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中山大学硕士学位论文 应用酵母双杂交技术分析b r d 7 与人类 d n a 复制起始蛋白的相互作用 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：邬镝力 指导老师：梁纯教授 陆勇军副教授 摘要 在真核细胞中，d n a 的复制被严格的调控，以确保遗传物质传递的保真性。 d n a 复制起始的控制机制确保了d n a 在一个细胞周期中只能被复制一次， 使d n a 的合成被严格地控制在s 期。目前已被发现的人类d n a 复制起始蛋 白大约有2 0 个。a d 2 4 蛋白是酿酒酵母n o t 3 在人类的同源蛋白，参与了人类 细胞的d n a 复制的起始。通过酵母双杂交等方法，可以筛选到更多与复制起始 相关的蛋白。b r d 7 便是通过这一方法，从人类卵巢上皮细胞c d n a 文库中筛 选到的与a d 2 4 相互作用的蛋白。本文通过酵母双杂交系统，观察b r d 7 与其 他人类复制起始蛋白的相互作用，进一步验证b r d 7 确实与d n a 复制起始相 关。 在本文的酵母双杂交系统中，b r d 7 基因首先与带有g a l 4 转录激活域( a d ) 的p a c t 2 质粒融合，构建成“猎物”( p r e y ) ，a d 2 4 等1 4 种人类复制起始 蛋白则与带有g a l 4d n a 结合域( b d ) 的p g b k t 7 质粒融合而成为“诱 饵”( b a i t ) 。结果发现除了a d 2 4 外，还有o r c i ，o r c 4 ，o r c 5 和m c m 2 这四 个蛋白与b r d 7 有相互作用。随后，本文还将b r d 7 基因构建到p g b k t 7 质粒 上成为“诱饵”( b a i t ) ，观察其与作为“猎物”( p r e y ) 的上述5 个蛋白的相互作用。 应用酵母双杂交技术分析b r d 7 与人类d n a 复制起始蛋白的相互作用 为了进一步了解b r d 7 与这些蛋白相互作用的细节，本文还构建了含有b r d 7 分段片断的p g a d t 7 融合质粒作为孑昔物”( p r q ) ，与这5 个蛋白进行酵母双杂交 实验，从而确定究竟是b r d 7 的哪一部分参与到了与这些蛋白的相互作用中。 经过分析，无论是作为嘴物”( p r e y ) 还是“诱饵”( b a i t ) ，b r d 7 与人类蛋白 的5 个蛋白都存在较强的相互作用。而分段研究的结果则揭示了b r d 7 与这些 蛋白相互作用的区域，其中与c 端相互作用的只有0 r c 4 ，m c m 2 与o r c 5 这三 个蛋白。以上结果提示b r d 7 可能通过各个不同区域与不同d n a 复制起始蛋白 的结合，而在人类d n a 复制起始前复合物中扮演“组织者”或“协调者”的角 色。 关键字：d n a 复制起始；酵母双杂交：b r d 7 中山大学硕士学位论文 a n a l y s i so f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb r d 7 a n dt h eh u m a nd n a r e p l i c a t i o ni n i t i a t i o np r o t e i n su s i n gt h ey e a s tt w o h y b r i ds y s t e m m a j o r ：b i o c h e m i s t r y & m o l e c u l a rb i o l o g y n a l t l e ：w ud i l i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl i a n g c h u n a s s o c i a t ep r o f e s s o rl uy o n g j u n a b s t r a c t i ne u k a r y o t i cc e l l s ，d n ar e p l i c a t i o ni st i g h t l yr e a t e d e n s u r i n gt h ef i d e l 时o fi n h e r i t a n c e 0 ft h eg e n e t i cm a t e r i a l t h ei n i t i a t i o nc o n t r o lo fd n ar e p l i c a t i o ng u a r a n t e e st h a td n a r e p l i c a t i o nh a p p e n so n l yo n c ep e rc e l lc y c l ea n ds t r i c t l yw i t h i nsp h a s e i nh u m a n c e l l st h en u m b e ro fp r o t e i n st h a th a v eb e e np r o v e dt oh ei n v o l v e di nd n a r e p l i c a t i o n i sa b o u t2 0 b r d 7h a sb e e nf o u n dt oi n t e r a c tw i t ha d 2 4p r o t e i n , t h eh u m a nh o m o l o g o fy e a s tn o c 3 pw h i c hh a sb e e np r o v e dt ob eo n eo ft h ed n ar e p l i c a t i o ni n i t i a t i o n p r o t e i n su s i n gy e a s tt w o h y b r i dm e t h o d t of u r t h e rc o n f n - mt h a tb r d 7 i si n v o l v e di n t h ei n i t i a t i o no fd n a r e p l i c a t i o n , t h ey e a s tt w o h y b r i ds y s t e mw a su s e da g a i nt o i d e n t i f yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb r d 7a n dt h eo t h e rd n ar e p l i c a t i o ni n i t i a t i o n p r o t e i n s b r d 7w i l t sf j r s tc o n s t r u c t e da s p r e y s b yb e i n gi n s e r t e di np a c t 2 w h i c hc a r r i e s t h eg a l 4d n aa c t i v a t i o nd o m a i n w h i l ea d 2 4a n dt h eo t h e r1 3k n o w nd n a r e p l i c a t i o ni n i t i a t i o np r o t e i n sw e r ei n s e r t e di n t ot h ep g b k t 7v e c t o r , w h i c hc a r r i e st h e g a l 4d n a b i n d i n gd o m a i n ，t oc o n s t r u c tt h e b a i t t h r o u g ht h i se x p e r i m e n t ，w e 应用酵母双杂交技术分析b r d 7 与人类d n a 复制起始蛋白的相互作用 f o u n d4p r o t e i n s ，o r c l ，o r c a ，o l 5a n dm c m 2 ，b e s i d ea d 2 4 ，i n t e r a c tw i t h b r d 7 w ea l s oc o n s t r u c t e db r d 7a st h e b a i t t o 蛳i fi ts t i l li n t e r a c t sw i t ht h e s e5 p r o t e i n sc o n s t r u c t e da st h e p r e y s t oi d e n t i e yt h ed e t a i l so ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n b r d 7a n dt h e s ep r o t e i n s , w ea l s oc o n s t r u c t e dt r u n c a t e db r d 7 p r e y s a n do b s e r v e t h e i ri n t e r a c t i o n sw i t ht h e5p r o t e i n s w ef o u n dt h a tb r d 7i n t e r a c t sw i t h5o ft h e h u m a nd n aa sab a i t o ra p r e y s 1 1 忙r e s u l t so ft h et r u n c a t i o ne x p e r i m e n t s i d e n t i f i e dt h es e c t i o no fb r d 7i n v o l v e di nt h ei n t e r a c t i o n so ft h e s ep r o t e i n s ：t h e c t e r m i n a lo n l yi n t e r a c t sw i t ho r c 4 ，m c m 2a n do r c 5 b a s e do i lt h e s er e s u l t s ，w e s u g g e s tt h a tb r d 7p r o b a b l yi n t e r a c t sd i f f e r e n tp r o t e i n sw i t hd i f f e r e n tr e g i o n s , t h u s p l a y sa r o l eo f o r g a n i z e r o r m e d i a t o r i nt h ep r o c e s so f d n a r e p l i c a t i o ni nh u m a n c e l l s k e yw o r d s ：i n i t i a t i o no f d n ar e p l i c a t i o n ；y e a s tt w o h y b r i d ；b r d 7 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导 师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文 中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承 担。 学位论文作者签名： 乌i ；车南力 日期：三。哆年1 2 月7 e t 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的 规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或 其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论 文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书 馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有 关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保 存学位论文。 学位论文作者签名：籀畜力导师签名：了 日期：加0 7 年t 2 - ) l7 日日期：6 ) 年f 湖7 日 中山大学硕士学位论文 1 1d n a 复制的起始 第1 章前言 细胞周期是指细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子 细胞结束所经历的过程。细胞周期分为两个主要的时期：分裂期( m 期，m i t o s i s p h a s e ) 和分裂间期( i n t e r p h a s e ) 。m 期包括细胞的核分裂和胞质分裂两个过程。 分裂间期实际上是新细胞的生长期，可分为g 1 期( g a p i ) 、s 期( 即d n a 合成 期d n as y n t h e s i sp h a s e ) 、g 2 期( g a p 2 ) 。在正常情况下，一个完整的细胞周期 沿着g 1 s g 2 m 的路线运转。 主要有两个事件控制着细胞周期：第一个是对d n a 复制起始的控制，发生 在g 1 期和s 期之间；第二个是对染色体凝集的控制，发生在g 2 和m 期之间。 d n a 复制起始的控制机制确保了d n a 在一个细胞周期中只能被复制一次，并 且使d n a 的合成被严格地控制在s 期：在g 2 期d n a 复制完成后，d n a 的合 成就受到禁f l ：( l i a n ga n ds t i l l m a n , 1 9 9 7 ) 。没有这个过程或者此过程发生变化，多 倍体或者染色体不稳定等使细胞致死的现象就会发生 1 2 酿酒酵母的d n a 复制起始 1 2 1 酿酒酵母的d n a 复制起始蛋白 对d n a 复制起始的了解多来自对单细胞真核模式生物酿酒酵母 ( s a c c h r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 筘j 研究。酿酒酵母的复制起始位点称为自主复制序列 ( a u t o n o m o u s l yr e p l i c a t m gs e q u e n c e s , a r s ) ( n e w l o n e ta l , 1 9 9 3 ) 。在细胞周期的不 同阶段，复制起始位点上存在3 种复制蛋白复合物( d i f f i e y c ta 1 ，1 9 9 4 ) ：m 后期 应用酵母双杂交技术分析b r d 7 与人类d n a 复制起始蛋白的相互作用 到g 1 期的复制前复合物( p r e r e p l i c a t i o nc o m p l e x , p r e - - r c ) ，g 1 期和g 1 s 期 的起始前复合物( p r e i n i t i a t i o nc o m p l e x , p r e - - i c ) ，s 、( 3 2 和m 期的复制后复合 物( p o s t - r e p l i c a t i o nc o m p l e x , p o s t - - r c ) 。 复制原点识别复合物( o r i g i ar e c o g n i t i o nc o m p l e x , o r c i 一6 p ) 在整个细胞周 期中都与酿酒酵母复制原点结合，是其他d n a 复制起始蛋白的一个装载平台 ( d i f f l e ye ta 1 ，1 9 9 4 ；c o c k e re ta t , 1 9 9 6 ；a p a r i c i oe ta l ，1 9 9 7 ；l i a n ga n ds t i l l m a n , 1 9 9 7 ；d o n o v a n e ta 1 ，1 9 9 7 ；t a n a k ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 细胞分裂周期蛋白6 ( c e l ld e v i s i o nc y c l ep r o t e i n6 ，c d e 6 p ) 和o r c 的相互 作用调整了o r c 与d n a 结合的活性( m i z u s h i m ae ta t ，2 0 0 0 ) ；同时o r c c d c 6 p 复合物和n o c 3 p 、c d t l p 一起募集m c m 蛋白，在复制起始位点形成p r e r c ( l i a n g e ta 1 ，1 9 9 5 ；c o c k e re ta 1 ，1 9 9 6 ；s a n t o c a n a l ea n dd i f f l e y , 1 9 9 6 ；a p a r i c i oe ta l ，1 9 9 7 ； l i a n ga n ds t i l l m a n , 1 9 9 7 ；t a n a k ae ta l ，1 9 9 7 ；w e i n r e i c he ta l ，1 9 9 9 ；z h a n ge t a 1 ，2 0 0 2 ) 。在细胞周期中c d c 6 p 的活性受到严格的控制( s a n c h e ze ta 1 ，1 9 9 9 ； e l s a s s e re ta l 1 9 9 9 ；p i a t t ie ta 1 1 9 9 5 ) ，阻止了g 1 期以外的p r e r c 的形成，从 而保证d n a 的复制在一个细胞周期中只被起始一次( l i a n ga n ds t i l l m a n , 1 9 9 7 ) ，而且也控制d n a 在复制完成后进入有丝分裂( b u e n o e ta t ，1 9 9 2 ) 。 微染色体维持蛋白( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c ep r o t e i n s ，m c m 2 7 p ) 复 合物是p r e r c 的核心组分，它被装载到染色体上需要o r c 、n o c 3 p 、c d c 6 p 和 c d t i p 等的共同参与和调控( d u r r aa n db e l l ，1 9 9 7 ) ，这也确保了d n a 在一个细胞 周期中只被复制一次。 m c m 蛋白复合物一旦被装载在染色体上，c d c 6 p 和c d t l 将会从染色体上卸载下来，此时人为地将o r c 除去也不会阻止d n a 复制进程 ( r o w l e se ta 1 ，1 9 9 9 ；h u aa n dn e w p o r t ，1 9 9 8 ) 。和其它p r e - r c 成员所不同的是， m c m 蛋白复合物不仅在复制起始中起作用，在d n a 复制的延伸过程中也不可缺 少( l a b i be ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 m c m l o p 是p r e r c 的一个组成成分。m c m l o p 定位在复制起始原点 ( h o m o s l e ye ta 1 2 0 0 0 ) ，并且和m c m 2 7 p 的六个亚基结合( h o m e s l e ye ta 1 ，2 0 0 0 ； 中山大学硕士学位论文 k a w a s a k ie ta 1 ，2 0 0 0 ；m e r c h a n te ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在g 1 期p r e r c 形成后去掉m c m l o p 会导致m c m 复合物从染色体上解脱下来但是不影响o r c 与染色体的结合；研 究表明m e m l o p 和不同的延伸因子相互作用( k a w a s a k i e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 细胞分裂周期蛋1 1 1 4 5 ( c e l ld e v i s i o nc y c l ep r o t e i n4 5 ，c d c 4 5 p ) 在m c m 蛋白的 帮助下与染色体结合，在g l 后期形成c d e 4 5 p m c m 蛋白复合物( z o ua n d s t i l l m a n , 1 9 9 8 ；m i m u r a e ta 1 ，2 0 0 0 ；a p a r i c oe ta l ，1 9 9 7 ) 。然后许多复制蛋白( 包括： d n a 聚合酶q ，e 、复制蛋白a 和核抗原) 才装载到染色体上( a p a r i c i oe ta 1 ，1 9 9 9 ； m i m u r ae la l 2 0 0 0 ；z o ua n ds t i l l m a n , 2 0 0 0 ) 。c d e 4 5 p 对复制叉的延伸也有作用 ( t e r c e r oe ta l ，2 0 0 0 ) ，可能是复制叉复合物的一个组分( a p a r i e i o e t a 1 ，1 9 9 7 ； a p a r i c i oe ta 1 1 9 9 9 ) 。 核仁复合物伙伴蛋i 刍( n u e l e o l a rc o m p l e x - a s s o c i a t e dp r o t e i n 3 ，n o c 3 p ) 除了参与 r r n a 的加工( m i l k e r e i te ta i ，2 0 0 1 ) ，在m c m 5 j 多拷贝校正子的筛选( m u l t i c o p y s u p p r e s s o rs c r e e n ) 中还被发现参与了酿酒酵母的d n a 复制起始( z h a n ge ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。n o e 3 p 在整个细胞周期中都和d n a 复制子a r s 相结合，并且介导o r c 与其他d n a 复制起始蛋白相互作用，帮助c d c 6 和m c m 2 7 结合到染色体，对 p r e r c 的形成和维持有重要作用。 1 2 2 酿酒酵母d n a 复制起始模型 首先，o r c 识别起始原点，并结合上去；接着n o c 3 p 也结合上来，并帮 助其它蛋白的结合；然后c d c 6 p 与o r c 结合，并在c d t l p 的帮助下募集m c m 复合物到复制子上，形成p 化r c 。在g l 后期c d k s 激活，释放c d c 6 p 使它脱 离染色体，与此同时c d e 4 5 p 和复制子结合形成p r e i c ，此过程需要c d k s 和 d d k 的共同参与。c d e 4 5 p 被装载到染色体上后，细胞进入s 期。在细胞进入s 期时。m c m 和c d e 4 5 p 蛋白相继从复制子上消失，留下o r c 和n o c 3 p 形成 p o s t r c 。从染色体上释放的蛋白去向各异：c d c 6 p 立即通过泛素依赖蛋白水解 ( u b i q u i t i n - d e p e n d e n tp r o t e o l y s i s ) 的途径被降解；c d t l p 和m c m 蛋白在c d k s 应用酵母双杂交技术分析b r d 7 与人类d n a 复制起始蛋白的相互作用 的调控下被排出核内进入细胞质：在高活性c d k 的作用下，w e r c 在下个细 胞周期开始以前不会再次形成，最终使得d n a 在每个细胞周期只能被复制一次。 1 3 人类细胞的d n a 复制起始 1 3 1 人类p r e - r c 的结构和形成过程 结合到染色体上的m c m ( 2 乃吸引m c m l 0 与之结合，然后激活c y c l i n a c d k 2 和c d e 7 c b f 4 。然后大部分h c d c 6 p 被磷酸化和从染色体上分离( p e l e r s e ne l a 1 ， 1 9 9 9 ) 。其中有些h c d e 6 p 被转移到细胞质进入泛素介导的蛋白质降解过程，被降 解前可以发出一些阻止细胞进入m 期的信号( m e n d e za n ds t i l l m a n , 2 0 0 0 ) 。那些 留核内的h c d c 6 结合到抗去污剂和抗核酶的核内结构，且在g 2 m 期被c d l 【2 超 磷酸化( f u j i r ae la 1 ，1 9 9 9 ) 。c d c 6 脱离染色体后e y c l i n e c d k 2 被激活，h c d c 4 5 p 附着到o r c ( 2 6 ) m c m ( 2 乃上，形成p r e i c 并正式启动s 期。 在s 期早期，o r c l 和c d t l 就从o r c ( 2 6 ) 解离，o r c i 进入泛素降解途径 而c d t l 则被g e m i n i n 失活。非染色体结构却不随着o r c i 的离开而从o r c ( 2 6 1 解离，可能与m c m 一起使d n a 解链。h o r c i 离开染色体的同时，m c m 就移动 到o r c ( 2 6 ) 结合位点以外的染色体处。在h e l a 细胞，这种移动行为在复制起始 之前很久就开始，并且距离至少有5 0 0 1 0 0 0 b p ( r i t z ie ta i ，1 9 9 8 ) 。在复制开始前， m c m 可能作为一个固定的d n a 移位酶以重塑核小体的结构( p r a s a n t he l a 1 2 0 0 3 ) 。 中山人学硕i 学位论文 图i 1 人类d n a 复制起始模式图 f i g 1 1m o d e lo f d n ar e p l i c a t i o ni n i t i a t i o ni nh u m a n ( d e p a m p h i l i s ，2 0 0 3 ) 在s 期，两个m c m 六联体作为解旋酶沿着复制叉而分别反向移动，使复制 泡双向延伸而使组蛋白h 2 a h 2 b 二合物移走。m c m 还使组蛋白h 3 h 4 四合物 暂时结合到自身，然后再卸载到己复制好的姐妹d n a 分子上( p r a s a n t hc ta 1 2 0 0 3 ) 。带有m c m 蛋白的染色体片断处于单链状态，而更易受到核酶的攻击 ( s c h a a r s c h m i d te ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在g 2 m 期c d c 2 激酶使m c m 六联体中的m c m 2 和m c m 4 磷酸化，阻止了m c m 复合物重新结合到染色体上( f u j i t a e t a l ，1 9 9 8 ) 。 1 3 2 人类细胞。o r c i 周期”和p r e - r c 的形成 人类细胞通过独特的“o r c i 周期”( t a t s u m ie ta 1 ，2 0 0 3 ；o h t ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 来确保一个细胞周期只发生一次d n a 复制( d e p a m p h i l i s ，2 0 0 3 ；d e p a m p h i l i s ， 2 0 0 5 ) 。 在s 早期，当h m c m ( 2 7 ) 结合到染色体后，h o r c l 就从染色体解离，被 c f s k p 2 泛素化系统选择性泛素化，然后被2 6 s 蛋白体降解( m e n d e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 从s 中期到m 期，o r c i 都维持在一个基础表达水平( 是高峰期的3 0 ) ；这些 基础表达的h o r c l 在s m 临界期开始被超磷酸化并和c d k l c y c l i n a 结合，失去 了与染色体结合的活性( k r e i t ze ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 应用酵母职杂交技术分析b r d 7 与人类d n a 复制起始蛋白的相互作用 h o r c 6 与h o r c ( 1 5 ) 的结合能力非常微弱。h o r c 6 的作用可能只是调节h o r c l 结合到h o r c ( 2 - 5 ) 上( v a s h c cc ta 1 ，2 0 0 1 ) 和刺激h o r c ( 1 5 ) 以一种依赖于a t p 的 方式结合到d n a 上( b a l t i ne ta 1 ，2 0 0 6 ) 。h o r c 6 在m 期从细胞核转移到细胞质 的着丝粒上参与染色体分离和胞质分裂。h o r c 6 直到子细胞的核膜关闭前一刻才 重新进入子细胞的细胞核( p r a s a n t he ta 1 2 0 0 2 ) 。 所以在s 、g 2 和m 期，h o r c i 都不与染色体结合，形成不了完整的人类 o r c 复合物( v a s h e ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。o r c 复合物的核心o r c ( 2 5 ) 虽然整个细胞周 期表达水平恒定，并一直结合在染色体上，却不足以启动其他复制起始蛋白的召 集，形成不了活性的p r e - r c ( d h a re t a l ，2 0 0 1 ) 。值得注意的是，h o r c 并不特异 识别某段染色体来起始d n a 的复制，人类的d n a 复制起始的位点具有随意性 ( v a s h e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在m 中期，保障h o r c i 和c d k l e y c l i n a 结合能力的c y c l i n b 被降解( c l u t e a n dp i n e s ，1 9 9 9 ) 。h m c m 8 结合到染色体上( v o l k e n i n ge ta 1 。2 0 0 5 ) 。最近发现与 h m c m 8 关系相近的h m c m 9 ，但其功能未知( y o s h i d a , 2 0 0 5 ) 。在m 末期，h o r c l 去磷酸化并和c d k l c y c l i n a 脱离( l ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ，h c d c 6 和h o r c 6 从细胞质重新 进入细胞核。 图1 2 人类o r c 亚基相互作用关系图 f i g i 2 i n t e r a c t i o nr e l a t i o n s h i pa m o n g h u m a n o r cs u b u n i t s ( v a s h e ee t a l ，2 0 0 1 ) h o r c l 整个细胞周期都与一个抗去污剂和抗核酶的核内非染色体结构结 合。在m g 1l 临界期，h o r c 6 与h c d c 6 结合到这个核内非染色体结构上，并以它 为平台与h o r c l 有物理性相互作用( s a h ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。到了g l 早期，h o r e 2 结 6 中山大学硕士学位论文 合到这个核内非染色体结构，并且和h o r c l 有物理性相互作用( t a t s u m ie ta l ， 2 0 0 0 ；f u j i t ae ta l ，2 0 0 2 ) 。h o r c l h c d c 6 复合物从而与o r c ( 2 6 ) 结合，形成 o r c ( i 6 ) c d c 6 复合物。这个复合物的形成促使c d t l 携带着m c m ( 2 刀结合到不 交联有这个核内结构的染色体上。此时( o l s 临界期) ，在复制原点形成p r e r c ( m e n d e za n ds t i l l m a n , 2 0 0 0 ) ，并且h o r c l 的表达到了高峰( k r e i t ze ta 1 ，2 0 0 1 ； m e n d e ze ta l ，2 0 0 2 ；f u j i ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ：但核内还有很多m c m 并不结合在染色体， 这些自由的m c m 不能启动体外的d n a 复制，可能参与转录的调节( b a l t i n d a l ， 2 0 0 6 ) 。 1 3 3 人类细胞m c m 蛋白和d n a 复制 不光在在酵母中，在人类细胞中( s t o e b e r e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，m c m 蛋白也在d n a 复制起始过程中有重要作用。m c m 蛋白在细胞周期中存在两种状态：附着在染 色体上或从染色体上脱落。m c m 蛋白附着到染色体上的步骤发生在有丝分裂末 期或g 1 早期，而脱落则发生在s 期快要结束时( l i a n g & s t i u m a n1 9 9 7 ，l a b i be ta 1 2 0 0 1 ，l i n d n e r2 0 0 2 ，k i m u l a1 9 9 4 ，d i m i t r o v ae ta t1 9 9 9 ，h o l t h o f f e ta l1 9 9 8 ，k r u d e na l1 9 9 6 ，o k u n o2 0 0 1 ，r i t z ic ta 1 1 9 9 8 ，m e n d e zj s t i l l m a n2 0 0 0 ，r o m a n o w s k i 1 9 9 6 ，s ue ta l1 9 9 8 ) 。在人类细胞中进行的c h i p 实验证明：m c m 蛋白首先在复 制起点上组装，然后开始往两个方向移动，同时使得复制叉也向两边移动 ( s c h a a r s c h m i d te ta 1 2 0 0 2 ) 。体外实验证明- j m c m 4 6 7 p 复合体有较g b 的d n a 螺旋 酶活性( i s h i m i1 9 9 7 ) 。 人类m c m 蛋白同样形成六聚体的结构( r i c h t e r & k a i p p e r s1 9 9 7 ) 。通过c o i p 的试验得出的结论，在裂殖酵母中，m c m 4 p 和m c m 6 p 之间有紧密的连接而它们 与m c m 2 p 的连接则要弱一些，m c m 3 p 和m c m s p 之问的连接同样紧密但它们与 其他几个m c m 蛋白只是松散的结合( s h e r m a n f o r s b u r g1 9 9 8 ，s h e r m a ne ta 1 1 9 9 8 ) 。同样通过i p ，在老鼠细胞中也存在m c m 3 5 p 二聚体和m c m 2 4 6 7 p 四 聚体( m u s a h lc ta 1 1 9 9 5 s c h u l t ee ta l ，1 9 9 6 ) 。而在人类细胞中，则存在m c m 4 6 7 p 和m c m 2 4 6 7 p 聚合体( m u s a h le ta 1 1 9 9 5 ，s c h u l t ee ta l1 9 9 6 ) ，以及m c m 3 5 p 二聚体( b u r k h a r te ta 1 1 9 9 5 k i n l w ah1 9 9 5 p a u le ta 1 1 9 9 6 ) 。 7 应用酵母双杂交技术分析b r d 7 与人类d n a 复制起始蛋白的相互作用 图1 3m c m 蛋白以不同的亲和力组成复合体 f i g - 1 3m c mp r o t e i n sf o r mac o m p l e xb u th a v ed i f f e r e n tr e l a t i v e 为了了解人类细胞中m c m 聚合体的各个蛋白的排列顺序，有人曾用g s t 实验 考察过各个蛋白之间的二元相互作用。在g s t 中，m c m 2 p 与m c m 4 p m c m 2 p 与 m c m 6 p ，m c m 2 p 与m c m t p ，m c m 4 p 与m c m 6 p ，m c m 4 p 与m c m 7 p 都存在二元 的相互作用( y a b u t a e la 1 2 0 0 3 ) 。同样还有酵母双杂交的结果也被用来说明蛋白 之间的相互作用关系。 图1 4 酵母_ 坝杂交里m c m 蛋白之间的相互作用示意图 f i g 1 4 d i a g r a mo f y e a s t t w o - h y b r i d i n t e r a c t i o n sa m o n gh u m a n m c mp r o t e i n s 中山大学硕士学位论文 1 4 酵母双杂交筛选的原理 酵母双杂交系统是f i e l d s 和s o n g 等利用真核生物( 酿酒酵母s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 的转录调控蛋白g a i a 的特性于1 9 8 9 年首先建立的。g a l 4 蛋白是 编码半乳糖代谢酶的基因的转录激活子。g a l 4 蛋白由两个相互独立的功能性结 构域构成，分别是n 端的d n a 结合结构域( d n a b i n d i n gd o m a i n , 简称为b d ) 和 c 端的转录激活结构域( a c t i v a t i o nd o m a i n , 简称为a d ) 。f i e l d s 和s o n g 以与s u c 2 基因调控有关的两个已知有相互作用的蛋白质s n f i 和s n f 4 为模型，将前者与 g a l 4 的b d 结构域融合，另外一个与g a l 4 的a d 结构域的酸性区域融合。 由 b d 和a d 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”( b a i t ) 和“猎物”或靶蛋白 ( p r e yo rt a r g e tp r o t e i n ) 。如果在s n f l 和s n f 4 之间存在相互作用，那么分别位于 这两个融合蛋白上的b d 和a d 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活 相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基 因称之为报道基因( r e p o r t e rg e n e ) 。通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判 别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此f i e l d s 等人采 用编码b 半乳糖苷酶的l a c z 作为报道基因，并且在该基因的上游调控区引入受 g a l 4 蛋白调控的g a l l 序列。这个改造过的l a c z 基因被整合到酵母染色体 1 爪a 3 位上。而酵母的g a l 4 基因和g a l 8 0 基因( g a l 8 0 是g a l 4 的负调控因子) 被缺失，从而排除了细胞内源调控因子的影响。因为已经知道在s n f l 和s n f 4 之间存在相互作用，结果发现只有同时转化了s n f i 和s n f 4 融合表达载体的酵 母细胞才有争半乳糖苷酶活性，单独转化其中任何一个载体都不能检测出p 半 乳糖苷酶活性( f i e l d sa n ds o n g ，1 9 8 9 ) 。 目前研究中常用b i n d i n g d o m a i n 基因有：g a l 4 ( 1 1 4 7 ) ；l c x a 征c o l i 转录抑 制因子) 的d n a b d 编码序列。常用的a c t i v a t i n g - d o m a i n 基因有：g a l 4 ( 7 6 9 一8 8 1 ) 和疱疹病毒v p l 6 的编码序列等( s a d o w s k ie ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 一 最常用的含报道基因的重组质粒的宿主细胞是酵母细胞。许多酵母内的主要 调节途径中的蛋白在更高级的真核生物中都可以找到功能对等的同源物，而且酵 母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合( r u s s e l le ta l ，1 9 9 7 ) 。再因为 在酵母内具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。从而可以通过酵母 9 应用酵母双杂交技术分析b r d 7 与人类d n a 复制起始蛋白的相互作用 菌株表达一种或以上的同源哺乳动物基因，并以此进行功能性筛选，快速显性地 确定目标c d n a 的作用位点( f i e l d sa n ds t e r n g l a n z , 1 9 9 4 ；c i s m o w s k i e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 a b c 嚣芒岛 图1 5 酵母双杂交原理图 a 蛋白x 与d n a 结合域的融合蛋白不能单独激活报告基因 b 蛋白y 与d n a 激活域的融合蛋白不能单独激活报告基因 c 蛋白x 与蚩自y 相互作用，d n a 结合域与d n a 激活域得以重组到一起形成有功能 的转录因子，报告基因被激活 f i g 1 5t h et w o - h y b r i d 研n c i p l e ap r o t e i nxa n dd n ab i n d i n gd o m a i nh y b r i da l o n ec a n n o tt u r no nr e p o r t e rg e n e b p r o t e i nya n da c t i v a t i o nd o m a i nh y b d da l o n ec a n n o tt u r no nr e p o r t 目g e n e c p r o t e i n sxa n dyi n t e r a c t d n ab i n d i n gd o m a i na n da c t i v a t i o nd o m a i na r eb r o u g h tt o g e t h e r a n dt h e r e b yr e c o n s t i t u t i n gaf u n c t i o n a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r a sar e s u l t , t h er e p o r t e rg o n ew a s 酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：作用信号是在融 合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁 琐步骤。检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 检测的结果可以是基