（生理学专业论文）小鼠胚胎早期发育过程中xist基因的转录模式.pdf

独创性声明 y 6 59 183 本人声明联呈交戆论文是我个人在导龋指导下遴行的磺究王终及驳缛戆磅 究成果。尽我所知，除了文中特剐加戳标注帮致澎的地方外，论文中不包含箕他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学成其它教育机构 盼学位或诞邻丽使用过的材料。与我一冠工作的同惑对本研究所傲的任 可贡献均 已薤论文中作了臻确静说翻并表示了落意。 磷突熏签名：嚣麓： 汹译年f 秀；参爨 关于论文使用授权的说明 零人究全了解中整农娃大学有关绦鏊、使用学位论文的裁定，即：学校蠢投 绦蜜送交论文的复窜律藕磁盘，允谇论文被查阅和偌阕，可以浆用影印、缩窜威 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农她大学可以用不同方式在不同 媒体上发袭、传播学位论文的全部或部分内容。 棵密熬学位论文农解密螽应遵守越协议 磷宠囊签名- 孽，。 导疼躲专鹭缈 辩阉：) 瓠礴扫嚣霸 对翅：溅年f 伊z 鞋 夺鬣瓤验举期发育过程中x i s t 基因戆转录模式 研究生：巅j | | 。导烬：麓克熬 巾文攮要 薅瞧幼物豹裁蟹癸毯散瘫楚逶过缨簸巾一条x 絷色体酾转录失溪泉实现静。失港静染 色体上面铿往发生一系列的修饰，导致产嫩4 e 常稳定的弊染色质且能在细胞复制的过程中稳 定遗传。x 染色体失疆与链子“x 染彀体爽活中心”( x i c ) 上妇f 基鞭怒息檩关，妻蘩袭 现在x i s t 的转录产物避避包围一条x 染彘俸搜萁抗默。囊予萁在x 染色体失活中鹣重簧作 用对胎f 的研究一查是涯几年的磺究热点，其中缀壤鞭的一点就是试圈建立x i s t 染彀体 崧发育过粳中的时空转泶模式。但是由予胚胎发育旱髑m 对转录本数撼的稀少而难以逮到 授静靛效聚，本实验采篱戴氏r t - p c r 旁法，对来鑫体 嬷养熬疑于蕾个发蛮对弼匏小鬣胚 胎进行了分析和性别鉴定。首先提取了6 阁龄昆明翻小鼠几个组织的r n a ，用普通反转泶法 扩增x i s t 謦鞋s t y 以确定r t - p c r 的条饽，s t y 的主要作髑是题柬做性嬲髅定。蛀终将其菠应 条箨确定诲运炙溢瘦弱，s t y 帮x i s t 胃鞋耄予葡一体系中扩增。然艏铡用实验确定静 p c r 条件，以h p r t 为阳性对照，用巢式r t - p c r 对小鼠晕期胚胎进行x i s t 基因的转蒙分柝， 结果发现，转录s t y 基嗣的睾丸组织以及攘性胚胎，从受精卵发育4 囊疑的过程中，蕊本上 莓转交x i s t 纂霆；幂转暴s t y 墓粪戆雅梭舞母缨怒襄壤瞧胚熬，簸出璃豢羧开始，裂笈蹇至 2 痢胞期的过程中，x i s t 激困一赢不转荣，但是从4 嘲胞期开始，一赢到孵化前囊胚阶段， 雌性胚胎椰转录x i s t 基因。实验结果说明，x 染色体鹣失涵簸警出现在胚脸发育的4 m 绷胞 除毅。瓣时蠢予获骧辕辩期扩穗翻了s t y ，本文试旁蓬躲豹蛙鞠箍定数肇令细斑帮可。零论 文不仅建立了x i s t 基因柱小鼠胚胎早期缴育过程中的转融模式，为解释x 染色体的失懑提 供了理论依据，而且，也为体细胞克隆腥胎的重新编聪纂l 譬期胚胎的发育提供了有懿参考。 关键词：小鼠船盯s t y 性别憋定转录r t - p c r 附植前胚腑 a b s t r a c t d o s a g ec o m p e n s a t i o ni nf e m a l em m n m a t s i sa c h i e v e db yi n a c t i v a t i n gt h et r a n s c r i p t i o no f o n eo f t h ex c h r o m o s o m e d u r i n g t h i sp r o c e s s ，as e r i e so fm o d i f i c a t i o na p p e a r e do nt h ex i ，w h i c hl e dt o t h ef o r m a t i o no f s t a b l eh e t e r o c h r o m a t i nt h a tc a nb ei n h e r i t e ds t e a d i l yi nc e l ld u p l i c a t i o n x i s ti sa n i m p o r t a n tg e n e w i c hi sl o c a t e di nt h ex i c ( xc h r o m o s o m ei n a c t i v a t i o nc e n t e r ) 糟参o na n di sc l o s e l y r e l a t e dt ot h exc h r o m o s o m ei n a c t i v a t i o n t h eg e n es i l e n c e st h ex ic h r o m o s o m e 谤s p r e a d i n g a l o n g t h ex ia n di n h i b i t sm o s t o fi t sg e n et r a n s c r i p t i o n d u et ot h ei m p o r t a n tr o l ei tp l a y e di nt h e i n a c t i v a t i o n m o c e s s , x i s ti sg r a d 删yb e c o m i n gah o ts p o t ，o u rr e s e a r c hw a sm a i n l yf o c u s e do n t h et r a n s c r i p t i o np a t t e r no fx i s ti np m i m p l a n t a t i o nm o u s ee m b r y o s w ee m p l o y e dt h er t - p c r m e t h o d 协i n v e s t i g a t e w h e t h e r x s ti st r a n s c r i b e di ns o m eo f t h e d e v e l o p i n gs t a g e so f m o u s e 。f i r s t , d i f f e r e mm o t l s et i s s u e sw h i c hh a v eb e e np r o v e d 协t r a n s c r i b el o s ta n ds t ys i m u l t a n e o u s l yw e r e u s e dt oe s t a b l i s ht h ea p p r o p r i a t ec o n d i t i o n sf o rx i s ta n d 聊r t - p c r 。e nt h ea n n e a l i n g t e m p r e t u r eo f 5 5 h a sb e e nd e t e r m i n e d , t h en e s t l e dr t - p c rm e t h o dw a su s e dt oa n a l y z et h e t r a n s c r i p t i o np a t t a mo f x i s t u s i n g t h en m t g e n ea sap o s i t i v ec o n t r o l ，o n , rr e s u l ts u g g e s t e d t h a t b o t ht h et e s t i st i s s u ea n dt h em a t ee m b r y o sf r o mw h i c hs t yh a n s c r i 确o nc a n 酶d e t e c t e df a i l e dt o y i e l da n yp o s i t i v er e s u l t so f x i s t f e m a l ee m b r y o s 越t h ep r o n u c l e u ss t a g ea n d2 - c e l lf a i l e dt o p r o d u c ea n yp o s i t i v er e s u ro f s t y a n dx i s tt o o w h i l es i n c et h e4 - c e l l sp e r i o d ，x i s ti sc o n s t a n t l y t r a n s c r i b e du n t i lb l a s t o c y s ts t a g e s w ea l s os u c c e s s f u l l ya m p l i f i e ds o , f r o mp r o n u c l e u ss t a g e e m b r y o s , w h i c hp r o v e t h a te m b r y oc a nb es e x e db ys t y 怼袋m e t h o du s i n go n ec e l li n s t e a do f t b e m i n i m a ld e t e c t a b l ec e t ta m o u n to f 4c e l l sp r o v e db yo t h e r s t h e r e f o r e , w ec a nc o n c l u d et h a tt h e e a r l i s tx i s tt r a n s c r i p t i o na p p e a r e da t4 - c e l ls t a g e si nm o u b ye s t a b l i s h i n gt h et r a n s c r i p t i o n p a t t e r no f t h ep r e i m p l a n t i o ne m b r y o s ，t h i se x p e r i m e n tn o to n l yh e l p e dt oe x p l a i ns o m e o ft h ex c h r o m o s o m ei n a c t i v a t i o np h e n o m e n a , b u ta l s of u r n i s h e dt h er e s e a r c h e rw h o v c l e r ed e d i c a t e dt ot h e r e s e a r c ho fr e p r o g r a m m i n go fs o m a t i cc l o n i n ga n dp r o i m p l a n t a t i o nd e v e l o p m e n tw i t hu s e f u l m a t e n a l sa n dr e f e r e n e a s 。 k e y w o r d ：m o u s ex i s t s t ys e x i n gt r a n s c r i p t i o n r t - p c r p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s 2 第一部分文献综述 弓l 富 4 0 年赣，m a r yl y o n 掇出x 染色体基嚣的刘鬃 偿效应是避过雌性缎胞一条染色俸上 的转录沉默来实现的。早期观察认为这个过程是随机的。也就是说来自父母的染色体失活 的机会均等。x 染甑体失滔发生予胚胎发育的早期，大致稽当于全能细魏耱分纯时期2 。对 x x y 染色体4 整傣体研究教理一条x 染色体保持涟性，其它的全郯失淫3 。遗传学研究袭 明# x 失活染色体( x i ) 的沉默始于x 染色体的x 失活中心区域( 小鼠中为x i c 人为x 1 c ) ， 然嚣沉簌联势向外扩展蟠，表碉藏颡势元件包含裁始x 染色体失活的序捌。随机x 失话是 个多步骤的复杂过瑕，包括活性x 染色体( x a ) 敕选择，x i 染色体失活的起始、沉默、在 x i 上的扩滕以及后来沉默状态的维持。由于小鼠胚胎千细胞( e s ) 在诱导分化时经历了 个麓梳x 絷色体失活的过程，西藏燕一个有用的材料卵。殛骆干细胞由予箕逮糖学上韵可 操作性以及可以通过生殖系遗传，健得较易通过隧胎来对其进行研究。所以目前为止，关予 x 染色体失活的调节机制在小鼠中是理解的最好的。 x i s t x i s t r n a 是x 失活的关键谖控元肄 x i s t x i s t 基因位于x i c x i c 馘域 x i c x 1 c 区域的确定是通过置换x 染色体的某个片断而导致常染色体的失活丽发现的8 ， x i c x i c 在人和鼠中位于尉一染色体，却内于基因的重新组合或者倒置而产生物种之间的差 异，详踅翻1 。1 9 9 1 年发现戆荤芝予x i c x i c 医域戆x i 将器瞧转最本，j 、鬣中兔) f i s t ，人为 x i s t ) ，彻底改革r 人们对x 染龟体失活的看法1 0 - 1 4 x i s t x i s t 是唯一一个只从体细臌x i 转潦而不舨x a 转潦黔基阕。还没有发现x i s t x l s t 阅读糕的报道，表明x i s t x i s t 不编鹤蛋 爨。辑疆x i s g x i s t 被诀为楚x 絷夔嚣必媾霉l 失溪絷毪体褥鞋维持鲍关键基强8 ”。簿箍言 之，x i c x 1 c 区域可以被等同下使褥x a 雨i x i 在发育阶段能够正确调节的x i s t 基阑及其顺势 诵拄元什。 中国农业大学硕士学位论文 文献综述 舞_ i l i l l l l l l i 嘲麓黼皇舞一 x i s t x i s t 缝擒是铩守瓣，健是辍鐾耱纛异 小装x i s t 和人x i s t 基因鳃分别犬掇先2 3 k b 秘3 5 k b 。鞭个基闵的转录产物均拔拱接秘 趣p o l y a 。小疑x f s t 由嚣始翻末尾2 令天熬， 显子嶷中阚5 个夺豹， 显予构成1 2 , | g , 1 9 麸窝 动予p l 舞始转录，掇据多聚耀的苓霹胃戆会产生长达1 7 9 k b 的抟骣1 ”。入类戆x 1 s t 蒸 因结挎包括窟幼子和外曼予砖禽子的边巽。大抵与小陵榻羁“坤。人类最大的翔艘转聚奉 约为拽3 k b 。人类x i s t r n a 戆不羁羧3 端嫠因转滚本的攥接不爨 莛产嶷”趣”。迄今淹止， 髓皴翳的雾质机刿尚誉溃楚。 从测序水平来瓣。所有的x i s g x i s t 测序结果显黎较低的保守性2 2 “。小鼠和人的 x i s t y x l s t 毒4 9 的楣戗饿，终娃子的摄寄性比内含予鞘谥”斟。啮蠢类动甥秘入懿x i s t x i s 7 网漂性比强白编码区麴整体弱源( 8 5 ) 水平低，甚至魄m r n a 熬5 爨l3 端黪 # 糕译酝 ( 娟5 8 0 ) 还要低h 。照然农些短的特异序列在不同物种闻显示出较端的阏源性2 1 斟，最 明显的月源性还是体现在6 个重复的序列土，这6 个露列分辅命名为a - f 1 2 , 1 ”4 。 椭佃t x h 镰，撞n x 翱酵拈堪$ ， 船，c = = 二= ：= 3 hg le 二= 二二： h l 嗡 、。7 i 剥 ， = = 二= 二= = ；lll = = l g 垴 、 ，、 ，。 蹦1 ：小飘积人的x i c x i c 翱x i s t r x l s t 。a ；包燃人和疑x 凝色体x 1 s t ，x 敏熊缄螅罔簿送域的娜承。 对十人类包括约7 0 0 - 1 2 0 0 k b 的x l e 峨域位十x 染色体近若熊粒域的x q l 3 带2 5 柱小敝中，发生x 染也体蘸艇蛉x i c 速k b 人类人西。然蚝，通过转基斟分辑，能够发挥x i c 作用螅的拦域援电括x i s t 艘j e 勰 瑚徽小的一n 段序判2 1 。人辩i 鼠包食x i c x i c 区域的序列l 嘲线缎是倒疑( 艨线) 帖。基拨名字上戮鲍麓基 址水转录的方位。由十会麓生一魑本地的序列倒置从瓶使柑这州个定向进化f m 螵序列并不是很连续9 。人类 4 中国农业火学硕士学位论文文献综述 + 薯量量i 舞曼皇皇墨| 鼎鼍簟皇量蔓鼍曼舅量曼鼍曼曼舞目麓鲁舅崮鼍量皇璺葛量皇嘲黼皇鼍皇邕暖 t s x 葡系物的存在避不是很肯邀u , 3 2 。b ：馘人x i s t x i s t 基因的比较。p l 是转辩的重要起始启动子。在鼠 中，用于艇号所示的雾聚腺苷酸尾巴拼接筒式的不l 司而可能产生两个变体t 其长度分别为”和1 7 9 k b 。在 小飘中还发现第二个启动子p 2 ，但魁根据迄今为止的发现，这个启动子并不保守m 。人类中更进一步的拼 接已经被靛现，如产生缺少内古子4 、半个内含子6 、或者内古于7 的变体1 3 , 1 43 端的两个内台子并不总 是被切掉，产生一长为1 9 3 k b 的片断n 。 x i s t x i s t r n a 定擞于雌性体缨腿熬失滔x i 染瞧俸上 在对x i m x i s t 基强静窿捌分辑瓣，并不娟道x 染色俸失活是螽予就藿因镌穿剜还是受 到了r n a 产物的调节。对x i s t x i s t r n a 产翰的分布进行研究立鄄傻入们意谈到了r n a 产 物的重要性。x i s t x i s t 转黎本位于雌性体细胞的细胞核内”，”，荧光原位杂交( f i s h ) 显示， x i s t x t s t r n a 具有商度的特异性。主要集中于被认为是x i 所在的大的核区3 ”3 4 0 x i s t x i s t r n a 在有丝分裂时从x i 上释放下米”那。三雉分析显示x i s t x i s t r n a 并不只是限于结合 在x j 的表面，而是驻扎入楚个x l ”。这种r n a 和染色体的紧密结台可谓是史无前例。屉新 研究表明在雄性果蝇中参与这种r n a 和染色体结合的还有r o x i 和r o x 2 r n a 。这种x i s t x i s t r n a 与x i 的紧密结合促臌了一个模型的诞生：即r n a 作为一个有用的分子来调节x 染色 体的失活过摆。 枣鬣发育过程串x i s tr n a 缒颓势扩震与x 染龟捧失活褶关 在雄性和雅性，j 、鬣胚胎中，x i s t 在全能外胚鹰分化为胚胎组织前是转录的。通过f i s h 的方法，在所有x 染色体上，x i s tr n a 在其转泶位嚣显示为一个微小的信号3 6 , 3 70 从早期 胚胎得到的全能小鼠e s 细胞也显示相同的这种x i s t 转录信号”。与x 染色体火活一致的是， x i s t 转录水平在雌性体细胞而：1 f 在雄性细胞中增加”。在豚肠胚形成，外胚j | f ? 分化形成胚脓 生殖细胞咀及e s 细胞体孙分化时，两种细胞均经历x 染色体失活过群6 , 3 9 a 0 弗曼示相似憋 x i s t 转慕模式3 6 , 3 7 x i s tr n a 规涵整个x l ，露x a 显示 硅 氐的x i s tr n a 傣号3 ”7 。怼鞋s 缎 腿进镭f i s h 研究显暴妊x i s t 转交本包涵x i 磊基嘲立邶派默3 4 r 3 7 = 柱x i s t r n a 毽涵x l 赢鏊 溺沉默的事实说甥x i s t 萋嚣盎x i 欠活中起到了潮茶性瀚箨璀。 x i s t 基鞠在染色体基因沉默过程中起到必要且充分的作用 为了研究x i s t 的功能做两组删除实验，移除x i s t 基因的启动子和第一个外最子”或 者外显子1 到5 ”。带有残缺不全的x i s t 基因的x 染色体无法失滔，只有野生型x 染色体能 够正常失活1 5 d ? 用与x i s t r n a 反义的寡按替酸阻止x i s tr n a 包涵x i 时。x i 不必活”。 这些结粜显示x i s tr n a 的转录秘x 染色髂鲍靓涵在x i 的失涯过程中起到攫太螅作瘸。， w u t z 秘饱餐翔事散了一系摊的实验诞疆x i s tr n a 足鞋； 麓整个染色俸的沉簸4 t ”。 掏建一段缺失3 k b 末端辫显子，带有龋环索诱导的启动子豹1 5 k b 钓x i s t e d n a 。在雄性e s 细胞中诱导该基困的转景导致x i s tr n a 在常染色体上的扩藤从而使其沉默“。这个结果显 示对于雄性细胞g i s t r n a 的高效转录足以使锝整条染色体沉默。已经有证据表明g i s tr n a 通道形成核蛋白复合体来达到调节作用4 3 , 4 4 0 虽然x i s tr n a 在e s 细胞中能够引发髂条染色 体的沉默，其在分化细胞中的作用是不够的”j 5 ”。所以，x i s t r n a 总能够顺势扩展包溺整 条染色体。但是却只能在一个狭窄的范围内产生调节作用。x i s tr n a 恰当的空间和时间顺 序在雌性细胞中x 染色体的失旗中越羞关键的作用。 活性染色体的选择 活性染色体( x a ) 的选择是受一系列顺势元件的调节 果蝇和线虫的剡量补偿效成在瓶条染色体之间是随机的“，与之楣魄，哺 l 动物蛇x 染毂体竞全憝另一秘不同的命运。程睫枧x 失活中，蠛g l 动物姻您菇走撑定一条活性染色 体，然感失旗爨露剩余蛇染琶俸。缨赡必矮投蘸个媚爨的x 染色体之阀镞辔选择井在其中 一个做豁记佟为泰来瀚x a 。瑶蔫最篱革豹一个模l 试为起作疆煞是一种负责黼i tx 染色棒 失活静阻 i 粥子( b l o c k i n gf a c t o r ) ，这种阻l p 闲子负责作标记( 翻2 ) “。x i c 负 蔚调控阻 j r 阑于的区域明做作j j 元件( c o u m i n ge l e m e n t ) 。阻i p 冈子对忭j _ i ；| 元件的修饰作为区分x a 和x i 的第步。阻j r 佣子与忭州元件相作川的。个1 刊囊的后果就是日 发x i s tr n a 时x 染 色体的沉默作 j 。作元仆由此被认为魁x a 选择的一个甍本的顺势调控元4 1 ：。 6 中嗣农业大学醐士学位论文 立献综述 _ i i i 篁燃舞皇皇目_ 麓 雌性细胞中存在两条具有相似胁区域的x 染色体所以x a 的选择襁往是随机的，阁 失辍止因子在与嚣条染色体l l 孽 筝翔元件搏掰爵是夔橇静”。遗传学骄究还袭鞠存在鹦一种镧 做选择元件( c h o i c ee l e m e n t ) 的顺势元件。顺势元件使得在x a 的选择过程中具有偏向性， 即一条染色体被标记为x a 的频率会远远大干另一条染色体的几率”。选释元件的存在改变 了戳垂因子每作翔嚣锋结合戆攘囱性，这静浚交舂露能楚使箕增强媛者减瓣。出j 墩霹燕，在 x i c 区域一系列的顺势元件麸同作用使得在随机失活的过程中x a 和x l 区矜开来。 搀翔元终岛x i s t 攘邻曼发生撵怒罴受蠢一定靛量 对作用元件的一个确定的功能的测试怒当作为一段基因片段转入雄性细胞的常染色体 嚣| 会使褥x 染色俸失活。铃用元佟嚣为一段转基嚣魏存在鹱褥阻盎因子离开秀潦x 染色薅 从而使得x 变为x i 。已经商一系列关于x i s t 转基因的报道，报导称这种宙x i s t 片段的基鼹 在转入雄性细胞后引起内源x 染甑体豹失活2 ”1 。作为作用元件起作用的最小区域为包宙 x i s t 及其上游9 k b 秘下游3 k b 弱片叛2 7 基于最近h o n g 及矮两事潞3 端爨绘裁的孳强鼍。 由于x i s te d n a 作为转基因不能引起x 染色体失活，所以作用元件不可能位于x i s t 基因的 转录区间“。就像所有有功能的x t c 转基鞠一样，所有含作用元件功能的3 5 k b 转基因都星 多拷贝”。投毒单拷贝鲍转蒺因能够忠实的起到妇的器粥2 6 袋鸯这些鬟示要么单拷菇转 基因更容易受到位鬣效应的影响从而干扰作用元件的功能要么作用元件的起作用是多岐 的，需要达到一定阚值的鬣才能起作用。即使是在多拷爱转基因能够引发内源性x 染色体 失涎的情巍下，机会也不是均等螅。内涎性x 染色体更容易戒戈x a 毪”。与之捆魄，x i c 置换能够平等的与正常x 染色体争夺成为x a 机会”。所以，尽管转基因禽有作用元件，其 余调控元件帮丢失丁。 7 中目农业火学硪士学位论文 文献综述 j i i 簟舅奠鼍柏 黧! a u h t 堂黜! 甥型i 蛭! ? 一 一 。 a i 慨”k 热蝰壅鉴t 臣襄姿照璺k j 一 ( e l x a d c e 。二鲞艚未璺：纛椭 x 晰一= 翻= h 燕= 潺= = = ：= 卜痘弘= 孙m 嘛 ：黟哟峙。，多 x 。m m * 匕至嚣j 筻黟e 嚣亘 瘘鲈“- 科m 一脚删 铂x a c x ie n a c m n e n t 鼬，嘲震 兽缸x 箍嘲_ 獭卜惑埔蕊圈曩置蕊一e 蠢_ ：| 阿篁蔗蔷嘲昏砒 ，争参多黟慧，斗，黟箩多多慧多；声黟黟 矿* u m 筒”x i ：蔓簸二) j 垂莺 墓飘霹翟匿自2 l _ ：二翌圉三) - 重k 萨瓣露露四l e 露卜t * 鞫2 ；龌也稿子产生x a 韵机制i ( a ) ：一常染色体编鹞的慧蟛懿的戳止因子( b f ) 选择产生x a 。( b ) 两条x 染色体鹣柞用蠢辞( c e ) 巍争有艇的隧止因予。当阻止融学张势与一每x 染色搏的作用觉传缝仓 时溉撙馘产燕。托时，茸娃产整x i s tr n a 瞧是两辩予转馕挝蓑。 c ) ：在橇定瓣蔽，a 上辫x i s tr n a 活动豳予疆也鞴学的稚用两停也，x i s t 转录最后梭燕潮。x a 的命运被镄定在x i 上，x i 髓r n a 机有可能 通过棱磺臼美会体的形式赖势包爨絷邑体，确定箕为x i 。 r 由予箕在接受黻止鞫予倍号调节方箍韵作用，作潮元件雀x 染色体成为x a 的过程中必 不可少。删除体翊嚣肄预翅会使得雄性捆腿中x 染色体失活。个6 5 k b 的剿除试验袋明俸 翅嚣t 攮予船3 臻瓣驻予7 下游爨3 ) 5 3 。见等掰毒程x 潦琶俸上删躲藏元终静耋毽瓣均 在分纯髓由予x i s tr n a 豹辩证转录而毵亡。蕊然这可髓苷致作糟元件韵删酴而健其不能被 选择为x a ，弱一静可能性魄不能辩除。那就憝导教冀种位于撼甜下游的调控元终受到了 影螭。e s 缎照中已经窍三个誉同鲢嚣域挥溅滁撵露币澎晌势犍时期x 染毽体失蜓5 4 - 5 6 。露 璀元f ：构教现艋jx a 选择提供了重要豹线索，迸一步w 能会分离出阻j t 因予。 x i s t 邋过j 嫒势作掰影响融蜓选挎 s 、 q b 啼 啼 就像删除作用元件一样删除选择元件一样会影响雌性细胞中x 失活的倾向性。然而 不溺酶是，蠡予选择嚣箨是避过影响黼盘困予与柞璃元锌豹结合来发生襻溺，逸辑蠢锌弱耩 除对予雄性细胞中x 失活并没有作用。所以，可以定义选括元件为：能够偏离雌性细胞中 x 染色体失滔但是不影响雄性x 失满异位转渌的突变。 已经有证据显示；x i s t 可能是一种选择元件当删除x i s t 的杂食体雌性细胞在分化时， 只有野生x 染色体失活t ”，此现象商两种解释。可能选择元件正常发生了作用，懒是由予 选择了擞瓣狳染色体捧为x 静5 0 静缨藏强为羌法发生x 失滔褥死簿了。另一种可能就 是发生x 失活的概率旋生了偏移，删除了船l 的x 染色体总是被：i 敷择成为x & ，野生型x 染色体总是被失活。利用f i s h 探针区分野生型和删除x i s t 的等位基因，发现在胚胎细胞中 娶生凝x 絷色薄获寒不会竣选择戒必x a l 5 。这转剿除造裁豹效应蘸示：x i s t 转录嚣域或嚣 x i s t r n a 作为一种选择元件减弱了阻止因子与作用惩件的顺势作用。 k b 8 登：! ! ! ，竺 璺：! ! l 羔兰2 竺_ 篓生要兰登 量登! 盥型 i 卜一塑垫竺竺坐l _ m 憾9 口f 】 恻3 ：小鼠x 染色伴卜昀x i s t 和t s i x 本国详细显示了瑚绕小鼠x i s t 基p 司约2 0 0 k b 的区域t 零点设鬣 簌x i s t 塞确子p l 。寒巍正义鞫蔽叟链韵转录奉势聚子线条上蕊和下巍。字 鞋子是实心方块。童秩t s i x 转 录起点! - jc p o 密含区域相连( 始示为兰肯j 孵) 。生启动予所在的c p 6 宦含区域耳i id x p a s 3 4 。途中还- 娃永 丫包禽x i c 活性的能够艇挥作用因予的作用的一个3 5 k b 的转基斟片断，一个去掉作用，件的6 5 k b 的片断- 鞋教戆骖蓑挥失活诈粥( + ) 黎l 不能笈辉失疆箨掰( 一) 翡秘令g o k b 瓣， 辑。 虽然x i s t 功能的丢失增加了突变x 染色体成为x a 的几率，x i s t 表达增加的染色体成为 9 中曩农业丈学埂士学位论文文献综述 1 i ii ii ii l li l l l li l l l l l l i i i l l l l i 葛曩鲁舅麓s ! 黉i x a 瓣蔻攀也畿夺了在雄性e s 鲴聪中，将a f f s t 上游2 5 k b 的片段两带钶逡释标志的p g k - 1 启动子替代后发现x i s tr n a 水平升高了”。带有这种替代的雌性杂念体小鼠体细胞表现出 x 失涯的捩察，靶染色体戏势x a 瓣托攀仅必1 0 - 2 0 。p g k - 1 赢动子移除嚣x 失活酶陡梳性 恢复。班上证攒说明，x s t 转录的增加对于x a 的逸择舆霄负丽的影响，与) f r e t r n a 降低姐 止因子葶珏传用既搏的缝食的瑕说是一致的。 融，一种x i s t 麴菠义转浸本，难囊影骥x 曩浆选撵 1 9 9 9 年，几个研究小组阍时报导在e s 细胞中发现了x i s t 的反义转渌本5 9 6 1 这种因与 洳爱义藤被螽名为黏秘豹转录本越始予3 端下游 3 轴，瑶伸潦蓬鼢 壹至箕启动子嚣域 ( 圈3 ) 6 0 a 随后发现了t s i x 的启动子及其约4 k b 的拼接产物”。同x z s t 一样，t s i x 没有阅 读椴，不编码骚自。 t s i x 的表达模式为其功能的发现提供了缀多有用的线索。t s i x r n a 主簧在e s 细胞积分 佬串静缨藏中捡测到“，蹬示箕功髓与x 失涟的起始有关。每蛩在雌性和雄性e s 缁脆捡 涮劐x t s t 袭这信号融。t s i x r n a 总是跛蓬整绥号存在”。分纯时，t s i x 表达扶x i 上消失+ x i s tr n a 扩畿毽嘲整条x 絷色体5 9 , 6 0 。两t s l x 表这倍弩在x a 上继续持续凡夭的甜闻置眈 x i s t 持续时间长”曲。t s i x = 葭发商胚胎组织的随机x 失活中显示同样的表达模式地“。扮赶 的表达帮x i s t 豹零稳定袭迭捷又 j 意谈裁t s i x 霹戆是一糟x i s t 静受调繁物。 雌性细胞中删除主嚣拄廖动予显著降蠛了反义转录本的水平，使锝x a 选择偏离靶t s i x 落 锭基霞5 t “。炼性绸稳孛剿豫菇葫等像基因的染色律被德撵为x a 的凡率撒多为4 ，而在雄性 细胞中t s x 的删除对x a 的选择并无影响。说明始吐不魁馋用煎件。在强汝启动子- 与x i s t 的3 本 端之闻插入一终j 子5 6 6 3 嚣致反义转隶奉躺消失。辑鼓，当与野生叠豁船竞争对。带有赫缺 炎鹃絷体，k 乎无一铡井钧披选择成为x 4 帮埘。这些缱聚说明，t s i xr n a 的佟趣主要是一 增强终姆恧纷与黢l t 鞭予的结台，然薅鸯僚的楚，肖瑚e f - l a 寤动子增强t s i x 在来分忧缁飚中 的转录时6 5 并没有发现倾向惶的x 灸活。谎明离丁i 正常水平韵t s x 转泵本并不能增加x a 选择 的颧自蛙。 除了影响x a 的选择外，转录本顺势影响r n a f i q 丰度，拄强血等位慕因缺失最严重的绸瓤， 中两农业大学硬士学位论文文献综述 i i ! l l l l l 皇尊舅舅鼍黛墨董邕嘲葛墨曼嘲蠢舅鼍嘲皇麓 露秘r h a 魄黔生型绷糕瑟悫的多蝌。 x c e 效成霹貔与赇a 的稳定性蠢关 x 选择嚣幢( x c e ) 链子_ 溉对懿下游，鼹趣之终“带番龇等袋然嚣戆染彀俸蹩骞萎被选 择成戈x a ，来自带褒强鼢e 等位基因晶窳的雌性成体缎级比来自弱殷# 等位蒸因最系懿雌性 成体缀织表这蔓强躯旅时r n a 瘩乎”，秘使攘分化戳藏，瓣蛙杂会瓣8 等攮藻因e s 鲴熬系鬟 示骚舔弹列a 信号，强蝴殛等位基因所嶷絷夔傣纛暴强蛉t m x 转袋本镣母”。这些结果表骥， 像，x 如一榉，胁通过顺势作用，点接或赣邋过豇魏间接的调 萤x i s t r n a 的水平。 x 染色钵的活性和失港鲍禽遥 一盛选定了与常染色体鞠当静x 染魏律麓量，下步就是决宠蚤个x 染色体失活滟最终 螽运。豫了辩既定静x ；进行失活蕊辫，还要绦证共有潇性的x a 在珏詹的过穗不被失活诩予 重耨失鞭。 x i s t r n a 瓣蹭热每箕蹲染色钵鹣魁霭斓沉虢有笑 定鼙r 誊托r 最零e s 鲴辙释壤蛙蒋缨耱巾豹藏 心a 靛爨稳蓑1 0 - 2 0 倍t m 5 辫。遂姆结 果驻示在蕊l 礴专录本颓势怠强x 染色髂使得鏊蟊沃默t t 重x i s tr n a 水平增加。枣实谥弱，来势 亿缨胞d i x i s t r n a 鹣增期会镬褥掇蓠窭现x l 毒轴3 j ”8 弗。体缕憝孛域熟缒勰矮专录本靛半衮辎 是憝骀缎怼每骢2 偿”钟。掰菝，令攒胃辘戆髅设藏胁 a 半囊麓鹣增魏憝絷题体必 活豹一个羲掇。 x i s t 赇a 书瘦熬鬻热受多重戳素熬调节 x i s t r n a 在分纯瓣期半襄翊戆增女l 霹默逶遘溉媾慕零鑫骞熬数瓷蠛者政交诞 孙勰 r n a 稳定健滟因子来这翻。壤多小缀都逶避试验采戮究了x i s t r n a 豹攒麴燕否莛癌予擞稳定 翳捞接规翳。遥过r t - p c r 翁方法笈瑰，醛缀施鞫浆瞧体缨箍的攒接税蠢l 怒相麓静”，”，谎 中圈农业大学硕士学位论文 文献综述 薯一i l l i l l l l 期曩篇曩黑蔓糟靠墨- 自曩 明在x i 发生过樱中没有不间的拼接机制发生。然而，也有可能由于r n a 分子太大，另外一 弛拱接规毒报滩被检测到。一个毖鹱好的搂燮试y x t s t 转荣本在来势证缎腿秘努纯缨巍牵 存不羁豹襄动予产生8 ；扶体纲耱靴囊凌予褥劐煞辖漾本魄较稳定，褥殛狳辩麓的寤葫予位 于更上游6 6 k b 的p 0 得到的转泶本不够稳定“。分化时，从p o 翻 p 1 的转变石的产生稳定的转 录本，镁寇x l 的命运。然薅不牵的是，嚣寒鲍醭巍势没袁控铡瓢默粥的转交，默产爱鳇产 物也不是那么稳定，撵除r 辩假说6 9 。鼹媒最本麴襻在帮懿及鼬寤翡子下游离发缣守静棱 糖体蛋白假基阂产象的复杂的转录本开始浮现出来6 9 ”。 由予农x a 躲选撂过程r 挚t s i x 的袭达会觎慧秘 r n a l 孽水平5 4 s 6 6 3 ，嚣一糠般甜r n a 稳定豹 机制为在x i 上关闭如酬内表达。x i s tr n a 一堕开始包嗣x i ，t s x 的液达马上被关撺5 9 脚。当由 于e f - l a 启动予的原因使得转挽持续糍水平袭达不糍艘美撵时，x i s t 州a 苓筑趣雕秘失瀵 x 。练会班上结象，t s i x 在x ；上的泼默熊够健撵产艇豫建p f j x i s tr n a ，方餐其髅势扩鬟秽 失活x 染色体。然而，t s x 转最的缺失在绝大多数e s 绷胞中不会导致产生异位x 必活“，”。 所以，还有禺韩的靠寐调节x i 在分化艇的失泼。 黻性细耱分化时x i s t 活性的增加韵一个撮好的懈释避x i s t 转潦本的激活。x i s t 在雄性 e s 细臌和雌性体缃照中的转录速度胡当“。说鞠在x i s t r n a 顺势扩鼹辍恕匣染龟体融的 转泶激活最微小的。这秘微小的增加足以使锝x i s t r n a 的拳袭期延长扶蓑褒x i 土发挥终瘸。 棱鬣囱复合体的形成需要一个x i s tr n a 的湖值。理论上，x i s t 的转录速率可以鞭描t s i x 韵 f 调节米精确调楚班限截其在来势识e s 细胞中和骚出复台体的形成。进入失疆时期b 重，x i s t 转最爨的微小增加即可达到形成由功能的棚溪白艇会体的鼙。由予x i s tr n a 能够关阙搬邻 鹃薤粥9 ，简样可诅芙闭t s i x 的表达。而t s i x 的关闭芷荷加强了x i s tr n a 的活性。使得x 染色体爽话。 x s t 的爽遥区域对x i 失活起掰檄丈作用 一 虽然通亟f i s h 分析发现攫多x i c 转然阁在8 s 细胞中都能梭测至表选信号，渴没奄棼 拷j i i 转基闻在分纯时产生x i $ lr n a 并顺势能丽染色体调髓其尖活的报道”。相反的是，分 化开始韵j l 夫内，搬多细胞照示出徽弱的，分散的x i s t r n a 信号，j k 乎掰套的绑臆摄蕨饿蝣 r n a 袭达垒热消火了。这些炼聚说明 & 餐x i s tr n a 增加的矧x i s tr n a 顺势扩震蚋鳆域煞 j 2 中莓农馥走学蘸士学位论文文赫练述 转基因上缺失了，或者单拷贝基因不能克服位置效应。与z 相比，约3 5 k b 的多拷贝转基因 链够忠实鬟蕊x i c 瓣功戆”，说臻在转蒺因弱弱区域静元 譬霹鞋饕钱肇拷委转基爨缺失的部 分，或者说多拷贝基因对位置效应不是很敏感“。 一段跑较；l a 注蠢瀚蒸因是包含x i s t 癌动子p l 。t 瀣l k b 总长约8 0 k b 豹x i c 转攀弱，这 段转基因虽然多于1 0 个拷贝，但其r n a 仍然不能正常包围和沉默x 染色体”。另一段包 含x i s t 上游约3 0 k b 长度的总长8 0 k b 的转基因则能够j e 常作用，说明) ( i 作用元件位于转基 毽上游3 0 k b 豹亭列蠹( 蚕3 ) 8 。龟禽魏嚣薛麴最枣熬区域应该慧一段多拷妥的惫会上游 9 k b 的总长约3 5 k b 的序列”。段包含一个d n a s ei 简魔敏感位点的2 5 k b 的序列位于本元 件内，假是删除本序列对于x 染色体必活没有影响”。 x a 的产生需要通过多重机制以抑制x i s t r n a 的顺势作用 在稳定豹x i s tr n a 歼始其在x i 上豹终弼辩，x a 继续表逡t s i x 释不稳定豹x i s t r n a z 6 , 3 7 , ”。虽然t s i x 通过顺势作用减弱x i s t 的稳定性。这一步骤并不是必需的，因为多数 没有t s i x 功能的雄性细胞也能产生x a 5 ”6 , a 3 。很有可能碾止因子通过干扰转录激活防止稳定 x i s t r n a 在x a 上的璞鸯鬟。 产生x a 时在x a 和x i 上x i s t 启幼子甲基化的程度不同，说明d n a 甲基化在控制x i s t r n a 表达时起作用”。体细胞中x a 上的x i s t r n a 崩幼子被甲基化，而在表达x i s t r n a 的 俸爨稳豹嫩上和来势纯豹e s 鲴癃串鹣舞条豢色体上警萋_ 乏程度帮魄较轻7 2 d n a 甲薹纯 酶l ( d n m t l ) 突变体的袭型说明在x a 决定中d n a 甲纂化是起作用。襁未分化的雄性d n m t l 突变体e s 细胞中，x i s t 启动子甲基化糨度很小，在分化时也不会堂获甲基化的功熊。突变 雄性e s 鬟麓曩示正繁戆x s tr n a 表达信号。熬焉程分亿辩，其在零该选择成为x a 匏染色 体被x i s t r n a 包围并必活“。在d n m t l 突变胚胎中少摄的雄性和雌性体细胞也显永异常的 x 染色体失活“。这些继果显示在x a 决定的机制之一是d n a 甲基化，甲基化可以抑翩藏 在x a 上麴转录。 对x a 的选择和决定做一总结 如果把与x a 选择和决定的相关资料和数据总结在一起，可以看到一个协调的作用过程。 中国农业大学确士学位论文文献综述 在分化之前，胚胎细胞还没肖选择哪条染色体成为x a ，分化时才选择x a ，在这个过程中， 雌性细胞中的两条染色体竞争数量有限的阻止因子。选择元件通过顺势作用影响作用元件与 疆史辫子粒结合。x i s tr n a 就是一个典鹫的选择蠢锌，冀受瑟影响阻止黼子与作用元佟的 结合。这种负面的选择活动可能是x i s t 和蛋自复台体沉默作用的一静体现。与之楣反，t s i x 转录本则通过降低x i s t r n a 的稳定性和x i s t r n a 在作用元件的量来促进x a 的选择。阻止 因予与x a 上作罐元锌的的结台使褥细穗可阻区分x a 和慈，是两条染色体分纯静第一步。 x a 和x i 命运的锁定是在其决定阶段。为了使得假定的x i 失活x i s t 活性顺势增加。 一种髓够调节x i s tr n a 转录和稳定性韵反式调节戳子在决定除段发挥作阚。x i s t 糊峨稳定 性的魑 午增加即可使褥有功能的x i a t 复合体活性增加。禚x i s t 疆瞧的增自可鞋关闻豇& 转 录本对x i s t r n a 的不稳定作用从而使得x i