 】通过对凝胶中糖蛋白和总蛋白的同时荧光染色技术，比较t i ；- - j 尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 患者与正常对照的2 d e 的差异，发现了有 较多糖蛋白存在不同的表达。复旦大学蛋白质组学研究中心和复旦大学附属中山 医院肝癌研究所【3 3 1 也应用凝集素亲和层析和荧光染色相结合的方法进行各种 正常及病变组织中糖蛋白图谱的研究。尽管通过多重荧光染色2 - d e 来研究蛋 白质翻译修饰的技术仍无法如同质谱技术一样显示糖蛋白结构，且不同糖形的 同一糖蛋白会在s d s p a g e 上呈现弥散的条带或在双向电泳上呈现多个深浅不 同的点，造成同一蛋白在不同的点上得到鉴定或者由于信号的分散造成较低丰度 的蛋白得不到鉴定。但其所具有简单快速，无需特别复杂仪器的优势，在对糖蛋 白差异蛋白质组学的研究中将占一席之地【3 4 j 。 2 2 糖蛋白糖肽的富集 复杂样品( 如膜蛋白、血清等) 中的蛋白往往种类繁多，且不同种蛋白间的 浓度差别较大，除极少部分蛋白含量较多外，绝大多数蛋白在样品中的浓度较低， 在糖蛋白研究中，数目繁多且很多高丰度的非糖蛋白会对糖蛋白分析造成很大影 响，因此在对糖基化蛋白质进行分析前，需要先对其进行富集。而富集方法的富 集效率及特异性对后续步骤的结果起到关键性作用。目前对糖蛋8 糖肽富集的 方法主要有以下几种： 2 2 1 层析法 2 2 1 1 凝集素亲合技术 是目前糖蛋白组学中应用最广的分离富集技术。凝集素( l e c t i n ) 是一类糖结 合蛋白的总称。它们能选择性地与特异性糖链结合，利用凝集素这种特性可以特 5 西北大学硕士学位论文 异性地富集某种糖链或糖蛋白。不同的凝集素有着针对不同糖基的特异的亲合 性，如伴刀豆凝集素( c o n 舢对甘露糖、麦胚凝集素( w g a ) 对乙酰葡糖胺 ( g i c n a c ) 、雪莲花凝集素( g n a ) 对高甘露糖型糖链有特异亲和作用等【3 5 1 。 日本学者提出一种被称为“糖捕获法( g l y c 0 1 c a t c h ) 的凝集素亲合技术，用 于糖蛋白糖肽的分离富集【3 6 】，该方法已被成功地用于商品化糖蛋白( 牛胎球蛋 白、鸡卵清蛋白、转铁蛋白) 以及简单生物线虫和鼠肝、人血清等复杂样品【1 5 ，3 9 1 。 “g l y c o c a t c h 大致包括以下几个步骤：通过凝集素亲合色谱富集糖蛋白； 所得糖蛋白利用蛋白酶酶解；酶解产物再次通过第一步的亲合色谱富集得到 糖肽；糖肽经过反相高效液相色谱分离；通过串联质谱对每一馏分里的糖肽 进行测序；根据序列信息进行数据库检索从而鉴定糖蛋白、确定糖基化位点。 该技术迄今最成功的应用是k a i i 等【”】利用伴刀豆凝集素亲合富集线虫中的糖蛋 白，利用p n g 硒ef 酶介导的稳定同位素标记n 一糖基化位点，鉴定了2 5 0 个n 一糖 蛋白，其中8 3 个是膜蛋白，同时确定了4 0 0 个n 一糖基化位点。 燃- t n 引靠弭- ，7 瓣 0 6 0 o c 鳓鼬 p r o t 蜘 m b t m m 毫= 专_ 删2 d l m c s - g l y c o p e p t i d e s h 拍 基。嘲删嗍脚镐 图1 2 凝集素富集糖肽示意图【3 5 】 f i g 1 - 2e n r i c h m e n to fg l y c o p e p t i d e su s i n g l e c t i na f f i n i t ys p e c t r o m e t r y 该法的优点主要在于实验技术相对成熟、操作简单、重复性好，各种类型糖 蛋白可分类富集。缺点主要有：凝集素成本相对较高，且单一一种凝集素并不能 够富集细胞中所有类型的糖蛋白，必须通过多种不同凝集素的组合才可分离得到 某一样品中的各种糖蛋白。 2 2 1 2 硼酸共价亲和色谱 硼酸可以与任何含有1 ，2 顺式二羟基化合物发生可逆共价作用，碱性条件下 6 西北大学硕士学位论文 共价结合，酸性条件下分解，利用硼酸的这一特性，将其固定在介质上可以对蛋 白样品中的糖蛋白糖肽进行分离富集m 1 。 在早期研究中，h a g 锄卸等h 1 1 系统的讨论了硼酸提取糖蛋白的特点及其应 用；l i a n g 等应用硼酸亲和色谱使糖基化和非糖基化的牛旺晶状体球蛋白得到 了分离；“等4 3 1 利用硼酸亲和色谱从非糖基化化合物中分离拟糖蛋白；另外，硼 酸色谱还作为高效液相亲和色谱的填充材料，用于糖蛋白的定量化研究，如应用 于糖尿病血清样本中的血清白蛋白糖基化的研究等【删；a l e xm o n z o 等将凝集 素和硼酸亲和柱混合后制备出“硼酸一凝集素亲和色谱( b l a c ) ，与糖蛋白结 合后，根据实际需要进行一次性或分步洗脱的方法富集糖蛋白，通过对标准蛋白 的富集试验，取得了理想的效果。查娟等1 利用自制的硼酸亲和色谱纯化云芝糖 肽亦取得了较好的效果。 弹器 + 翠i 等 童葛岛辞i 图1 3 硼酸亲和色谱原理图 f i g 1 - 3t h ep r i n c i p l eo fb o r o n i ca c i da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 优点：一次反应可不选择性的富集所有类型的糖蛋白，且其反应只需改变 p h ，操作简便。缺点：对糖蛋白的富集不彻底，且硼酸与蛋白间可能有非特异 性吸附作用的存在。 2 2 1 3 亲水相互作用色谱法( h i l i c ) 由于糖链具有较强的亲水性，所以很多亲水性层析介质都可应用于糖蛋白 糖肽的富集。例如，h a g g l u n d 等t 4 7 1 利用亲水性相互作用层析，l a r s 胁等【4 8 1 应用石 墨，s h m ii z u 等【4 9 】应用纤维素柱对糖肽进行富集和脱盐。 优点：操作简单，能够非选择性的富集各种类型的糖肽。缺点：该法属于非 特异性吸附，不能有效区分不同类型的糖肽，未除尽的少量非糖蛋白对后续糖基 化位点的研究有一定限制。 2 214 分子筛法富集糖肽 胰酶酶切后的糖肽分子质量比非糖基化肽明显增加。a l v a r e z m a n i l l a 等【5 0 1 发 7 西北大学硕士学位论文 现，n c b l 人类蛋白数据库中的蛋白质经胰酶理论酶切后，超过9 0 的肽段分子 质量小于2 0 0 0u 。而即使是最小的n 型糖链的分子质量也要超过1 2 0 0u ，因此糖 链对于糖基化肽分子质量的影响是显著的。他们利用分子筛的方法非选择性地对 糖肽与非糖基化肽进行分离，得到了良好的效果。 优点：该方法操作简单，能够非选择性的富集各种类型的糖肽。缺点：对酶切 的效率要求高，若酶切不完全，则未完全酶切的高分子质量片段可在很大程度上 影响糖肽的富集；属于非特异性吸附，对后续糖基化位点的研究有一定限制。 2 2 1 5 抗体亲和层析 如今已有商品化的针对某一特定结构糖链的抗体，如应用g l c n a c 的抗体对 含有o g l c n a c 的糖肽或蛋白进行富集。优点：能够针对性的研究含特定糖链结 构蛋白或肽段。缺点：费用昂贵，非特异性吸附能够造成假阳性结果。 2 2 2 化学修饰法 糖蛋8 糖肽化学修饰就是通过特异性地修饰糖蛋8 糖肽上的糖链而使糖基 化蛋白多肽被选择性地分离富集，从而可降低待研究样品的复杂程度【5 1 1 。 2 2 2 1 肼化学富集法 用酰肼试剂修饰经氧化处理过的糖是一种传统的糖化学研究方法。z h a n g 等 5 2 将这种方法应用于糖蛋白糖肽的富集。其方法大致包括以下几个步骤：氧 化，利用高碘酸将糖蛋白中糖环上的邻二醇氧化成醛基；偶联，氧化糖蛋白的 醛基与酰肼树脂上的肼通过稳定的腙键固定到载体上，洗掉非糖蛋白；蛋白 酶解，糖蛋白直接在固相载体上进行蛋白酶解，洗去非糖肽，糖肽在载体上得到 富集；同位素标记，用氘代琥珀酸酐和非氘代琥珀酸酐分别标记不同样品的a 氨基以实现质谱定量；释放，用p n g a s ef 释放载体上n 糖基化的肽，得到去 糖基化多肽：分析，用l c m s m s x i j 糖肽进行分析和数据库检索。z h a n g 等【5 2 , 5 3 】 利用此法分析细胞质膜蛋白和人血清蛋白等，初步显示了其用于血清、细胞质膜 等富含糖蛋白样品分析的优势。 8 西北大学硕士学位论文 ll n k n h li 图1 - 4 肼化学富集糖肽原理图【蛔 f i g 1 - 4t h ep r i n c i p l eo fe n r i c h i n gg l y c o p e p t i d e sb yh y d r a z i d ec h e m i s t r y 这种方法的一个优点是可以一次性不选择地富集不同类型的糖蛋白糖肽， 然后使用不同方法依次洗脱，比如用p n g a s ef 酶法释放n 糖蛋白糖肽，t 3 消 除法释放o 糖蛋白糖肽。缺点：属于化学反应，步骤多，条件较难控制。 2 2 2 21 3 消除米氏加成反应 通过1 3 消除米氏加成反应在修饰位点处连上1 个具有较强反应活性的基团 比如巯基，从而可以选择性富集目的蛋白多肽。w e l l s 等剐利用1 3 消除后d t t 或生物素戊胺米氏加成的方法使原o 糖基化位点被标记，标记后的多肽可以通过 亲合的方法富集，而且通过采用同位素标记的试剂有望实现定量和比较分析。 w e l l s 等【5 4 】利用该方法鉴定了鼠脑突触蛋白中的3 个已知和3 个新的o g l c n a c 位 点，并成功地将该方法用于核孔复合物o 糖基化分析。该方法为在蛋白质组学 的水平上进行规模化的o 一糖蛋白鉴定及o 糖基化位点确定提供了范例。 2 3 糖蛋8 糖基化位点的鉴定 2 3 1 生物质谱技术 目前用于糖蛋白糖肽的鉴定的技术主要是质谱技术。质谱法分析蛋白质的 原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场 将具有特定质量与电荷比值( m z ) 的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收 集分离的离子，确定离子的m z 值，再经质量分析器计算出蛋白质或多肽分子 质量，最后通过对数据库的搜索从而鉴定出相应的蛋白质或多肽。生物质谱法由 于它的操作简便并具有极高的灵敏度和准确度，迅速成为了生命科学研究领域的 9 西北大学硕士学位论文 重要研究工具。它能够快速、准确地提供蛋白质、核酸等生物大分子的分子量、 序列、一级结构信息乃至结构转换、修饰等方面的信息。同样，对于糖蛋白的分 析，质谱法可以克服传统的分离分析方式的局限，直接分析糖蛋白的分子量、糖 基化位点以及糖链结构。 广泛使用的质谱依据原理分为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ( m a l d i t o f m s ) t 5 5 1 和电喷雾电离离子阱质谱( e s i m s ) 【5 6 1 两种。基质辅助激光解 吸质谱灵敏度高、可操作性强且对生物样品中的无机盐和缓冲溶液具有较好包容 性，适合分析绝大多数蛋白质；电喷雾电离质谱选择性好、分析质量范围宽、样 品消耗量小、且e s i m s 分析时样品溶液是连续不断导入e s i 源内的，可以直接与 l c 对样品进行联机分离与鉴定，所以可以对复杂的蛋白质样品体系进行鉴定，包 括一些在2 d 胶中难以获得的低丰度蛋白质、极酸、极碱或是难溶的膜蛋白都可 以通过此种方法被鉴定出来。 基于质谱分析的糖蛋白糖基化位点鉴定一般先对糖基化位点进行特异的质 量标记，使之与理论质量有一个差异，然后通过质谱分析检测到这种差异，确定 为糖蛋白，进而通过m s m s 检测是在哪个氨基酸残基上发生了这种变化从而确 定糖基化位点。也可以通过检测在质谱的气相离子反应过程中由糖链引起的特定 质量变化( 比如中性丢失、特定的子离子的存在) 来鉴定样品是否发生了糖基化。 目前基于质谱的糖蛋白糖基化位点鉴定的方法如下： 2 3 2 利用糖蛋白中的非糖基化多肽鉴定糖蛋白 由于糖肽携带的糖链分子质量巨大，同时糖链能够影响肽段的离子化效率，因 此可以利用糖蛋白中的非糖基化多肽来实现对糖蛋白的鉴定。如y a n gz 等【5 7 1 应 用多种凝集素复合柱富集血清中糖蛋白后进行s d s p a g e 凝胶电泳，胶内酶切和 提取肽后进行液相色谱串联质谱分析，在质谱鉴定过程中并不考虑糖肽而只按照 常规方法进行数据库检索，最终得到5 1 个蛋白质的鉴定。 2 3 3 利用糖蛋白中的糖基化多肽鉴定糖蛋白糖基化位点 理论上，每个蛋白中的一个特异性多肽就足以完成对该蛋白的鉴定，如果这 个特异性多肽被分离出来，那么该蛋白样品的蛋白质组学图谱的复杂程度将可降 低l 至l j 2 个数量级。因此糖蛋白的鉴定就可通过分离该蛋白含有糖基化位点的多肽 来降低该蛋白酶消化液中的多肽数量，然后通过该糖肽的序列检索数据库，同时 l o 西北大学硕士学位论文 完成该糖蛋白和糖基化位点的鉴定。这就是所谓的“t o p d o w n 策略【5 2 l 。目前 该策略所用到的方法主要包括如下几种： 2 3 2 1p n g a s ef 酶法 这是目前糖蛋白组学研究中应用最为广泛的一种n 糖蛋白鉴定方法。糖肽 酶f ( p n g a s ef ) 几乎可以作用于所有的n 一糖链，同时使天冬酰胺转变为天冬氨酸 5 9 , 6 0 】，造成相对分子质量增加o 9 8 ，从而起到质量标记n 糖基化位点的作用。 另外，在利用p n g a s ef 切除糖链过程中，可加入含有同位素标记的h 2 0 1 8 ，使得 天冬酰胺转化为天冬氨酸时分子质量增加3 ，这可以使糖基化位点的鉴定更为容 易，同时可以进行定量蛋白质组和不同样品间比较的研究。p n g a s ef 去糖基化反 应的条件和胰蛋白酶几乎一致，而且可耐受一定浓度的变性剂【6 1 1 ，可以在溶液【3 7 ， 3 9 ，5 2 1 或胶 5 8 , 6 2 科1 进行顺序酶解，应用十分方便。这种方法的最大不足在于不能 区分自发脱氨基和酶促去糖基化，这2 种反应的结果是一样的，都造成n 向d 的转 化，而自发脱氨现象在样品处理中是常见的【6 5 , 6 6 】。另外，p n g a s ef 对于与天冬 酰胺相连的g 1 c n a c 上以a 1 3 连有岩藻糖( f u c o s e ) l 拘糖链不起作用【5 9 1 。 2 3 2 2e n d oh 酶法 与p n g a s ef 不同， 内切1 3 n 乙酰葡糖胺酶h ( e n d oi - i ) 在去糖基化时会将n 糖链五糖核心中与天冬酰胺相连的g l c n a c 以外的部分切除，最终糖链只剩下一 个g l c n a c 残基与天冬氨酸相连，使该天冬酰胺残基相对理论质量增加了2 0 3 ，这 就相当于给糖肽加上了一个固定分子质量的标签，使得糖肽及糖基化位点的鉴 定更近确实 6 7 , 6 8 】。e n d oh 最近被用于糖蛋白组学中规模化鉴定糖基化位点，取 得了一定的成功【4 7 1 。e n d oh 最大的不足在于其狭窄的专一性。实际上，e n d 0h 只能作用于高甘露糖型和杂合型n 糖链。另外，留在糖基化位点处的g l c n a c 在 c i d 或p s d 条件下并不稳定，经常会脱落，从而起不到标记糖基化位点的作用。 这都在很大程度上限制了它在糖蛋白鉴定中的应用。不过，可以利用其专一性和 p n g a s ef 配合使用，阐明n 糖基化发生的类型【6 9 】。 西北大学硕士学位论文 一g i c n a c f u c o s e m a n n o s e 、 鳓l i 舻黝僦莰澎b r a n c h n 厶 p n g a s ef 黔鼍曩 叁i e n d oh e n d od k m 翔3 9 8 蕊 图1 5 利用糖苷内切酶对n 糖肽的酶切反应 f i g 1 - 5t h ee n z y m a t r er e a c t i o nb e t w e e ne n d o g l y c o s i d a s e sa n dn - g l y e o p e p t i d e s a ：糖苷酶p n g a s ef 酶切释放n 糖肽；b ：糖苷酶e n d oi - i d 酶切n 糖肽 2 3 2 31 3 消除米氏加成反应 对于o 糖蛋白来说，现在还没有一种能与n 糖蛋白研究中应用的p n g a s ef 相比的酶用以实现去糖基化并同时质量标记糖基化位点，所以o 糖基化位点的标 记多采用化学法，其中报道较多的是1 3 一消除反应法。该方法基于在碱性环境中 s e r 、t h r 上的o 糖基团会发生1 3 消除形成1 个不饱和的双键，这个双键可以被亲 核试剂攻击发生加成反应，使s e r 或t h r 残基的质量相对其理论质量发生一个特定 的变化，也就是使o 糖基化位点被质量标记，而且这种质量标记在p s d 或c d 的 条件下是稳定的，从而可以通过串联质谱测序的方法得到糖基化位点的信息。 1 3 消除反应很早就被广泛应用于糖蛋白的相关研究，反应条件也不断改进， 比如极性非质子溶剂二甲基亚砜( d m s o ) 的加入起到了加快反应速度、减少蛋白 质的降解以及增强某些难溶亲核试剂的溶解性的作用【7 ”2 1 。加成反应中用的亲核 试剂因实验目的的不同而多种多样，也有1 3 消除反应完后不进行加成反应直接 分析s e r 、t h r l 拘消除反应产物2 氨基丙烯酸、2 氨基2 一丁烯酸的【7 3 1 。近几年来1 3 1 2 西北大学硕士学位论文 消除一米氏加成反应与生物质谱技术结合用于0 糖基化位点测定方面已有不少报 道，大都是针对1 个或几个糖蛋白或糖肽进行的方法学方面的研究。除了用于0 糖基化研究外，1 3 一消除米氏加成反应还更为广泛地用于磷酸化蛋白质的富集、 位点鉴定研究，相关报道远比0 糖基化研究要多，其中许多方法很值得在0 糖基 化研究中借鉴7 4 , 5 。 该方法的不足在于非糖基化或磷酸化的s e t 、t 虹残基的侧链羟基也可能发生 1 3 一消除【7 6 1 ，尤其是在较高的温度( 2 5 。c ) 和较高的碱浓度下，这是该类方法在应 用中应该注意的问题。 2 3 2 4 三氟甲基磺酸法 三氟甲基磺酸( t r i f l u o r o m e t h a n a n e s u 卜 h o n i ca c i d ，t f m s ) 法可以切除与肽链 直接相连的单糖以外的所有糖基，留下的糖基则起到标记糖基化位点的作用。该 法反应温和，速度很快，在一1 0 。c 、9 0 m m o l l 苯酚存在的条件下，无水的t f m s 可以在5m i n 内切除辣根过氧化物酶同工酶c 中8 个n - 糖基化位点的所有外围糖基 【7 7 】，且切糖后6 0 的产物仍保持活性。该法对糖基化类型没有选择性，可以作用 于所有类型的糖链，这一点对于o 一糖基化位点的标记尤为重要。其他翻译后修 饰基团如磷酸基、磺酸基、血红素及c a 、脂肪酰基以及二硫键在t f m s 去糖基 化过程中都不受影响。利用t f m s 法标记确定糖基化位点已有不少相关报道 7 8 - 8 1 】， 由于该法的温和性，这些报道多集中于蛋白质糖基化相关的构效关系研究。目前