（分析化学专业论文）卷烟烟气中烟草特有亚硝胺的新分析技术及其对酶活性影响的研究.pdf

湖南大学化学博士后流动站常德卷烟厂博士后科研工作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) 摘要 本报告在广泛的文献调研和实验研究基础上，首次在国内研究建立了用于卷 烟烟气中烟草特有n 一亚硝胺( t s n a s ) 分析检测的气相色谱分离一质谱检测一选 择离子监测( g c m s s i m ) 新方法和液相色谱分离一二级串联质谱检测 ( l c m s m s ) 新方法。研究结果表明，两种新方法均具有重复性好、回收率高、 仪器通用性强的特点。g c m s s i m 新方法的检出限与g c t e a 法相当，而 l c m s m s 新方法的检出限远低于g c t e a 法的检出限。本报告分别采用这两种 毅方法测定了国内外有代表性的l o 种品牌卷烟烟气中t s n a s 的含量。研究结果 表明，就烟气中t s n a s 含量水平而言，混合型卷烟远远高于烤烟型卷烟，国外烤 烟型卷烟显著高于国内烤烟型。这些研究成果为制定我国卷烟烟气中t s n a s 技术 壁垒提供了可靠的技术基础，对于遏制外烟进入中国市场、保护我国卷烟消费者 的健康，对于我国卷烟企业的发展壮大，具有十分重要的意义。另一方面，这些 成果对于建立卷烟“安全程度”评价体系具有重要的参考价值，对于“降焦减害” 工作具有积极的推动作用。 本报告首次( 在国内外) 开展了烟草特有n 亚硝胺对谷氨酸脱氢酶( g l d h ) 生物催化活性影响的研究。用计时电流法的实验研究结果表明，n n n 和n n k 对 g l d h 的生物催化活性均有明显的抑制作用，机理上属可逆竞争性抑制。实验测 得2 5 0 c 、p h 8 ，0 时，n n n 和n n k 对g l d h 催化活性的抑制常数分剐为1 9 9 和 1 7 6 p m o l1 。 关键词：卷烟烟气，烟草特有亚硝胺，分析技术，气相色谱- 质谱联用，液相色谱串联质谱 联刚，活性，谷氮酸脱氢酶，抑制，抑制常数 湖南大学化学博士后流动站常德卷烟厂博士后科研上作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) a b s t r a c t i nt h ep r e s e n t r e p o r t ，t w on e wm e t h o d s ，b yg c m s s i ma n dl c m s m s ，r e s p e c t i v e l y , f o rt h ed e t e c t i o no f t o b a c c o s p e c i f i cn n i t r o s a m i n e s ( t s n a s ) i nc i g a r e t t es m o k e w e r e f i r s te s t a b l i s h e di nc h i n ao nt h eb a s i so fe x t e n s n el i t e r a t u r e i n v e s t i g a t i o n a n d e x p e r i m e n t a lr e s e a r c h i tw a ss h o w nt h a t b o t hm e t h o d sw e r ec h a r a c t e r i s t i co fg o o d r e p e a t a b i l i t y , h i g hr e c o v e r y ，a n ds t r o n gg e n e r a l i z a t i o no f t h e i ri n s t r u m e n t s t h el i m i to f d e t e c t i o no ft h en e wg c m s s i mw a sc o m p a r a b l et ot h a to fg c t e aa n dt h el i m i to f d e t e c t i o no ft h en e wl c m s m sw a sf a rl o w e rt h a nt h a to fg c t e a t h et w on e w m e t h o d sw e r eu s e dt od e t e r m i n et h et s n a sc o n t e n t si ns m o k eo f t e nb r a n d s o f c i g a r e t t e s ， w h i c hw e r ef a m o u sa th o m ea n d a b r o a d e x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h et s n a s l e v e li nt h es m o k eo fb l e n dc i g a r e t t e sw e r em u c h h i 【g h e rt h a n t h a to f v i r g i n i ac i g a r e t t e s a n dt h a tt h et s n a sl e v e li nt h es m o k eo f f o r e i g nv i r g i n i ac i g a r e t t e sw e r er e m a r k a b l y h i g h e rt h a nt h a to fc h i n e s ev i r g i n i ac i g a r e t t e s t h e s er e s e a r c hr e s u l t sw e r eo fg r e a t i m p o r t a n c e f o rt h e d e v e l o p m e n t o f c i g a r e t t ee n t e r p r i s e s i nc h i n aa n df o rt h e a d v a n c e m e n to f “r e d u c i n gt a ra n dt o x i c a n t si nc i g a r e t t es m o k e ” a l s oi nt h e p r e s e n tr e p o r t ，t h e e f f e c to f t s n a so nt h e b i o - c a t a l y s i sa c t i v i t yo f g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e ( g l d h ) w a sf i r s ts t u d i e da th o m ea n da b r o a db y ac h r o n o a m p e r o m e t r i c m e t h o d i tw a ss h o w nt h a tn n na n dn n k r e m a r k a b l yi n h i b i t e d t h e b i o c a t a l y s i sa c t i v i t y o fg l d ha n dt h a tt h ei n h i b i t i o n t h ei n h i b i t i o nw a sa t t r i b u t e dt or e v e r s i b l ec o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n t h ei n h i b i t i o nc o n s t a n t sf o rn n na n dn n kt og l d hw e r ee s t i m a t e da sl9 9 m a d17 6 b m o l1 一，r e s p e c t i v e l y , a t2 5 。ca n d p h 8 0 k e y w o r d s ：c i g a r e t t es m o k e ，t o b a c c o s p e c i f i cn - n i t r o s a m i n e s ，a n a l y t i c a lt e c h n i q u e ，g a s c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y s e l e c t e d i o n m o n i t o r i n g ( g s m s s i m ) ，l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( l c m s m s ) ，a c t i v i t y , g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ， i n h i b i t i o n ，i n h i b i t i o nc o n s t a n t 湖南人学化学博士后流动站，常德卷烟厂博士后科研工作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) l 。绪论 烟草是舶来品，原产于美洲。明朝万历年间( 1 5 7 3 1 6 0 2 ) ，烟草 开始传入中国“1 。烟草是一种特殊的食品。虽然它不能吃，不能喝， 不能满足人们生活中饥饿与营养的基本要求，但是吸食烟草制品可以 满足人们生理上的需要。所以，烟草是一种特殊的精神食品。 烟草的生产、加工和制作已有几百年的历史，但众所周知吸烟有 害于健康。到了2 1 世纪的今天，尽管戒烟、反吸烟的呼声日益高涨， 但烟草业的发展却没有因此而衰退。相反，烟草业目前呈现出向高产 量、高档次、多品种、多规格的方向发展的趋势。这里既有人们生活 习惯的原因，也有发展经济的需求。烟草已成为国际国内市场上最重 要的经济作物之一，它不仅仅是1 0 0 多个国家烟农的收入来源，而且 涉及不同生产部门和批发零售环节的整个烟草行业已成为许多行业及 发展中国家的重要经济力量。1 。随着烟草业的发展，许多国家的地方 和中央政府的税收有了大幅度提高。我国也不例外。我国是世界上第 三大烟草生产和消费国，烟草在中央和地方财政收入中占相当大的份 额。正因为如此，各国政府( 包括中国政府) 在面对是全面戒烟还是 提倡研制安全型卷烟这一重大抉择时，大多选择了后者。因为只有生 产出可靠的安全型卷烟，才能既减少了吸烟的危害，又不减少国民经 济的收入。这也正是我国烟草行业现阶段科技创新的重点所在，即“降 焦减害”一进一步降低卷烟的焦油量，并选择性地减少或消除卷烟中 的有害成分，以提高吸食烟草的安全性。 众所周知，烟草业的蓬勃发展得益于烟草科学技术本身及其相关 型塑查堂垡兰堕主堕望垫塑! 堂堡堂塑! 壁主亘型堑兰堡塑堡主巫婴壅塑堂! ! ! 塑! 科学技术的巨大进步，可以说如果没有这些科学技术成就的强力支持， 烟草业就不可能在全球经济中占有目前如此重要的地位。毫无疑问， 科学地“降焦减害”应当以对烟草和卷烟烟气中化学成分，尤其是有 害成分，进行准确的定性定量分析测定为基础。因此，分析化学在烟 草科学技术发展中具有十分重要的作用。 烟草的化学组成本身就很复杂，而在吸食过程中由于高温下干馏、 热分解、热转化、热合成等一系列物理、化学作用的发生，又生成了 许多新的化学物质，因而卷烟烟气的化学组成更加复杂。卷烟燃烧后 产生的气溶胶分为气相部分和粒相部分”1 。气相部分约占整个烟气重 量的9 2 ，其中包括有机物和无机物的蒸汽，过量的氮气( 约5 8 ) 、氧 气( 约1 2 ) 、二氧化碳( 约1 3 ) 、少量的碳氢化合物、含氧化合物以及 其它成分，并且含有具有生物活性的物质。粒相部分约占整个烟气重 量的8 ，主要由烟碱、焦油和水分组成。 据报道n3 ，到目前为止已经鉴定出烟叶中化学成分达2 5 4 9 种，卷 烟烟气中的化学成分达3 8 7 5 种( 其中1 1 3 5 种是烟草本身就有的，另 外2 7 4 0 种是烟气中独有的) ，烟叶、烟气合计共有5 2 8 9 种化学成分。 在这些化学成分中，绝大多数是无害的，有的还对人体有益，或对吸 食有益( 如致香成分等) ，但的确存在着许多有害成分。卷烟烟气气相 中的有害成分主要有一氧化碳、氢氰酸、挥发性醛类物质、挥发性亚 硝胺、氯乙烯、氮氧化物、氨、吡啶和气相自由基等。卷烟烟气粒相 中的有害成分主要有烟草特有亚硝胺、异质环状胺、萘胺、其他亚硝 胺类、苯并 a 芘等稠环芳烃类、单元酚及多元酚类( 如儿茶酚) 、固相 自由基、钋2 1 0 、铀、镍、镉等。焦油中的有害成分约占总量的o 6 ， 在0 6 的有害成分中，0 2 为致癌和可能致癌的成分，o 4 为辅助致 癌成分。在44 种被国际癌症研究会( i a r c ) 定为已知的人类致癌 塑塑盔堂些堂盟主重鎏垫苎! 萱堡鲞塑! 堕主重型笪三缝塑堕主星堕塞塑堂! ! ! 坐! 物中，已在主流烟气中发现了lo 种；在50 种很有可能的人类致癌 物中，已在主流烟气中发现了9 种；在227 种可能的人类致癌物中， 已在主流烟气中发现了48 种”1 。在这些有害成分中，人们最关心的 是烟草特有亚硝胺类( t s n a s ) 、稠环芳烃类( p a h ) 和自由基类物质。 虽然它们在卷烟烟气中含量很低，但都具有很强的致癌活性。 吸烟与健康是烟草行业在未来发展中面临的主要挑战之一。烟草 行业从7 0 年代就开始重视这个问题，8 0 年代以后更是把降低焦油等 有害成分作为主要研究课题，进行了多方面的探索与攻关，获得了许 多重大进展。现在我国卷烟平均焦油释放量己从过去的3 0m g 支以一卜 降到1 6m g 支以下“1 。但是，卷烟降焦是一项十分艰巨而复杂的工作。 随着焦油含量水平的降低，降焦的难度越来越大，既要考虑健康问题， 又要满足消费者的生理需求，两者兼得难度很大。因此，降低卷烟烟 气中有害成分的研究越来越受到重视。近年来，我国烟草行业内外有 关科研单位、烟草公司和企业已逐步投入人力和物力，着手开展降低 卷烟烟气中有害成分的研究。 本章拟就卷烟降焦减害、烟草特有亚硝胺及其生物学效应等方面 的研究现状作一简要综述，并提出本报告的基本构思。 1 1 卷烟降焦减害与烟草业之发展 2 0 世纪5 0 年代美国市场销售的卷烟平均焦油释放量为3 5 m g 支， 到1 9 8 4 年已降到1 2 5 m g 支；2 0 世纪8 0 年代以来，低于1 5 m g 支卷 烟占市场的比例一直保持在6 0 左右；低于6 m g 支卷烟的市场份额也 逐渐增加，占市场比例己由1 9 8 6 年的1 0 1 增加到1 9 9 5 年约1 2 ，总 销售量为2 0 万箱左右。在日本市场上，在1 9 8 7 1 9 9 4 年的近2 0 年中， 卷烟的平均焦油释放量和烟碱量已由1 8 m g 支和1 3 2 m g 支分别下降 塑塑墨堂垡兰竖主亘亟垫塑! 堂堡堂塑! ：堕主亘型堡三堡塑壁主巫婴窒塑宣! ! ! ! ! ! 一 到了9 5 m g 支和0 7 8 m g 支，低焦油、低烟碱、淡味混合型卷烟的消 费量也逐年上升。目前低于6 m g 支卷烟的消费量占日本卷烟销售总量 的4 0 以上，低焦油、淡味型卷烟已成为日本卷烟市场的主导产品。 在欧洲，2 0 世纪9 0 年代初，德国、英国生产的卷烟焦油释放量的加 权平均值都在1 2m g 支一1 3r a g 支，奥地利平均为1 1m g 支左右。1 9 9 6 年，英国市场上卷烟焦油释放量低于l o m g 支、6 m g 支、4 m g 支的卷 烟所占市场份额分别达到了2 5 2 、8 4 和2 4 ，共占3 6 。德国卷 烟焦油释放量低于l o m g 支的卷烟已占市场份额的3 0 ，焦油释放量低 于4 m g 支卷烟的市场份额也达到了6 。另外，瑞士低焦油卷烟的市场 份额也已超过了5 0 ”。 我国烟草行业对卷烟降焦工作也非常重视，投入了大量的人力、 物力和财力研究和开发卷烟降焦技术，已经取得了许多成果。目前许 多卷烟企业已经初步掌握了卷烟降焦的各项技术，全国卷烟平均焦油 释放量已由7 0 年代初期的3 0 m g 支以上，降至现在的1 6 m g 支以下。 近些年来，国内外的许多研究机构和卷烟企业对降低卷烟烟气中 的有害成分进行了一些研究，取得了一些阶段性成果，为进一步开展 降低卷烟烟气中有害成分的研究奠定了良好的基础。 目前，降低卷烟烟气中有害成分一般都是通过降低卷烟的焦油释 放量来实现的阻1 。通常降低卷烟焦油释放量的方法有选育低焦油烟草 品种睁川、开发新的栽培与调制技术“1 、新的烟草加工技术“”1 、接 装滤嘴和应用滤嘴通风稀释技术、使用高透气度和静燃速度快的卷烟 纸、掺用烟草薄片、掺用膨胀烟丝和膨胀梗丝、研究开发不燃烧烟丝 的特种卷烟和侧流烟气少的卷烟等”。通过采用接装滤嘴可以有效地 降低卷烟烟气中的酚类成分，一般可达8 0 一9 0 。滤嘴通风稀释技术 则可以有效地降低卷烟烟气中的一氧化碳。然而，对于卷烟烟气中的 型童_ 大堂些堂竖亘堕垫塑! 堂堡鲞型! ! 要主重型婴三堡塑堕主亘竖塞! 堕! ! ! ! ! ! 有害成分如稠环芳烃类、亚硝胺类、氮氧化物和自由基等物质，上述 的方法均不能有效地进行选择性去除。 我国烟草行业通过大力推广应用各项降焦技术，已使我国卷烟的 平均焦油释放量有大幅度降低，而卷烟烟气中的有害成分也随之相应 减少。但是当卷烟的焦油释放量降低到一定水平之后，卷烟的香味、 吃( 吸) 味会受到影响，这是制约进一步降焦的重要因素之一。如果 能够选择性地降低卷烟烟气中的有害成分，而卷烟烟气中的香味成分 又能够损失较小，必将大大地提高卷烟的吸食安全性。这是解决“吸 烟与健康”问题的一条重要途径。 国际上对降低卷烟烟气中有害成分己开展了一些研究，如研究开 发不燃烧烟丝的特种卷烟和侧流烟气少的卷烟，采用通风滤嘴降低卷 烟焦油释放量和一氧化碳，采用加有功能性吸附材料的复合滤嘴，吸 附卷烟烟气中的一些有害成分而对卷烟的香、吃味几乎不产生负面影 响，从而实现对烟气中有害成分的选择性过滤。由于国际上许多国家 的卷烟焦油量已降低至很低的程度，面临的压力较小，因而降低卷烟 烟气中有害成分的研究还不十分活跃。美国专利”蚋介绍了一种在烟草 制品加工过程中可连续分析和去除有害物质的方法和系统。其工艺过 程是，先用一种溶剂对烟草进行处理，再采用免疫抗体紫外线技术对 溶剂沈提出的有害物质做连续不断地监测，并采用相应的处理技术有 效地去除其中的有害物质，最后通过抽提溶剂的净化处理和循环使用 还解决了该处理工艺的废液排放问题。希腊“”研制出了浸渍血红蛋白 的活性炭三复合生物滤嘴。其特点是使浸渍血红蛋白的活性炭几乎可 以充满三复合滤嘴中间段的整个空腔，大大提高了对卷烟焦油和其它 有害物质的去除率。目前，该生物滤嘴已开始商业化生产，并在希腊、 中国等国家的卷烟产品上得到应用。据美国专利“报道，该生物滤嘴 塑壹查堂垡堂堕主亘堕垫茎! 堂堡鲞型! 堕巫型塑王堡塑竖主亘婴塞塑童! ! ! ! ! ! 可以有效地去除卷烟烟气中的n o 、n o 、致癌性的亚硝基化合物、自由 基、醛类物质、i t 。0 ：、c o 、痕量元素等，并可将烟气中的有害成分截留 平均达9 0 左右。 目前，国内在降低卷烟焦油释放量方面也已出现一些成熟技术， 这些技术应用在混合型卷烟产品中起到了很好的效果。由于混合型卷 烟自身的特点，其焦油释放量较低，许多低焦油和超低焦油混合型卷 烟仍具有令消费者满意的生理强度。而我国卷烟产品以烤烟型卷烟为 主，其焦油释放量较高，降焦的难度远比混合型卷烟大的多。如果只 通过降焦这一条“独木桥”，我国烟草业势必难以赶上国际先进水平。 选择性地降低卷烟烟气中有害成分，既可以缓解降焦的压力，又可以 将卷烟烟气中的有害成分降到较低水平，在提高卷烟产品安全性的同 时，保证卷烟产品的风格不产生大的变化，实为中国卷烟降焦减害的 “上策”。戴亚等人“”从动物血中提取血红蛋白，添d n 至t l 滤嘴中，研究 其对卷烟烟气中亚硝胺含量的影响。结果表明，该滤嘴可显著降低卷 烟烟气中n 一亚硝胺含量( n a ) ，降低率为5 0 左右，而且对气相n a 和粒相n a 均有截留作用。郭灿成心0 1 发明了一种主要由与生物酶结构相 似的金属卟啉为主要原料制成的烟草生物降焦剂，加入滤棒中后，在 生物浓度下可以像生物酶一样催化降解b a p ，催化c 0 、n o 向无害气体 的转化，从而降低b a 9 和c o 、n o 含量，还可降低焦油量。马林等旺“ 将酶解和微生物发酵等生物技术综合应用于改变低次烤烟化学成分， 有效地降低了对吸食品质和安全性不利的蛋白质成分及小分子含氮化 合物( 如氨) 等。实验结果显示，用酶和微生物处理后烟叶中的蛋白 质降解4 1 3 4 ；烟气中的有害气体如h c n 、n o 、c o 分别减少了7 6 1 9 、 7 1 4 3 和4 2 3 3 ，焦油减少了2 6 0 1 。恽之瑜等“”研究了沸石作为 卷烟添加剂以去除烟气中亚硝胺，取得了良好的效果。这方面还有许 塑堕盔兰丝堂竖主生塑垫塑! 堂堡堂塑 竖主巫型竺! 堡塑堕主亘婴塞塑宣! ! ! ! ! ! 一 多优秀的研究成果。侧。 长期以来，烟草业始终关注消费者的健康，不懈地致力于降焦减 害的研究。对于降低卷烟焦油释放量的做法，最近医学界有专家提出 消费者抽吸低焦油卷烟反而比抽吸普通焦油卷烟更为危险，其理由是： 消费者抽吸低焦油卷烟时，虽然每支卷烟吸收的焦油量减少了，但由 于卷烟的生理强度降低而采取了补偿性吸烟，每天抽吸的低焦油卷烟 数量大大增加了，因此消费者每天实际摄取的卷烟焦油量并没有减少； 另一方面，消费者抽吸普通焦油卷烟时采用浅吸的方式，卷烟烟气主 要进入呼吸道和肺部，而抽吸低焦油卷烟时，由于卷烟生理强度不够 而采用深吸的方式，卷烟烟气进入到肺泡，对肺组织直接造成损害， 因此更为危险n ”。由此可见，即使竭尽全力将焦油降低至较低水平， 烟草业还会遭到非议，而选择性地降低卷烟焦油中的有害成分，同时 保持卷烟的生理强度，则是一条较理想的降低吸烟危害的途径。 降低卷烟烟气中的有害成分是烟草业的一项非常重要的任务，事 关行业的未来发展。除了要进一步研究降低卷烟焦油和烟碱量的技术 外，还要研究开发出一整套降低卷烟烟气中的自由基物质、苯并 a 芘、亚硝胺类物质、一氧化碳等有害成分的技术，提高我国的降焦减 害技术水平，提高我国烟草行业的整体竞争力，使中国烟草行业在世 界烟草竞争中处于更加有利的地位。 1 2 卷烟烟气中的亚硝胺和烟草特有亚硝胺 亚硝胺类化合物为人类所认识已有相当长的时间了，但是直到2 0 世纪5 0 年代n 一亚硝胺类化合物才被人们所重视并加以研究。首先是对环 境中的n 一亚硝胺进行分析。1 9 6 2 年，d r u c k r e y p r e u s s m a n n 。”提出由 烟草生物所衍生而来的n 一亚硝胺( 特别是n 一亚硝基降烟碱，& i j n n n ) ，可 塑童查堂些堂竖主鱼堕垫塑! 堂堡堂塑! | 旦主生型婴! 堡塑壁星婴塞塑堂! ! ! 坚! 能在卷烟烟气中存在。p r e u s s m a n n n ”等、n e u r a t h 等人“1 在1 9 6 4 年和 1 9 6 5 年开始对卷烟烟气中n 一亚硝胺的分析进行最初的研究，而对于烟草 及其制品中的n 亚硝胺的分析研究则始于m o r i e 等n 郇和h o f f m a n n 等”7 1 在 2 0 世纪7 0 年代初的工作。此后，对烟草烟气及环境烟草烟气中的n 一亚硝 胺，特别是对烟草特有的n 一亚硝胺的研究在国际上备受重视。 烟草中的n 一亚硝胺主要有四种存在形式，包括非挥发性的n 一亚硝胺 ( n v n a ) 、带亚硝基的氨基酸、挥发性的n 一亚硝胺( v n a ) 和烟草特有n 一亚 硝胺( t s n a s ) “”。烟草中的非挥发性的n 一亚硝胺主要是亚硝基二乙醇胺， 它是由于抑芽剂马来酰肼的使用而产生的。随着马来酰肼在烟草农业i 二 停止使用，烟草中亚硝基二乙醇胺的含量已经大幅度下降。 带亚硝基的氨基酸主要存在于烟草中，在卷烟燃烧过程中仅有很少 一部分( 2 ) 以游离酸或甲酯的形式转移到烟气中。 卷烟烟气中已发现的亚硝胺达3 5 种之多。其中挥发性n 亚硝胺主 要来源于氨基酸和蛋白质在燃烧时的分解，在烟气中的含量远低于 t s n a s 的含量。烟草中主要的挥发性n 一亚硝胺包括二甲基亚硝胺 ( n d m a ) 、甲基乙基亚硝胺( n e m a ) 、二乙基亚硝胺( n d e a ) 、二丙基亚硝 胺( n d p a ) 、- - 7 基亚硝胺( n d b a ) 、亚硝基吡咯烷( n p y r ) 、亚硝基哌啶 ( n p i p ) 、亚硝基吗琳( n m o r ) 等，它们的结构如图卜1 ( f i g 卜1 ) 所示。 由于醋纤滤嘴对挥发性卜亚硝胺有显著的过滤作用，因此挥发性n 一亚 硝胺的研究不太受人们关注。 湖南大学化学博士后流动站t 常德卷烟厂博十后科研= 作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) h 3 g n n o h 3 c n d m a h 3 c ，n n 0 h s r n n o l h s c 2 、 n n o h 。c 一 n n 0 ，弋、 on n 0 t s n a s 是烟草和烟草制品中独有的一类亚硝胺，在其它食品中尚未 发现，是由烟草内源性生物碱通过亚硝胺化作用而产生的“。在烟草及 卷烟烟气的四类n 一亚硝胺中，t s n a s 的研究最受重视。这不仅是因为其 含量最高，而且是因为它们都是有致癌活性。此类物质已被确认与肺部、 口腔、食道、胰脏、肝脏等部位肿瘤的发生有关。研究表明。”1 ，4 - ( 甲 基亚硝胺基) 一卜( 3 一吡啶基) 一卜丁酮( n n k ) 和n n n 对啮齿动物有强烈的 致癌性，n 一亚硝基假木贼碱( n a b ) 、n 一亚硝基新烟碱( n a t ) 、异一4 一( 甲 基亚硝胺基) 一卜( 3 一吡啶基) 一l 丁醇( i s o n n a l ) 和异一4 - ( 甲基亚硝胺 基) 一4 一( 3 一毗啶基) 丁酸( i s o n n a c ) 可能有致癌活性，h n k 和n n n 代谢 中生成的亲电试剂中间体，能与d n a 和血红蛋白形成共价络合物，并存 在于啮齿动物的特定组织，如肺、肝、鼻粘膜和食道等组织。烟草及卷 烟烟气中的七种主要烟草特有亚硝胺的结构如图卜2 ( f i g 。卜2 ) 所示。 0n n 趴o c c 7 7 h h on n 叭； c c 9 9 h h 湖南大学化学博士后流动站常德卷烟厂博士后科研t 作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) n n nn a b n a t s h j i n n 0 从毗。h is o n n a l o h n o n c h n n o c h 3 n n a l c h 。 n n0 厂飞协c 0 0 h k 。一 i s o n a a c f i g 1 2 t h es t r u c t u r eo f s e v e nm a i nt s n a si nt o b a c c o 由于文献报道诱发实验鼠形成肺部肿瘤的n n k 和n n n 的剂量明显高 于实际n n k 和n n n 的最大吸收剂量，所以烟气中t s n a s 在诱发肺部肿瘤形 成中的作用值得怀疑。国际癌症研究中心( i a r c ) 根据动物实验提供的足 够证据，认为：n n k 和n n n 在人体中可能有致癌性。由于n a b 对实验动物 的致癌性的证据较少，并且n a t 对实验动物的致癌性的资料不充分，所 以t a r c 认为n a b 和n a t 对人体的致癌性尚不能确定。烟草中主要t s n a s 的致癌性等级见表卜l ( t a b l e1 一1 ) ”“。 湖南人学化学博士后流动站常德卷烟厂博十后科研工作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) t s n a s c a r c i n o g e n i c i t y g r a d eb y i a r c n n i t r o s o n o r n i c o t i n e n n n 4 一( n - n i t r o s o m e t h y l a m i n o ) 一i ( 3 - p y r i d y l ) 1 一b u t a n o n e n n k n n i t r o s o a n a b a s f n e n a b n n it r o s o a n a t a b i f i e n a t 4 一( n n i t r o s o m e t h y l a m i n o ) 一卜( 3 - p y r i d y l ) 一l b u t a n 0 1 n n a l 4 一( n - n i t r o s o m e t h y l a m ir i o ) 一4 一( 3 - p y r i d y l ) b u t a n o i ca c i d n n a c g r o u p2 b + g r o u p2 b g r o u p3 + g r o u p3 g r o u p2 b g r o u p3 p o s s i b l ec a r c i n o g e n s u s p e c tc a r e i n o g e n 烟草中t s n a s 是由于天然存在的烟草生物碱的亚硝化作用而形成 的，化学反应机理如图卜3 ( f i g 卜3 ) 所示。许多研究表明，进入调制 叩。一p 小o 帅。 f i g 1 - 3 t h es c h e m ef o rt h ef o r m a t i o np r o c e s so f n n i t r o s a m i n e s 前的青烟不含t s n a s ，这主要是因为细胞内各类物质被细胞膜有效地 隔离开来，尽管烟叶内有丰富的前体物质，但它们不能相聚而发生反 应生成t s n a s 。b u s h 和b u r t o n 研究表明”， t s n a s 的有效积累吲调 制过程中烟叶细胞膜的破坏同步。当烟叶晾制两周后，随着烟叶水分 的散失，细胞膜遭到破坏，膜的透性迅速增大，细胞内物质外渗，紧 接着在晾制第3 周t s n a s 的形成和积累就达到最高峰。d j o r d j e v i c 等”1 、a n d e r s e n 等1 、h e c h t 等m3 、c a l d w e l1 等5 、c h a m b e r l a i n 塑里查兰些堂竖巫亟塑塑垡堡童型! 壁主星型丛生堡茎堡主亘堕塑堡童! ! ! 竺! 等b 7 j 研究证明，烟叶中烟草生物碱和t s n a s 有直接的相关关系。烟碱 与n a n o ：在p h2 和p h5 、2 0 。c 下形成n n k 和n n n ”。 e c h t 等”5 用放 射性同位素标记实验得出，烟碱和去甲基烟碱是n n n 的主要前体。 c a l d w e l l 等“刚用动力学研究数据证明去甲基烟碱才是n n n 的主要前 体。p j o r d j e v i c 等3 1 、a n d e r s e n 等5 “、c h a m b e r l a i n 等b ”的研究也 表明，n n n 和去甲基烟碱之间的相关系数比n n n 和烟碱之间的相关系 数要高。d j o r d j e v i c 等“3 1 指出n a t 和n a b 的前体物质是新烟草碱、假 木贼碱和亚硝酸盐，并且它们之间的亚硝化作用只需在温和条件下形 成。b r u n n e m a n n 等1 和f i s c h e r 等”认为t s n a s 和n o ：i 之间有显著的 正相关关系，但是m a c k o w n 等却认为n 0 。和t s n a 之间没有相关性m “。 w i e r n i k 等1 ，b u r t o n 等3 ，d j o r d j e v i c 和a n d e r s e n 泓1 研究得出 ? s n a s 与n o ：之问有显著的正相关关系，并进一步得出n o ：是t s n a 积累 的主要限制因素。t s n a 。各组分与其前提物的转承关系如图卜4 ( f i g 1 - 4 ) 所示。 嘏钾 毋 1 掌 嘏。 咿鼹冀n 7 罾” f i g 1 - 4t o b a c c o s p e c i f i cn i t r o s a m i n e sa n dt o b a c c oa l k a l o i dp t e c u r s o t $ w i t h t h e e x c e p t i o no f n n a ，a l lh a v e b e e nd e t e c t e d i n t o b a c c o p r o d u c t s m 、z k j y w正。 ) 一 l 8 0 。1 9 9 9 年李文寿“采用g c t e a 法同时测定了烟草中二甲基亚硝胺、n 一亚硝 基吡咯、n n n 、n a t 和n n k 等1 3 种亚硝胺和卷娲烟气中的n n n 、n n k 、 n a t 等1 2 种亚硝胺，评价了不同烟气收集方法对亚硝胺测定的影响， 比较了主流和侧流烟气中的测定结果。2 0 0 1 年，杨金辉等“。1 也用 g c t e a 法测定了烟叶中t s n a s 的含量。2 0 0 2 年，上海烟草( 集团) 公 司的金永明等“圳获得了一项有关g c t e a 分析烟草特有亚硝胺方法的 专利。 氮磷检测器是一种热离子化检测器，它只对含氮、磷元素的有机组 分有响应。由于烟草及卷烟烟气中含氮组分非常多m “，所以当使用这 种检测器时，要求采用合适的试样预处理技术，尽可能去除t s n a s 组 分的含氮化合物。1 9 8 3 年，c h a m b e r l a i n a r r e n d a l e ”曾报道用 g c n p 检测研究烟叶中生物碱含量与n n n 水平的关系。1 9 8 5 年， a n d e r s e n 等n 4 钉用这种方法测定了n n k 。1 9 8 9 年，d j o r d j e v i c 等n 1 1 用 这种方法测定烟草中的t s n a s 。1 9 9 1 年，c h o k r t y k 等“1 提出了一种新 的预分离t s n a s 的方法，并用g c n p d 方法测定了烟草试样中的n a t 、 n a b 、n n k 和n n n 。2 0 0 0 年，赵明月等h 7 1 报道了用毛细管g c n p d 方法 测定烟草和卷烟烟丝中的挥发性亚硝胺和t s n a s 。最近，刘万峰等”1 应用g c n p 检测测定了烟叶中烟草特有亚硝胺，预处理时间冗长。总 的说来，g c n - p 检测技术操作简便快速，无需专用仪器，但预处理要 求高，检测结果不如配用t e a 技术的精确度高，含量极微的n a b 不易 被检出。 湖南大学化学博十后流动站常德卷烟厂博士后科研工作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) 2 5 液相色谱法 由于t s n a s 属非挥发性或低挥发性n 一亚硝胺，所以用液相色谱法 分离应当比较有利。1 9 7 5 年，h e c h t 等“1 用配备有u v v is 检测器的 高速液相色谱法测定了烟草中的n n n ，耗时较长，做一个试样需要l d 。 1 9 7 9 年，h o f f m a n n 等盯“采用h p l c 与t e a 联用技术测定了烟草制品中 t s n a s ，分析速度大大提高。2 0 0 0 年辛慧君等”4 ”报道，用h p l c 一光水 解热裂解一t e a 联用技术测定烟草中n n n ，分离效果较好。2 0 0 1 年w a g n e r 等在c o r e s t a 会议上报道“4 4 “，用h p l c m s m s 联用技术定量分析烟 丝和卷烟主流烟气中的t s n a s ，各种t s n a s 组分的检测限均 0 0 5 n g m l ，且该方法分析时间短，可在短时间内处理大量实验样品。 2 0 0 2 年b y r d 等“3 报道了用l c m s m s 技术测定吸烟者尿液中n n k 的代 谢物n n a l 。p a c c o u 等也曾用这种技术测定鼻烟中t s n a s “1 。但由于两 级串联质谱价格昂贵，l c m s m s 技术的应用可能会受到限制。2 0 0 2 年，m u l l e t t 等n 3 “用管内固相微萃取技术结合h p l c 自动测定细胞培养 物中n n k 及其代谢产物，以u v 光谱法检测。该法简化了t s n a s 的测定 步骤，样品的总分析时间仅为3 0 m i n 。 一般认为，使用t e a 与g c 仪或h p l c 仪联用对t s n a s 进行分离、 分析、检测，具有其它方法不可替代的作用，其检测限为1 o n g g 。 但t e a 检测器存在着严重缺陷：对所有n 一亚硝基化合物均有响应， 不能区分共沈提的n - 亚硝基化合物，不能把干扰物与待测物分开； 死体积大，限制了g c 的扫描次数：检测限较高。此外，t e a 仪价格 昂贵，且专用性强，小实验室很难配备。 湖南人学化学博士后流动站常德卷烟厂博士后科研工作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) 2 6 结束语 总之，无论是毛细管g c 、h p l c 法，还是分光光度法；无论是u v v i s 、 n p d 、m s ，还是t e a 检测，都各有特色。然而由于烟草和卷烟烟气成分 极其复杂，这些方法不是预处理步骤冗长，操作速度慢，重复性差， 灵敏度不高，就是方法所用仪器设备昂贵。为减少吸烟对人类健康的 危害，烟草行业势必要建立健全烟草及卷烟烟气中t s n a s 的行业标准 检测方法，这对于严格控制卷烟质量，合理评估卷烟产品，解决烟草 及卷烟烟气中t s n a s 是否超高的争议都是非常必要的，对于推动“降 焦减害”工程也具有十分重要的意义。因此，研究建立一种快速、准 确、灵敏度高、重现性好、成本低的t s n a s 检测方法，仍然是烟草行 业当前的一项迫切任务。 湖南人学化学博士后流动站常德卷烟厂博士后科研 作站博士后研究报告( 2 0 0 4 ) 3 卷烟烟气中烟草特有亚硝胺分析 检测的气相色谱法研究 3 1 引言 前已述及，卷烟烟气中烟草特有亚硝胺( t s n a s ) 的定量分析测定 具有十分重要的意义。长期以来，用气相色谱或液相色谱分离，然后 再用热能分析仪( t e a ) 检测，是测定烟草和卷烟烟气中t s n a s 含量用得 较多的方法口。”“1 。然而，许多实验室都不具备t e a ，这不仅仅是因 为t e a 价格昂贵，还在于它的专属性强，只能用来检测含n 一亚硝基的 化合物，在其他研究方面难以发挥作用。 毛细管气相色谱分离，再用氮磷检测器检测”3 ，76 ”“”引或用 质谱分析仪检测的分析技术”，7 3 _ 8 “也已用于烟草和卷烟烟气中 t s n a s 的分析检测。这些仪器技术普适性强，烟草行业内的许多实验 室都已配备。因此，研究发展基于这些仪器方法的t s n a s 分析检测新 技术具有一定的现实意义。然而，目前已提出的方法普遍存在着试样 预处理步骤多、回收率偏低、重复性差、费时费力、环境污染严重等 缺陷。 本章研究了毛细管气相色谱分离一氮磷检测仪器方法( g c n p d ) 和毛细管气相色谱分离一质谱检测联用方法( g c m s ) 在卷烟烟气的 t s n a s 组分分析检测中的应用，建立了基于固相萃取预处理分离纯化 方法、选择离子监测模式的b c m s s i m 分析检测t s n a s 新技术。本章 利用这种新技术，通过实验测定评价了一系列国内外有代表性的卷烟 样品烟气中四种主要t s n a s 组分( 即n n n ，n n k ，n a t ，n a b ) 的水平。 型塑盔堂些! ：堡主亘鎏垫堑! 堂堡鲞型堕星型堑兰堡塑堕主堕型f 茎塑堂! ! ! ! ! 1 3 2 实验部分 3 2 1 试剂与材料 n - 亚硝基降烟碱( 即n 一亚硝基去甲基烟碱，m n ) 、4 一( n 一甲基亚硝 氨基) 一卜( 3 一毗啶基) 一l 一丁酮( n n k ) 、n - 亚硝基新烟草碱( n a t ) 及n 一亚 硝基假术贼碱( n a b ) 的标准物购自t o r o n t or e s e a r c hc h e m i c a l s i n c ( o n t a r i o ，c a n a d a ) ，纯度均大于9 7 ( 注：均为毒害品，致突变 剂! ) 。内标物三甲基“1 c 标记咔啡因购自i s o t e c 公司( m i a m i s b u r g ，o h ， u s a ) ，纯度大于9 9 ( 注：毒害品! ) 。 二氯甲烷和乙酸乙酯为色谱纯试剂。柠檬酸、磷酸氢二钠、抗坏 血酸、无水硫酸钠、甲醇、环已烷、丙酮等为分析纯试剂。硅藻土为 化学纯，1 0 0 - 2 0 0 目，经二氯甲烷洗涤净化后使用。碱性氧化铝， 2 0 0 一 3 0 0 目，化学纯。 卷烟样品购自本地零售商店，使用前置于可密封的塑料袋中于低 温冰柜中贮存。 3 2 2 仪器与装置 玻璃