（生理学专业论文）nr2b慢病毒载体构建和病毒生产.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：遂垒日期：! ! ! 皇 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：凇蔼导师签名： 华东师范大学磷士学位论文 脑功能基西组学研究所 n 至毪8 慢病毒载体的构建和慢病毒生产 专业生理学 研究生杨馨 指导老师胡应和 中文摘要 雷戆n a 受体由凇l 和n r 2 嚣种驻单使构成。其中k l ：【2 亚单位负责调控n 鹾d a 受体离子通道的开闭。在成年动物的前脑区域( 包括皮层、海马、杏仁体等) 只 有两种n r 2 亚单位能与n r l 组含构成n 咀受体，即n r 2 b 和n r 2 a 。离体实验中 n r l n r 2 b 复合体豹e p s p 持续辩闻明熙毙黻l n r 2 a 复合体长。n r 2 b 驻基在动物 幼年阶段表达量最高，随着动物个体的生长发育，n r 2 b 的表达量逐渐降低。这与 n 狮a 受体介导的e p s p 持续时间的下调是相一致的。大景实验数据证明，n r 2 b 甄单位与噙乎l 动物豹突触可塑性、学嚣记忆、痛觉帮神经系统痰病有关。 但到目前为止，对n r 2 b 的研究主要在啮齿动物如小鼠和大鼠中进荦亍。因此 有必要建立n r 2 b 转基因高等动物模型，以进一步研究n r 2 b 亚单位在学习记忆和 神经系统疾病中所扮演的角色，在本深题孛，我髫l 拟克隆入n r 2 b 基送的全长编 码序列c d n a ，然屉构建n r 2 b 慢病毒载体，并生产n r 2 b 慢病毒颗粒，从面为下 一步转基因高等模式动物提供条件。 方法1 采用巢式p c r ，自行设计引物扩增人n r 2 b 基因的全长编码序列c d 。 2 采用d n a 重组技术，对已克隆n r 2 b 序列中存在的突变做纠正。3 采用d n a 重 组技术，构建n l c 2 b 慢病毒载体。4 采取l 旨质体共转染的方法，在2 9 3 t 细胞中 生产慢病毒。5 采取超速离心的方法，对收获的慢病毒颗粒进行浓缩和纯化。 6 采取抗生素筛选稳定细胞克隆的方法测定病毒滴度。 华东师范大学硕士学位论文 脑功能基因组学研究所 结果 经测序扩增得到的人n r 2 b 基因的全长编码序列c d n a 中，存在两个错义 突变。用d n a 重组技术纠正这两个突变。之后的测序结果显示，突变被纠正。构 建n r 2 b 慢病毒载体，酶切结果显示n r 2 bc d n a 序列被正向插入慢病毒载体。用 2 9 3 t 生产出n r 2 b 慢病毒颗粒，经测定病毒滴度均在1 0 7 t u m l 左右。 结论 在本课题中，我们成功克隆了人n r 2 b 基因c d n a 全长的c d s 序列，利用 d n a 重组技术构建了n r 2 b 慢病毒载体，并成功生产了n r 2 b 慢病毒。这为n r 2 b 转基因高等模式动物的建立提供了物质基础。 关键词 n r 2 b ：慢病毒载体；基因克隆；d n a 重组 2 华东师范大学硕士学位论文 脑功能基因组学研究所 n r 2 bl e n t i v i r u sv e c t o r sc o n s t r u c t i o n 0 b j e c t i v e a n dl e n t i v i r u sp r o d u c t i o n a b s t r a c t n m d ar e c e p t o r sa r ec o n s i s t e do fn r la n dv a r i o u sn r 2s u b u n i t s i na d u l tf o r e b r a i nr e g i o n s ，s u c ha st h eh i p p o c 锄p u sa n dc o r t e x ， n r 2 aa n dn r 2 bs u b u n i t sa r ei n v o l v e di nt h ef o r m a t i o no ft h e r e c e p t o rc o m p l e xw i t hn r ls u b u n i t t h er e c o m b i n a n tn r l 一n r 2 b c o m p l e xs h o w s1 0 n g e re x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l s ( e p s p s ) 曲a nd o e st h e 际i n r 2 ac o m p 王e x 。 k r 2 be x p r e s s i o ni s d o w n r e g u l a t e dd u r i n gt h et r a n s i t 主o nf r o mj u v e n 主l et oa d u l 七， e o r r e l a t i n gw 主t ht h eg r a d u 8 1s h o r t e n i n go ft h ee p s pd u r 8 t i o n o ft h en 随d ac h a n n e l 。 a c c u m u l a t i n ge v i d e n c ei n d 主c a t e st h a t ， n r 2 bi sc r u c i a lf o rs y n a p t i cp l a s t i c i t y ， l e a r n i n ga n dm e m o r y a n dn e r v o u ss y s t e md e g e n e r a t i v ed i s e a s e s t og e n e r a t e t r a n s g e n i cd o ga n dh 1 0 n k e yf o r t h es t u d i e so nt 1 eb i 0 1 0 9 i c a l f u n c t i o na n dm 0 1 e c u l a rm e c h a n i s mo fn r 2 b ，w ec l o n e dh u m a nn r 2 b c d n a ， c o n s t r u c t e dt w on r 2 b1 e n t i v i r a lv e c t o r sa n dp r o d u c e d 3 华东师范大学硕士学位论文 脑功能基因组学研究所 h i g h t i t e rl e n t i v i r u s t h e s e w o r k sp r o v i d et h eb a s i sf o r g e n e r a t i n gf o r e b r a i ns p e c i f i cn r 2 bt r a n s g e n i cd o ga n dm o n k e y m e t h o d s h u m a nn r 2 bw a s 锄p l i f i e db yn e s tp c rf r o mh u m a nw h o l eb r a i nc d n a 1 i b f a r ya n di n s e r t e di n t ot w o1 e n t i v i r u sv e c t o r s t h ev e c t o r s c o n t a i ne i t h e rd o gq c a m k i ip r o m o t e ro rm o n k e ya c a m k 工i p r o m o t e r t h er e c o b i n a n t1 e n t i v i r a lv e c t o ra n d1 e n t i v i r u s p a c k a g i n gp l a s m i d sw e r ec o t r a n s f e c t e di n t o2 9 3 tc e l l sf o r 1 e n t i v i r u sp r o d u c t i o n r e s u l t sa n dc o n c l u s i o n t h en r 2 bc d n aw a sc l o n e du s i n gn e s tp c rm e t h o df r o mh u l a nb r a i n c d n a1 i b r a r ya n dc o n f i r m e db yd n as e q u e n c ea n a l y s i s ( g e n b a n k a c c e s sn m 0 0 0 8 3 4 ) t h er e c o m b i n a n tn r 2 bl e n t i v i r a lv e c t o r sw e r e s t r u c t u r a l l yc o n f i r m e db yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ea n a l y s i s h i g h t i t e r1 e n t i v i r u sw a ss u c c e s s f u l l yp r o d u c e da n du s e df o r t h eg e n e r a ti o no ft r a n s g e n i cd o ga n dm o n k e y k e yw o r d s ：n r 2 b ， 1 e n t i v i r a lv e c t o r ， g e n ec l o n i n g ，t r a n s g e n i c a n i m a l m o d e l s 4 华东师范大学硕士学位论文 脑功能基因组学研究所 引言 1 n r 2 b 基因概述 n m d a 受体是配体门控离子通道，有别于其他配体门控通道的特点是：对单价 阳离子和钙离子有高通透性；在静息膜电位时通道被胞外镁离子阻滞；其活化需 要谷氨酸和细胞膜去极化的共同作用。当突触前神经元兴奋时，神经递质谷氨酸 被释放，突触后膜上另一类谷氨酸受体删p a 受体被激活，钠离子通道开放，突触 后膜去极化。在谷氨酸和去极化的共同作用下，n m d a 受体上起拮抗作用的镁离子 被释放，钙离子经离子通道进入细胞内，激活p k c 、c a m k 等底物蛋白，从而调节 一系列的下游信号通路，参与记忆的形成“3 。 n m d a 受体由不同的亚基组成四聚体或五聚体，编码这些亚单位的基因分属3 个家族，分别命名为n r l ，n r 2 和n r 3 。其中n r 2 分四种：n r 2a ，n r 2 b ，n r 2 c 和n r 2 d 。n m d a 受体由多个n r l 皿单位和至少一种n r 2 亚单位组成。n r l 和n r 2 a 亚单位广泛分布在 成年哺乳动物的大脑中。n r 2 b 亚单位主要分布在前脑区域( 海马，皮层，杏仁体) ， 而n r 2 c 亚单位则分布于小脑，n r 2 d 亚单位分布在中脑。单独的n r 3 亚单位不能形成 功能性受体，但是它可以和n r l n r 2 聚合形成复合体，由不同的亚单位组成的受体 往往表现出不同的功能特性。1 。 离体实验显示过量表达n r l n r 2 b 复合体能使e p s p 持续时间明显延长。n r 2 b 的高表达延长了n m d a 受体的开放时间，也加强了神经元之间同步化活动的联系 ”3 。n r 2 b 亚基在动物幼年阶段表达量最高，随着动物个体的生长发育，n r 2 b 的表 达量逐渐降低“1 。这与n 佃a 受体介导的e p s p 持续时间的下调是相一致的。这可 能降低了n m d a 受体介导的可塑性，并解释了老年动物在获取新信息时更加困难的 原因，包括鸟类、猴甚至人类。研究表明，n r 2 b 亚单位与哺乳动物的突触可塑性、 学习记忆、痛觉和神经系统疾病有关。n r 2 b 亚单位缺失的新生小鼠丧失吮吸反射， 出生后很快死亡。因此，目前多采用转基因、r n a 干扰和药理学的方法对其进行 研究。 1 1 n r 2 b 基因与学习记忆 1 9 4 9 年，加拿大心理学家d o n a l do h e b b 提出一简单而影响深远的假说来 说明记忆是如何形成和存储在大脑里的，即h e b b 法则：学习和记忆是基于突触 5 华东师范丈学磺士学位论文 臃功能基因组学研究所 闻联系的增强，恧这种增强源于神经元之间的共同兴奋。或者说，突触间同步性 活动的增强导致学习记忆的增强8 1 。1 9 7 3 年， t i m o t h yv p b l i s s 和t e r j e l a m o 发现在大脑中一个形戗海马区域的神经细胞，当用高频电信号刺激对缀紧 密地联系起来了。这j 申突触闻的紧密联系，主要表现为突触后神缀元兴套性电位 ( e p s p ) 的增强，也就是目前研究学习记忆时最多的长时程增强( l t p ) ，持 续时间可达数小对、数天、甚至数星期4 1 。海马区l 评的发现是如此的令人激动， 因为长期以来海马一直被认为与记忆蛇形成有关，无论是在人类还是其他动物。 关于l t p 与学习记忆的研究从此持续升温；接下来的研究发现，用药物阻断n m d a 受体，l t p 受至抑帚并表现出学习记忆的障碍”1 ，进一步证明了l t p 与学习记忆的 关系；同时搀姒受体纳入了学习记忆研究的孰道。 钱卓及其同枣们在1 9 9 9 年生产出的转基因聪明鼠第一次给出了一个正面的 证据：在小鼠前脑区高表达n r 2 b 后导致l t p 的增强和学习记忆的增强圃。在该转 基因小鼠的基因组中被插入一段外源的序列：dc 喇一k i n 毡s ei i 癀动子启动n r 2 b 基因的表达。ac 8 m k i n a s ei i 启动子是一种可在前脑特弗性表达的启动子。免 疫组化和w e s t e r n 印迹的实验结果显示，前脑区域( 包括皮层、海马和杏仁核等 结构) 中n r 2 b 的表达量明显增加。在该转基因小甄的脑片上诱导长时稳增强 ( l t p ) ，结果发现n m d a 受体依赖性的l t p 明最增强。水迷离和恐惧条件反射等行 为学实验结果显示，转基因小鼠的学习记忆能力明显增强。 1 2n r 2 b 基因与痛觉 瘴觉过敏史之组织损伤、炎症状态或持续伤害性刺激下神经对痛的感受阕值 降低、感受性提高的一种现象。3 。目前对痛擞过敏机制的研究主要是通过脊髓水 平的中枢枫制来说明。脊髓虚用n r 2 b 的选择性拮抗剂c o n a n t o k i ng 后，在播尔 马栋、外周神经损伤模型均能产生强烈的抗伤害作用“。最薪有研究表明，在褐 尔马林诱导的大鼠痛觉模型中，脊髓处注射的小干扰r n a 能长时间抑制n r 2 b 皿 基的表达，并能明显减少该模型中与疼痛相关往的行为表现“。 1 3n r 2 b 基医与神经系统疾病 用利血平造成帕金森病大鼠模型，结果在受损伤的纹状体中，n r l 和n r 2 b 贬 单位的表达量明显降低。免疫共沉淀的结果显示，n r l n r 2 b 复合体的表达量选 择佳降低，而k r l n r 2 a 复合体不受影响“8 。同样在帕金森病大鼠模型中，用选 6 华东师范丈学硕士学位论文 藤功能基因维学研究所 择性拮抗剂i f e n p r o d i l 和e l i p r o d n 阻断n r 2 b 的功能，能明显增加动物的运动 强度“。 i u n t i n g t i n 是h u n t i n g t o n 病的致病基因，该基因的突交等| 起h u n t i n 耵o n 病。当和突变型h u n t i n g t i n 基因同时表达时，细臌表面n r l n r 2 b 型n m d a 受体 的数最增加，并且表现出更大的离子通透性“”。接下来的实验还袭明，同时表达 突变型h u n t i n g t i n 和n r l 瓜r 2 b 跫n 潲a 受体的h e k 2 9 3 细胞，在黎露于n a 时， 死予兴奋性细胞毒性的细胞数囊明显增加“”。 另有研究表明，n r 2 b 基因可能与癫痫、分裂症、a l z h e i m e r 症等有关。 总结瞳上豹实验证据，n r 2 b 基因与神经可塑性、学习与记忆、神经系统发 育及神经退行性疾病都有关系。同时由于n r 2 b 基因在神经系统发育过程中起重 要性，因此在基因组水平将其敲除，将严重影响动物的正常生长发育。如此，建 立转基因模式动物，就成为研究该基因功能的有效手段。利用转基因高等动物如 狗和猴，e 更深入研究n r 2 b 基因在学习记忆帮神经退行性疾病中的作用。 但与转基因小鼠不同，转基因高等动物的建立在目前还不普遍，寓践中也 存在难点， t 如胚胎数目少且不容易获得。这样一来就需要运用商效率的转綦因 技术。慢病毒系统是很好的选择，这套系统融经被证明熊褒效率的生产转基因小 鼠，并能成功的生产转基因牛和猴等高等哺乳动物。 2 慢病毒系统概述 常用的病毒载体包括：单纯疱疹病毒载体，腺病毒载体，腺相关瘸毒载体 ( a d e n o a s s o c i a t e dv i r u s ，从v ) 和慢病毒载体。其中从v 和慢病毒载体的特点 是能作蔫子非分裂相细胞，雨嚣能与宿主细胞基因组发生蕤合。“。但当斑用于整 体动物时，a a v 会被机体内本身存在的a a v 抗体识划并发生免疫反应，从而冉弱 了a a v 转导基因的效率“”。慢瘸毒载体不存在这样的问题，它能在大鼠和恒河猴 的脑内实现长期稳定的外源基因表达，同时不弓i 起明显豹免疫反应。“。 慢病毒包括多种灵长类幔病毒和非灵长类慢病毒。慢病毒经过改造成为熳病 毒载体，改造的目的主要是提高生物安全性、以及增加外源基因的表达效率。经 改造的病毒颗粒既保留了高效感染和憨合的特性，又避免了病毒复制对细胞的伤 害。”。慢瘸毒载体系统熊在 分裂楱的哺乳动物细胞中实现稳定的外源基因表 7 华东师范大学硕士学位论文 脑功能基因组学研究所 达，比如原代培养的神经元和大鼠纤维原细胞。“。用于生产转基因动物时，慢病 毒载体的效率远高于传统的显微注射法啪1 。慢病毒载体还能在实验动物在体细胞 中实现外源基因的稳定表达，如神经元、神经胶质细胞和视网膜细胞“3 - “3 。 慢病毒的工作原理 2 1 慢病毒系统的组成 各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同。以h i v l ( 人类免疫缺陷病毒i 型) 慢病毒载体系统为例，它由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分 能够提供生产病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则包括了将在宿主细胞内表达的 目的基因。将包括载体成分和包装成分的三个或四个质粒共转染细胞，即可从细 胞上清收获具有感染能力、无复制能力、携带目的基因的h i v l 慢病毒载体颗粒。 2 2 慢病毒系统与转基因动物 制作转基因动物的传统方法是显微注射法。具体操作时，将纯化的d n a 片段 微量注射到受精卵的原核中。经过随机的同源重组，该d n a 片段被整合入该受精 卵的基因组序列中。由这种受精卵得到的动物就有可能是转基因动物。显微注射 法多用于制作转基因小鼠。原因主要有两点：第一，小鼠受精卵的原核比较清晰， 易于进行显微操作。第二，小鼠排卵的数量大，繁殖周期短，能够弥补显微注射 法效率较低的弱点。 用慢病毒系统制作转基因动物是比较新的方法。慢病毒颗粒能主动吸附到宿 主细胞表面，继而进入细胞质内；利用自身携带的逆转录酶，将病毒r n a 基因组 转变为双链的d n a 序列；然后在整合酶的作用下，该双链d n a 序列成为宿主基因 组的一部分。由于慢病毒系统之产生没有复制能力的病毒颗粒，因此使用该系统 8 华东j l i | i 范大学预士学位论文 齄功能基霹组学研究所 只能犍外源基因引入细胞基因组，但同时又不会因为新病毒颗粒的生成丽破坏细 胞。用慢瘸毒系统制作转基因动物可以采取两种方式：盛接感染法和注射法。 直接感染法，是将受精卵与病毒颗粒蓑培养，病毒嗣用自身的吸附能力送入细胞。 注射法，是闵显微注射的方式将病毒颗粒注入细胞附近或细胞内( 不一定是原核 内) 。就生产转基因动物的效率而言，注射法的效率较高。但直接感染法的优点 在于，对细胞的伤害性小且不需要特殊的设备。 2 0 0 2 霉的一篇s c i e n c e 文章证明，慢瘸毒载体能用予高效生产转基因小鼠 和犬鼠。“。当使用注射法将慢病毒颗粒注射到卵周间隙( 卵母细胞和透明带之间) 时，转基因小鼠的阳性率可达8 0 以上。而当使用崴接感染法时，转基因小鼠的 阳性率约在2 0 9 6 左在。当注射法生产转基因大鼠时，阳性率也在4 0 左右。另外 如果在慢病毒载体中使用组织特异性的启动子，就能实现特异组织中外源基因的 表达。例如使用骨骼肌特异性或t 淋巴细胞特异性的启动予，就能实现在相应组 织中g f p 蛋鑫的表达，面其他缎织不受影嚷。”。 除转基因小鼠和大展，慢病毒系统也用于其他哺乳动物，比如转基因猴、猪 和牛等。在2 0 0 1 年的一篇p n a s 文章中，幔痫毒系统被用于将外源基因( 绿色荧 光蛋白，g f p ) 弓l 入恒河猴胚脍。”。该胚胎由体外受糖的方法褥到，经慢瘸毒感 染后褥被移植到受体母亲体内。病毒感染具体采取的是胚胎注射的方式，对七天 左右的恒河猴胚胎注射含有慢病毒颗粒的培养基( 该培养基未经超速离心) ，。该 研究中，六只受钵猴接受了胚胎移檀，其中甄只成功怀孕。甄只痞孕的受体猴在 移植后约1 5 0 天左右，各生下一只小猴。g f p 的抗体检钡4 结果证明，在所有被移 植的胚胎及新生慎河猴中均有外源基因g f p 的表达。慢病毒系统还被用于转基因 牛m 1 。体接受捧器争题胎被注入幔病毒颞粒。该研究季导到4 只表达外源基因豹转 基因牛。慢病毒系统还能实现人胚胎干细胞中外源基因的大量表达。“。 综上所述，当用于转基因动物时，慢病毒的主要优势在于阳性率高，以及可 操 筝性强。这种方法尤其逶用予转基因裹等动物的刨作。 2 3 慢病毒系统与r n a 干扰 慢病毒载体介导r n a 干扰，就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与r n a 干扰特异佼抑制同源基因表达的作用相结合。慢病毒r n a 干扰的表达载体有两 类：类分翻转蒙有义r 和反义r n a ，两条链在缨腿内互李 结合生成s i r n a ； 9 华东师范大学硕士学位论文 脑功能基因组学研究所 另一类则转录短发卡r n a ( s h o r th a i r p i nr n a ，s h r n a ) 。后者更加常用，其结 构主要由慢病毒载体骨架和s h r n a 表达框组成。s h r n a 表达框主要包括：r n a 聚 合酶i i i ( r n ap 0 1 y m e r a s ei i i ，p o l i i i ) 依赖的启动子、s h r n a 结构序列以及 终止子。其中，s h r n a 结构序列由两段互补序列相向组成，两段序列之间有4 1 0 个碱基的中间序列。慢病毒感染细胞后，将此s h r n a 表达框接合进宿主细胞 基因组。s h r n a 在宿主细胞被转录后，两段互补序列碱基配对结合，中间序列则 成为茎环结构。茎环结构可被d i c e r 酶识别并切除，产生的s i r n a 将执行r n a 干扰”1 。慢病毒介导的r n a 干扰能在各类细胞中稳定抑制同源基因的表达。该技 术被应用于基因功能研究，也能成为基因治疗的新手段。 。洒赢画矗7 嘏、 磷一一 卅乳壹塑必融虞 牲靴o 慢病毒介导r n a 干扰 华东j i | i 范大学硕士学位论文 3 本课题研究工作 耱功能基蠢组学研究所 本课题研究工作属于国家9 7 3 计划( 国家熏点纂础研究发展计划) “转基因 高等动物的创建与高级脑功能分析”项目的一个组成部分。该项嗣的主要内容为 转基嚣高等动物的创建与蔫级骊功能分柝。 本课题研究工作主要分为三步：第一，n r 2 b 基因的克隆。第二，转基因狗 和猴n r 2 b 慢病毒载体的构建。第三，转基因狗和猴n r 2 b 慢病毒的生产、纯化与 鉴定。 n r 2 b 基因包括多个内含子，所以需从c d n a 文库中钓取。n r 2 b 的c d n a 全长 约4 5 k b 。由于关系大量的后期工作，必须保证该纂因序列的绝对正确。如果克 隆的序列中存在镄义突变，需要进行绸正。 转基因狗和猴n r 2 b 慢病毒载体的构建，就是在慢病毒载体中用狗和猴的 c a m k i n a s ei i 启动子启动n r 2 b 基因的表达。由于两种质粒的长度都在1 0 k b 左右，克隆存在难度。因此有必要采敬高效率的转亿方法，吃如电击转化。 关于慢病毒的生产、纯化和鉴定。由于这项工作在本所是首次展开，因此花 费的时间较长。 本课题豹根本目的是得到离漉度的转基因狗和猴n r 2 b 幔病毒，为转基因狗 和猴的获褥提供条件。到目前为止，这一目标已经被实现。接下来的工作将是进 一步利用慢病毒系统。 华东师范大学硕士学位论文 1 材料 1 1 药品、试剂和仪器设备 材料和方法 脑功能基因组学研究所 h u m a nb r a i nw h o l em a r a t h o n r e a d yc d n a 购自c l o n t e c h 公司；t 4 连接酶、 l i p o f e c t 锄i n e 2 0 0 0 、b 1 a s t i c i d i n 购自i n v i t r o g e n 公司；l at a q 酶、各种限制 性内切酶购自t a k a r a 公司；p g e m te a s yv e c t o r 购自p r o m e g a 公司；b da d v a n t a g e 2p c re n z y m es y s t e m 购自b d 公司。 p c r 扩增仪p t c 一2 0 0 ，m jr e s e a r c h 公司；台式离心机、电转仪，e p p e n d o r f 公司；a v a n t ij 2 5 高速离心机、x p 一8 0 超速离心机，b e c h m e n 公司。 1 2 细胞株 h e k 2 9 3 t 、c h o ，购自中科院细胞所。h e k 2 9 3 t 细胞培养基为d m e m ，i n v i t r o g e n ： c h o 细胞培养基为r p m l l 6 4 0 ，i n v i t r o g e n 。细胞培养条件为3 7 ，5 c 0 。培养 基中均添加1 0 0 u g m l 卡那霉素、5 0 u m 1 链霉素和2 9 几碳酸钠，并添加1 0 胎 牛血清。 1 3 菌种和质粒 ec d jt o p l o f 购自t a k a r a 公司。p g e m te a s yv e c t o rs y s t e m 贝日自 p r o m e g a ；p c d n a 3 1 载体购自c l o n t e c h 公司；v i r a p o w e rl e n t i v i r a le x p r e s s i o n s y s t e m 购自i n v i t r o g e n 公司；d o g c a 蛐( i i p 一1 e n t i 、m o n k e y c a m i ( i i p l e n t i 质粒 为本实验室其他成员构建。 1 2 华东翔范大学颈士学位论文 2 方法 2 1n r 2 b 基因的克隆、序列分析 2 1 1 重叠p c r 貔功能基医组学研究矫 用软件”i m e r p r e m i e r5 o ，针对人的n r 2 bc d n a 序列( n c b i n m0 0 0 8 3 4 ) 设计两对特异性的引物：n r 2 8 1 9 9 n r 2 8 2 3 4 9 ：n r 2 8 2 2 3 4 n r 2 8 4 8 9 0 ；n r 2 8 2 2 5 8 n r 2 8 4 7 4 9 。 n r 2 8 1 9 95 a c ga g tt g aa g cc c ag a gc g3 n r 2 8 2 3 4 9 n r 2 8 2 2 3 4 n r 2 8 4 8 9 0 n r 2 8 2 2 5 8 n r 2 8 4 7 4 9 l 鳄 5 c a ce c ct c tg g tt g aa c t 啊ce c at g3 5 t g ac t tc t ca c ce e ct t tc e ge t tt g3 5 t g ac a gc g gg g gg 从g a ag g ag a ga a 3 5 t g gg a cc g c ce a ac g gc a gc a ca g 3 5 a e ee c cg t ca c cc t cc g t 强ca t gc g3 一 4 9 + _ l _ 一 2 2 j g4 7 姆 职2 b 弓i 物设计位点n r 2 b 瓣漤踺为2 1 0 b p 4 6 6 4 b p ，以上图中各个数字均代表所设计g 物的起始位点。其中2 2 5 8 2 3 4 9 为重叠处并有唯一s p h l 酶切位点。 以h u m a nb r a i n 冉h o l em a r a t h o n r e a d yc d n a 为模投，用弓l 物n r 2 8 1 9 9 、 n r 2 8 4 8 9 0 扩增n r 2 b 基因。在2 5 u l p c r 反应体系中，含有2 u l c d n a 模板， 1 0 n 瓣r i s - h c l ( p h8 3 ) ，5 0 磷k c l ，1 5 确m g c l2 ，o 5 蒯d n t p ，o 5 删每对引物和 l u 的l at a qd n a 聚合酶。用t o u c h d o w np c r 的方法：9 4 l 畦n ：9 4 5 s e c ，7 2 5 m i n5 c y c l e s ：9 4 5 s e c ，7 0 5 m i n5c y c l e s ：9 4 5 s e c6 8 5 m i n2 5 c y c l e s 。由于n r 2 b 基因较长，k r 扩增始终得不到日得条带。 p c r 分别扩域n r 2 b 基因藏后两段。第一段：1 9 9 b p 一2 3 4 9 b p ；第二段： 2 2 3 4 b p 一4 8 9 0 b p 。其中第二段p c r 扩增后不能得到目的条带，于是采用引物 n r 2 8 2 2 5 8 n r 2 8 4 7 4 9 ，以第二段2 2 3 4 b p 一4 8 9 0 b pp c r 产物s m e a r 为模板，得到 曩的条带。前后两段p c r 产物与t 载体连接，将酶切鉴定正确的转化子各取一个 1 3 华东师范大学硕士学位论文 脑功能基因组学研究所 置一7 0 保存，分别命名：n r 2 8 2 1 t 和n r 2 8 2 5 t 。 重叠p c r ： 以1 9 9 b p 一2 3 4 9 b p ，和2 2 5 8 b p 一4 7 4 9 b p 两段p c r 产物共同作为模 板，以n r 2 8 1 9 9 n r 2 8 4 7 4 9 作为引物，得到全段n r 2 b 目的条带。p c r 程序为： 9 4 1 0 m i n ：9 4 5 s e c ，7 2 1 7 m i n5 c y c l e s ：9 4 5 s e c ，7 0 1 7 m i n5 c y c l e s ：9 4 5 s e c6 8 1 7 m i n2 5c y c l e s 。重叠p c r 得到的n r 2 b 连t 载体，将 酶切鉴定正确的一个转化子测序并置一7 0 保存，命名：n r 2 b 重叠一t 。 2 1 2 巢式p c r 将重叠p c r 得到的n r 2 b 克隆测序，碱基突变大于2 0 个。故重新采用巢式p c r 方法，以h u m a nb r a i n w h 0 1 em a r a t h o n r e a d yc d n a 为模板，n r 2 8 1 2 1 n r 2 8 4 8 9 0 、 n r 2 8 1 9 9 n r 2 8 4 7 4 9 扩增n r 2 b 基因。 n r 2 8 1 2 l5 g g ga c tg g ac a tt c cc 从c a tg c tc a 3 n r 2 8 4 8 9 05 t g ac a gc g gg g gg 从g a ag g ag a g 从3 n r 2 8 1 9 95 a c ga g tt g aa g cc c ag a gc g3 n r 2 8 4 7 4 95 a c cc c cg t ca c cc t cc g tg a ca t gc g3 用n r 2 8 1 2 1 n r 2 8 4 8 9 0 做p c r 扩增后，在以p c r 产物为模板。在2 5 u 1 p c r 反应体系中，加入前一步p c r 产物o 5 u l ，用n r 2 8 1 9 9 n r 2 8 4 7 4 9 引物继续扩 增。得到单一的n r 2 b 条带。巢式p c r 得到的n r 2 b 连t 载体，将酶切鉴定正确的 一个转化子测序并置一7 0 保存，命名：n r 2 b 巢式一t 。 2 1 3t 载体连接和连接产物的转化 取p c r 产物1 u 11 凝胶电泳，观察条带大小。其余p c r 产物按p c rc l e a n u p 试剂盒纯化。纯化后产物连入p g e m _ te a s yv e c t o r ( o 5 mtv e c t o r ，o 5 lt 4 连接酶，4 肛l 纯化产物，5 斗1b u f f e r ) ，室温连接2 h 。 在已经加好的氨苄抗性的l b 培养板上涂上4 0 m x - g a l ，7 斗li p t g ，3 7 孵育 4 h 后使用。从一7 0 冰箱中取感受态t o p l o f 两个e p 管( 1 0 0 眦管) ，分别加入 己构建的p g e m te a s y n r 2 b 质粒溶液1 0 肛1 ，冰浴3 0 m i n ，4 2 水浴9 0 s ，冰 浴2 m i n 后再加s o c 培养基( 去m g “) 9 0 0 肛1 ，3 7 摇菌1 2 0 r m i n1 h 后，3 0 0 0 9 m i n 离心2 m i n ，弃上清，加s 0 c 培养基( 无m g ”) 1 0 0 斗l 重悬菌块，取5 0 肛1 涂板( 具 有氨苄抗性的2 琼脂x g a ll b 培养板) ，放3 7 孵育箱过夜。 1 4 华东师范大学硕士学位论文 2 1 4 转化子鉴定 脑功能基因组学研究所 在长满蓝白斑x g a ll b 培养板上，挑白色单菌置于加氨苄的l b 培养基中 ( 3 m l 试管) ，3 7 摇过夜，1 2 1 6 h 后，用m i n i p r e p 的日常型质粒d n a 纯化试 剂盒抽提质粒d n a 。用v e c t o rn i t 分析目的基因片段序列和测序序列上存在的 酶切位点，结合相应的质粒载体上多克隆位点上的酶切位点，选择合适的限制性 内切酶( e c o r l 、s p h l 、p s t l ) 对抽提出来的质粒进行酶切。并用1 琼脂糖凝胶 电泳分析。将酶切鉴定结果符合预测的质粒测全序。 2 2n r 2 b 基因的突变纠正 n r 2 b 巢式一t 的测序结果显示，n r 2 b 全序列中存在两个错义突变，分别位于 8 0 2 b p 和2 1 0 6 b p 处( 以n r 2 b c d n a 序列的a t g 为1 ) 。测序结果分析n r 2 8 2 1 t 5 0 0 b p 一1 2 0 0 b p 段和1 4 0 0 b p 一2 3 4 0 b p 段序列完全正确。对n r 2 b 全序列进行酶切 位点分析得出：b s t p i1 5 0 4 ，2 3 0 8 ；h i n d i i i5 2 3 ：f b a i1 0 8 0 。故可应用酶切连 接的方法纠正n r 2 b 巢式一t 上n r 2 b 序列的突变。 2 2 1 酶切与连接 用b s t p l 分别酶切n r 2 b 巢式一t 和n r 2 8 2 1 t ，酶切产物凝胶电泳，取目的条 带纯化，并去磷酸化后，t 4 连接酶1 6 连接4 h 。用h i n d i i i 和f b a l 分别酶切 n r 2 b 巢式一t 和n r 2 8 2 1 t ，酶切产物凝胶电泳，取目的条带纯化，t 4 连接酶1 6 连接4 h 。 2 2 2 电击转化大肠杆菌 相比较化学方法制取转化态细胞，电击转化的转化效率很高，可以达到 1 0 。c l o n e u g 。电击转化的原理是在强电流作用下将夕 源d n a 介导入大肠杆菌内。 从新鲜的琼脂板上挑取一个t o p l 0 f 单菌落，接种于5 0 m l l b 培养基中。 3 7 ，2 0 0 r m i n 培养。当o d 6 0 0 的值达到o 4 时，将细菌转移到离心管中4 ， l o o o g ，离心1 5 i n 。弃上清，加2 5 m 1 冰冷纯水重悬；4 ，1 0 0 0 9 ，离心1 5 m i n 。 重复这一步骤。离心后，弃上清，用1 m 1 冰冷纯水重悬。将悬液置于电击杯中， 加连接产物1 u l ，采用电压2 0 0 0 v ，电击后加入新鲜s o d 培养基。电击产物 1 2 0 r m i n ，1 h 。取2 0 0 m 涂板( 具有氨苄抗性的2 琼脂l b 培养板) ，放3 7 孵 育箱过夜。转化子酶切鉴定并测序。 1 5 华东师范大学硕士学位论文 2 3n r 2 b 慢病毒载体的构建 脑功能基因组学研究所 n r 2 b 巢式一t 突变纠正后，由本实验室其他同学做构建，将n r 2 b 基因连接入 p c d n a 3 1 载体，得至0p c d n a 3 1 一n r 2 b 。 d o g c a m k i i p l e n t i 、m o n k e y c a m k i i p l e n t i 质粒为本实验室其他成员构建。 对原l e n t i v i r u s 载体进行改造将c 吖启动子替换成狗和猴的c a m k i i 启动子，便 得到d o g c a m l ( i i p l e n t i 、m o n k e y c a m k i i p l e n t i 质粒。 将p c d n a 3 卜n r 2 b 和m o n k e y c a m k i i p l e n t i 用x h o i 和b a f f l h i 双酶切，酶切 产物凝胶电泳，取目的条带纯化，t 4 连接酶1 6 连接4 h 。连接产物电转入大肠 杆菌。涂板过夜，挑单克隆，转化子酶切鉴定，得到m o n k e y c a m k i i p l e n t i n r 2 b 。 将p c d n a 3 卜n r 2 b 和d o g c a ( i i p l e n t i 用e c o r v 和n h e i 双酶切，酶切产物 凝胶电泳，取目的条带纯化，t 4 连接酶1 6 连接4 h 。连接产物电转入大肠杆菌。 涂板过夜，挑单克隆，转化子酶切鉴定，得到d o g c a ( i i p _ 1 e n t i n r 2 b 。 2 4 病毒的生产、纯化和鉴定 2 4 1 用1 i p o f e c t 锄i n e 转染2 9 3 t 细胞 转染前一天，胰酶消化2 9 3 t 细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为 9 0 。使用1 0 c m 细胞培养板时，细胞铺板在1 0 m l 含f b sl o ，不含抗生素d m e m 培养基中。对于每板细胞，使用1 m 1o p t i m e mi 培养基稀释1 2 u gd n a ( 含 3 u g l e n ti v i r u s 表达质粒和9 u g 混合包装质粒) 。对于每板细胞，使用1 m l o p t i m e m 培养基稀释3 6 u ll i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 试剂。l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 稀 释后，在5 m i n 后同稀释的d n a 混合。混合溶液室温保温2 0 分钟。直接将混合溶 液加入到每板中，摇动培养板，轻轻混匀。在3 7 ，5 的c 0 2 中保温4 8 h 。 2 4 2 病毒上清的收集、浓缩与纯化 转染4 8 h 后取细胞上清，1 0 0 0 9 m i n 离心1 0 m i n 。收集上清至离心管。超 速离心5 0 0 0 0 9 m i n ，9 0 m i n 。弃上清，加入1 0 m