（微生物学专业论文）根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究.pdf

华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 根癌菌特化类菌体繁殖能力的研究 摘要 根瘤菌n g r 2 3 4 ( r h i z o b i u ms p n g r 2 3 4 ) 是一种广宿主的根瘤菌，可以在近 1 7 0 多中植物上结瘤。本文选取了大翼豆( m a c r o p t i l i u ml a t h y o i d e s ) 、扁豆( l a b l a b p u r p u r e u s ) 、豇豆( h g n au n g u c u l a t a ) 、白灰毛豆( t e p h r o s i ac a n d i d a ) 和大豆( g l y c i n e m a x ) 五种植物进行了n g r 2 3 4 的结瘤实验。实验结果显示大翼豆可以在大翼豆、 扁豆、豇豆和白灰毛豆上结瘤，而在大豆上不能结瘤。其中在可以结瘤的四种植物 中，n g r 2 3 4 在大翼豆、扁豆和豇豆中可以结有效瘤，而在白灰毛豆上结的是不能 固氮的无效瘤。 为了更迸一步地确定结瘤情况和进一步的了解根瘤菌在根瘤中的形态，本研究 还采用电子显微镜对根瘤的超薄切片进行了观察。根据电子显微镜照片显示大翼 豆、扁豆和豇豆的根瘤细胞中含有较多的根瘤菌类菌体，而白灰毛豆根瘤细胞中只 含有较少的根瘤菌。扁豆、豇豆和大翼豆中的类菌体形态都以棒状为主。大翼豆和 扁豆根瘤中的类菌体含有较多的不着色颗粒p h b ，而豇豆中的类菌体基本不含 p 耶。 本研究还对大翼豆的根瘤中类菌体的繁殖能力进行了研究。从接种4 周开始每 周取一个根瘤进行实验。将采集的根瘤表面灭菌后，在离心管中压碎，用无菌水稀 释后分成2 份，一份用细菌计数器计数得到根瘤中的细菌总数作为根瘤中的类菌体 总数，另一份稀释涂布计数得到的c f u 数目作为可以繁殖的类菌体数目，进而得 到根瘤中类菌体的繁殖率。从实验结果可以看出随着根瘤年龄的增加，其中类菌体 的繁殖率是逐渐增大的。并且将接种n 周的植物置于暗室中培养一周后，人为达 到衰败的根瘤，测衰败根瘤中类菌体的繁殖率结果显示衰败根瘤中类菌体的繁殖率 比暗室培养之前的根瘤中类菌体的繁殖率提高了数倍。这个结果间接说明了处于衰 败期的根瘤中的类菌体可以再分化成为具有繁殖能力的细胞。 为了更进一步证实类菌体的再繁殖能力，还将大翼豆根瘤压碎得到根瘤汁稀释 后将根瘤汁进行显微微室培养，微室培养的片子在显微镜下定点观察单一类菌体的 繁殖生长情况，通过不同时期的根瘤中类菌体的繁殖能力不同，早期根瘤中类菌体 还是以棒状类菌体为主，但只有少量的小杆状类菌体可以再繁殖，而中期根瘤中的 类菌体的繁殖率明显比早期根瘤中类菌体的繁殖率高，晚期根瘤中的类菌体是棒状 类菌体，而这些棒状的特化类菌体也可以再繁殖成为有活力的细菌。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤苗特化类菌体繁殖能力的研究 本研究直接观察到了单个特化的棒状类菌体繁殖成为菌落，证实了关于类菌体 繁殖能力的繁殖论。结果表明根瘤中的类菌体可以在转化成为具有繁殖活性的小杆 菌，进一步繁殖成为菌落。 关键词：n g r 2 3 4 ；类菌体；繁殖能力；繁殖率 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 a b s t r a c t t h er h i z o b i u ms p n g r 2 3 4i sab r o a dh o s tr a n g es t r a i n i tc a nn o d u l a t eo na b o u t1 7 0 k i n d so fp l a n t s t h en o d u l a t i o na n dn i t r o g e nf i x a t i o na b i l i t yo fb r o a dh o s tr a n g es t r a i n r h i z o b i u ms p n g r 2 3 4o nl a b l a bp u r p u r e u s ，h g n au n g u c u l a t a ，m a c r o p t i l i u m l a t h y o i d e s ，t e p h r o s i ac a n d i d aa n dg l y c i n em a xw e r ec o n f i r m e db yu s i n gp l a n tp o t e x p e r i m e n t b a c t e r o i dd i f f e r e n t i a t i o nw a ss t u d i e db yu s i n gb o t ho fo p t i c a la n de l e c t r o n m i c r o s c o p i ct e c h n i q u e s b a c t e r o i dr e p r o d n c t i v i t yw a sc o m p a r e db yu s i n gv i a b l ec o u n t a n dm i c r o s c o p i ci n c u b a t i o n i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tn g r 2 3 4c o u l df o r me f f e c t i v e n o d u l e so nl a b l a bp u r p u r e l 岱，h g n au n s u c u t a t aa n dm a c r o p t i l i u ml a t h y o i d e ， i n e f f e c t i v en o d u l e so nt e p h r o s i ac a n d i d aa n df a i rt on o d u l a t eo ng l y c i n em a x b a c t e r o i d o fn g r 2 3 4w a sm a i n l yi nc l u bs h a p ei ne f f e c t i v en o d u l e s n o d u l e sw e r eh a r v e s t e da n dh o m o g e n i z e da td i f f e r e n ts t a g e so fp l a n td e v e l o p m e n t m i c r o s c o p i ci n s p e c t i o no ft h ee x t r a c t si st h et o t a ln u m b e ro fb a c t e r o i d si nt h en o d u l e a n dt h ea l i q u o t so fe x t r a c t sw e r ep l a t e do ny m am e d i a , t h en u m b e ro fc f u si s c o n s i d e r e da st h en u m b e ro ft h el i v i n gb a c t e r o i d s r e s u l t sf r o mv i a b l ec o u n ta n d m i c r o s c o p i ci n c u b a t i o no fc r u s h e dn o d u l e si nm a c r o p t i l i u ml a t h y o i d e sd e m o n s t r a t e dt h a t s h a p ea n dv i a b i l i t yo fb a c t e r o i d sf r o mn o d u l e sa td i f f e r e n ta g e sw e r ed i f f e r e ds f i g h i l y b o t ho fs m a l ln o d sa n dm a j o r i t yo fc l u bs h a p e db a c t e r o i d sc o u l dr e p r o d u c ei na r t i f i c i a l i n c u b a t i o nc o n d i t i o n s t h er e p r o d u c t i v i t yo fb a c t e r o i d sw a si n c r e a s e dw i t ht h ea g e so f n o d u l e sa n ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e db e f o r en o d u l es e n e s c i n g t h ee x t r a c t so fn o d u l ew e r ep l a t e do l lt h em i c r o c h a m b e r a n dt h em i c r o e h a m b e rw a s p u ti nr o o mw h i c ht h et e m p e r a t u r ei s 2 8 t h eg r o w t hp r o c e s sw a sr e c o r d e db y m i e r o e h a m b e ri n c u b a t i o na n dv i d e or e c o r d i n g t h em o r p h o l o g yo fb a c t e r o i d sw a sc l u b s h a p e ，a n dt h ed u b b e db a c t e r o i d sc a l lr e d i f f e r e n t i a t ei n t ot h es t a t eo ff r e e l i v i n g , g r o w i n g b a c t c r i a k e yw o r d s ：r h i z o b i u ms pn g r 2 3 4 ；b a e t e r o i d ；d i f f e r e n t i a t i o n ；r e p r o d u c t i v i t y 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：罗肇伯时问：朋d 7 年月，7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：罗托确导师签名：夕习夕之苫 签名日期：加矽年6 月1 1 日签名日期：也7 年占月之日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 1 刖声 1 1 类菌体的概念 根瘤菌( r h i z o b i u m ) 经植物根毛侵入豆科植物根系后，能够刺激植物根皮层细胞 增生形成根瘤。侵入植物细胞后的根瘤菌能够与豆科植物共生并固定空气中的氮气 为氮化合物为植物的生长提供氮素养料。因此，豆科植物的根瘤可以说是植物的氮 素加工厂，而根瘤里面的根瘤菌就是这个氮素加工厂的工作人员。由于根瘤菌在农 业上具有相当大的贡献，它一直是农业科学家们研究的主要对象。而在根瘤茵研究 中，真正起到固氮作用的是处于植物根瘤细胞中的根瘤菌，而处于固氮时期的根瘤 菌是存在于植物根瘤中的根瘤菌类茵体，因而，类菌体自然成为根瘤菌研究学者的 一个主要研究方向。 据报道，类菌体一词首先是在1 8 8 5 年由一位科学家首次提出来的，他当时在 植物根瘤中观察到了一些特殊的膨大的和分支状的结构，他将这些结构取名为类菌 体( b a c t e r o i d ) ，但是他当时认为这些结构并不是细菌，而是植物产生的作为养料储 存的蛋白质体。在后来一些科学家的研究过程中也观察到了这种被称为类菌体的膨 大和分支状的结构，并证实这些所谓的类菌体并不是储存养料的蛋白体，而是侵入 植物细胞的根瘤菌，只是这些根瘤菌的形态发生的变化。在后来的研究中发现侵入 植物细胞的根瘤菌除了这些形态发生变化的以外，还有一些根瘤菌的形态和培养体 根瘤菌并没有很大的区别。由于植物根瘤细胞中的类菌体形态多样，有完全分化成 为分支状、棒状或者y 状的根瘤菌，也有一些没有分化的杆状，因此对于类菌体 ( b a e t e r o i d ) 的定义在很长时间内一直存在很大的争议。不同的根瘤菌研究学者提 出了自己对于类菌体的不同定义。d a n g e a r d 认为只有分支状的才是类菌体。于是不 含有分支状的大豆、豌豆、羽扇豆等根瘤便被排斥在外。f r e d 等则广义地把根瘤或 培养体中出现地膨大、棒状、弯曲或分支状形态的均属于类菌体。由于他们都只考 虑到了菌体的形态特征，又缺乏来自根瘤和培养体根瘤的上列特殊形态在生理和生 化特性上的同一性的比较研究数据，因而也难以被以后的根瘤菌研究工作者所接 受。在之后的很多年里面，又有很多的科学家提出了自己对于类菌体的定义，由于 个人的定义不同，在研究报道中带来了一些不必要的麻烦。因此在1 9 8 0 年的第四 次国际固氮会议上p a n k h u s t 建议统一类菌体的概念为把存在与成熟的，有固氮活性 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 的含菌植物细胞中的细菌称为类菌体。也就是说把凡是在植物根瘤细胞中的共生形 态均称为类菌体。我们在本文章中也采用了这种定义。 1 2 关于类菌体繁殖能力的研究进展 根瘤菌的生活周期一直存在一个很大的空缺，大家都知道，根瘤菌侵入植物细 胞后以类菌体的形式生活在根瘤里面执行其固氮功能，但当植物进入开花期后，植 物对于氮素营养的需求相对降低，根瘤菌无需再固氮来提供植物氮素养料。植物根 瘤开始衰败，根瘤里面的类菌体也逐渐失去固氮功能，那么失去固氮功能的类菌体 将何去何从呢? 是进入死亡，结束其生活史，还是转化为培养体的小杆菌，进入下 一周期的生活史? 显然，要是类菌体结束固氮功能后直接死亡，那么环境中的根瘤 菌将会越来越少，最终面临灭绝。但是这并不符合生物的实际情况。也就是说根瘤 菌存在其自己的生活方式，可能类菌体结束固氮使命后还可以转化为培养体根瘤 菌，或者部分死亡部分转化为培养体小杆菌进入下一周期的生活史。但是关于类菌 体的再繁殖问题，研究学者争论了一个世纪也没有完全准确的定论。 1 2 1 关于类菌体繁殖能力的早期争论 早在分离出类菌体纯培养之前，就已经开始了关于类菌体繁殖能力的争论。 t s c h i r c h 在研究过程中一直没能从根瘤中分离出类菌体，因而他提出了类菌体在本 质上并不是细菌的说法( 1 8 8 7 ) 。而同年，w i g a n d 也提出了类菌体是失去了繁殖能 力的某种畸形结构。1 8 8 8 年，b e i j e r i n c k 首次分离出了根瘤菌的纯培养，同时他也 提出了类菌体是失去了繁殖能力的根瘤菌，它只具有某种蛋白体的功能。与此同时， p r a z m o w s k i ( 1 8 8 8 ) 最初报道了类菌体和培养体可以相互转换，也就是类菌体可以 繁殖。但在两年后他又改变了观点，认为类菌体是不能繁殖的根瘤菌，是根瘤菌的 退化形态。此后不久，l a u r e n t ( 1 8 9 0 ) 和m a z e ( 1 8 9 8 ) 又报道了类菌体是正常的能繁殖 的形态，并提出它们是以出芽形成的某种球状细胞来繁殖的。a t k i n s o n ( 1 8 9 3 ) 却认为 充分发育的类菌体不能够再繁殖，并认为蛋白质物质的大量增加是造成类菌体失去 繁殖能力的主要原因。m r t l e b ( 1 9 0 0 ) 报道类菌体是正常的细胞形态，它们释放出某 种类似芽孢的小细菌，并进而发育出游动孢子。g r e i gs m i t h ( 1 8 9 9 ，1 9 0 1 ) 贝j j 认为类菌 体是被夹膜类物质包裹的球菌，是能够繁殖的。但l e w i s 和n i c h o l s o n ( 1 9 0 5 ) d q 于用 含有大量类菌体的根瘤菌稀释液倒平板只得到少量的菌落，因而他们认为内含空腔 和分支状的类菌体代表了根瘤菌发育的畸形阶段，不能恢复生长和繁殖。 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类苗体繁殖能力的研究 对于从十九世纪晚期到二十世纪初期关于类菌体繁殖能力的争论，可以概括为 以下三种观点： 1 繁殖论： 多数根瘤菌研究者都持这种观点。他们认为类菌体是根瘤菌完整生活史中的在 根瘤中执行固氮功能的一种特殊的共生形态，是具有繁殖能力的。持这一种观点的 研究者很多，但是这方面研究工作的证据多数都是根据对“只含有”类菌体的悬液培 养得到菌落或者显微镜下观察到生长而得到的。其中只有少数的研究者报道说他们 曾经直接观察到从类菌体开始的生长。如d er o s s i ( 1 9 0 7 ) 曾报道观察到了小杆菌在 植物根瘤中形成，并且这些小杆菌可以繁殖。根据他的报道，培养数日后的杆菌数 目还不足以形成可见的菌落，要继续培养1 2 天到一个月( 所需时间视培养基的成 分不同而异) ，才长出仅有针孔大的小菌落并很快崩解。按照以上描述的情况来看， 这些研究都没有很直接的证据证明类菌体的繁殖能力。因为最先讲的“只含有类菌 体的悬液”就是一个很大的环境，很难肯定是不是真的只含有类菌体，排除别的细 菌的污染情况；而d er o s s i 的研究也缺乏足够的证据来证实那些针孔大小的菌落是 不是杂菌污染。 2 不繁殖论 在繁殖论提出的同时甚至更早之前，就有一些学者则认为类菌体代表着根瘤菌 的畸形或者是退化的形态，已经失去了再繁殖的能力。这些学者中的典型代表就是 m u l l e r 和s t a h h ，他们首次采用了单细胞分离培养技术，仔细地从根瘤悬液中分离 到单个类菌体细胞，用通常的根瘤菌培养基以悬滴法进行培养，并在盖玻片上用印 度墨汁将单个类菌体予以标记。在培养过程中定期进行显微镜观察，经过3 天的连 续培养后，未能观察到类菌体地生长。从现在的观点来看，m u l l e r 等人的这个论据 并不是很充分，因为细菌生长本来就有一个延迟期，换了环境，可能引起细菌生长 需要较长的延迟期，而m u l l e r 在研究过程中只观察了3 天，很有可能类菌体的延迟 期较长，还没有开始生长。因此当时这个最为典型的证明类菌体不能繁殖的实验现 在看来也不够准确。 3 繁殖不定论 在众多学者提出繁殖论和不繁殖论的同时，还有一部分学者坚持自己的繁殖不 定论。他们认为类菌体的繁殖能力很难下定论，可能随着培养条件、根瘤年龄和类 菌体的形态等因素的影响而改变。如s c l m e i d e r ( 1 8 9 2 ) 在起初由于没能在培养中使类 3 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 菌体生长而认为类菌体不能繁殖，但在一年之后，他又报道说类菌体可以繁殖，但 其培养非常困难。b a z a r e w s k i l ( 1 9 2 7 ) 贝l j 相信幼年的类菌体可以再繁殖，而成熟的类 菌体不能够再繁殖。p f e i f f e r ( 1 9 2 8 ) 将类菌体区分为分支状和非正常状( 包括不规则 的杆状、弯曲和膨大等) 两大类。他认为只有分支状才是真正的类菌体，它们既不 能繁殖，但又不是畸形的形态。分支主要是由某些理化因素，特别是表面张力作用 剂的影响而造成的。 1 2 2a l m o n 的实验 早期关于类菌体繁殖能力最有说服力的实验要属a l m o n 在1 9 3 3 年进行的研究 了。她用显微操作器仔细地把从豌豆( p i s u ms a t i v u m ) ，红三叶草( t r i f o l i u np r a t e n s e ) 和苜蓿( m e d i c a g os a t i r e ) 根瘤中分离出单个的类菌体和小杆菌，然后将他们分别 放在8 种不同的适合根瘤菌生长的固体和液体培养基中培养，在培养中用显微镜进 行定期定位观察，并以培养体根瘤菌作为对照同时进行培养观察。她从4 1 1 个供试 类菌体细胞中，只观察到了一个长出了茵落。经分析，她认为这一生长并非真正来 自类菌体，而是由于操作过程中的失误所致。但在供试的1 6 3 个根瘤小杆菌和8 3 个培养体根瘤菌中，却分别长出了2 5 个和2 2 个菌落。在她于显微镜下定点观察的 7 5 个类菌体和“根瘤小杆菌中，经过4 天的培养之后，除有4 个杆菌长成菌落以 外，类菌体一个也没有生长。根据以上的实验结果，a l m o n 认为：类菌体即使可以 繁殖，他们在通常能够使杆菌繁殖的培养条件下也不能繁殖。 a l m o n 的研究基本上为大多数的根瘤菌研究者所承认，不繁殖论也因此而占 了上风。然而自此以后仍不时有关于类菌体能够繁殖的报道。如d e f o u b r u n e ( 1 9 4 9 ) 在他所著的显微操作技术中提到他曾用特殊的部分降解培养基，在石蜡油密闭 微室培养中直接观察到类菌体细胞的繁殖。但是由于他没有报道有关类菌体分离方 法和培养基等详细情况，这一结论的可靠性不是很高，因此也没有引起众多研究学 者的认同和支持。h c u m a n ( 1 9 5 2 ) 报道豌豆根瘤类菌体的含量和活菌百分率随其在根 瘤中所在的部位不同而异。据他报道，类菌体在根瘤顶部、过渡区、中心区和基部 的含量百分数分别为0 、7 0 、9 3 和4 5 ( 其余则为根瘤小杆菌) ，用吖啶橙活体染色 法估算了除顶部以外的其他三区中类菌体活菌数量的百分数分别为6 0 、3 5 、2 0 。此 外，他也宣称观察到了类菌体的繁殖。b e r g e r s e n 比较研究了经过洗涤的大豆根瘤菌 ( b r a d y r h i z o b i u m a h o n i c u m ) 类菌体和培养体根瘤菌在甘露醇酵母汁培养基上的繁 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类苗体繁殖能力的研究 殖能力。在他的实验中，类菌体的繁殖率低于0 0 2 ，而培养体则高达8 0 - - 9 0 。 此外他还报道从三叶草根瘤悬液中长出的菌落数量仅仅略低于其含有小杆菌数量， 而大大低于其中类菌体的数量。 1 2 3 不繁殖论的生化基础 在a l m o n 实验之后，一些研究者试图从生物化学方面来说明类茵体不能繁殖的 原因。s c h a e d ( 1 9 4 1 ) 首先报道了豌豆( p i s u ms a t i v u m ) 和蚕豆( m 妇a 妇) 类菌体 部呈现核物质染色的f e u l g e n 反应；而羽扇豆( l u p i n u as p p ) 类菌体也只有扩散性 的反应。此后h e u m a n ( 1 9 5 2 ) 则报道只有4 0 的豌豆( p i s u ms a t i v u m ) 类菌体表现 出f e u l g e n 反应。在进行了核酸成分的化学分析之后，r a u t a n e n 和s a u b e r t ( 1 9 5 5 ) 发 现大豆( g l y c i n em a x ) 和豌豆( p i s u ms a t i v u m ) 类菌体中核酸含量低于培养体根瘤 菌。b e r g e r s e n ( 1 9 5 5 ) 观察到地三叶草( t r i f o l i u ms p p ) 类菌体中核物质含量随根瘤年 龄的增长而降低。在对三叶草( t r i f o l i u ms p p ) 和苜蓿( m e d i c a g os p p ) 根瘤的内部 结构进行了电镜观察之后，d a r t 和m e r c e r ( 1 9 6 3 ) 发现在根瘤形成时，当小杆菌从侵 入线释放到寄主细胞中之后，其核物质含量相对地减少了。d i l w o r t h 和w i l l i a m s ( 1 9 6 7 ) 报道在黄色羽扇豆( l u p i n u ss p p ) 根瘤形成的最初六周内，每个类菌体中d n a 、 r n a 和蛋白质含量明显地下降。s u t t o n ( 1 9 7 4 ) 发现百脉根( l o t u sc o n i c u l a t u s ) 的一 个快生型根瘤菌的类菌体含有较培养体杆菌更低的d n a 含量。m a c k e n z i e 等人( 1 9 7 3 ) 报道苜蓿根瘤菌( r h i z o b i u mm e l i l o t i ) 的细胞壁在转化成类菌体的同时，由于厚度 降低而变得柔软而且具有特殊的表面特征。a g a r w a l 和m e h t a ( 1 9 7 4 ) 发现豌豆( p i s u m s a t i v u m ) 根瘤类菌体的d n a 在浮力密度和熔化温度等方面与培养体根瘤菌的d n a 不同。s u t t o n 和r o b e r t s o n ( 1 9 7 4 ) 也发现类菌体中核蛋白体数量较培养体更少。 以上这些研究都在生化基础方面为类菌体的不繁殖论提供了支持和解释。 1 2 4 对不繁殖论的冲击和繁殖论的新突破 对类菌体的生化特征的研究并非与不繁殖论完全一致。b e r g e r s e n ( 1 9 5 8 ) 发现大 豆根瘤菌类菌体与培养体的核酸含量并没有区别，从根瘤发生到成熟时期类菌体的 核酸含量亦没有明显的变化。s u r o n ( 1 9 7 4 ) 也报道慢生型羽扇豆根瘤菌( r 1 0 p i n i ) 的类菌体和培养体的d n a 在含量、浮力密度、熔化温度、分子量及其它动力学特 性方面没有区别。r e i j i n d e r 等人( 1 9 7 5 ) 比较研究了豌豆根瘤菌( 兄l e g u m i n o s a r u m ) 的类菌体和培养体的核酸含量和特性，他们发现就每一细胞的核酸含量而论，类菌 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 体是三倍于培养体；用c s c i 密度梯度离心，r n a - d n a 杂交和d n a 重组等方式比 较了这两种d n a ，没有发现他们在组成上有重大差别。b i s s c l i n g 等人( 1 9 7 7 ) 用 f c u l g c n 染色法和细胞荧光测定法研究了9 种不同根瘤菌的培养体和类菌体的d n a 含量，除去豌豆族( c o w p e ag r o u p ) 根瘤菌( c b 7 5 6 ) 外，类菌体的d n a 含量一 般是培养体的1 5 7 8 倍。此外，他们还发现d n a 含量与类菌体的大小呈正相关。 p a a u 等人( 1 9 7 8 ) 根据密度梯度离心的结果把首蓿( m e d i c a g os a t i v a ) 类菌体区分 为4 个组分，其大小和核酸含量各不相同。沉降最慢的组分1 是小杆菌，在大小和 核酸含量上均与培养体相同。沉降最快的组分4 比组分1 的类菌体和培养体长2 至 3 倍，其核酸含量则更高3 4 倍。组分2 与组分3 在形状和核酸含量方面均介于以 上两者之间。他们也报道了在类菌体大小和核酸含量之间的相关性。 对类菌体不繁殖论的重要突破发生在1 9 7 7 年。在一年内先后有三个研究小组 报道在特定的条件下可以使类菌体繁殖。s u t t o n 等人发现羽扇豆( l u p i n u s a n g u s t i f o l i u s ) 类菌体的繁殖百分率从接种后1 0 1 1 天的1 0 迅速下降到1 4 - 2 5 天的 0 3 ，他们还报道了类菌体的繁殖能力对渗透压十分敏感。t s i e n 等人则报道大豆 ( g l y c i n em a x ) 和n a v yb e a n 类菌体的平均繁殖率分别达到9 0 和5 1 ，并提出繁 殖率与根瘤菌菌株、根瘤年龄和环境条件无关。或许最令人的实验要算g r e s s h o f f 等人的研究了，他们采用纤维素酶分解根瘤原生质体( 即含有类菌体的植物细胞) 并从单个原生质体分离类茵体的技术，发现白三叶草( t ，i f o l i u mr e p e n s ) 和地三叶 草( r r i f o l i u ms p p ) 根瘤菌类菌体的繁殖率在渗透压保护条件下可以达到9 0 以上。 他们认为单个原生质体分离技术排除了对类菌体繁殖能力测定方法的任何可能的 批评，其优点在于：1 、不存在侵入线中的小杆菌或原生质体意外菌体的干扰。2 、 可以单个的计算每一原生质体中类菌体的数量。3 、排除根瘤中可能存在的酚类或 其他抑制性物质对类菌体繁殖能力的干扰。次年，g r e s s h o f f 和r o l l e ( 1 9 7 8 ) 又用 同样的方法研究了大豆( g l y c i n em a x ) 类菌体的繁殖能力，他们发现大豆类菌体不 能在普通根瘤菌培养基( b m m ) 上繁殖，但却能1 0 0 地在多加甘露醇的同一培养 基( b + 4 ) 上繁殖。他们在对早期研究中用于类菌体繁殖的培养基进行了比较后认 为：藉高浓度的甘露醇提供的渗透压保护和酵母浸出物的用量是类菌体在分化为杆 菌并并生长繁殖的两个重要条件。他们还把这一转化过程区分为以下的两个步骤： 1 、类菌体的表型的转变；2 、类菌体的再生长。 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 s u t t o n 和p a t e r s o n ( 1 9 8 0 ) 比较研究了3 4 种豆科植物根瘤菌类菌体的繁殖能力 及其对消毒剂的敏感性。实验表明在不同的豆科植物之问存在者很大的差异，同一 植物的类菌体的繁殖能力恰好与它们对消毒剂的抗性呈正相关。在全部供试植物种 类中，除5 种( g l y c i n em a x , l o t u sa u g u s t i s s i m u s , m a c r o p t i l i u ma t r o p u r p u r e u m , o r n i t h o p u ss a t i v u s , p h a s e o l sa u r e u s ) 植物的类菌体具有较高的繁殖能力并对消毒剂 处理有抗性；其余2 9 种豆科植物的类菌体均对消毒剂敏感并表现出较低的繁殖能 力。 我院生物固氮研究室曹燕珍等人( 1 9 8 4 ) 也采用g r e s s h o f f 等人的单个原生质 体分离方法，结合平板培养及微室培养技术比较研究了紫云英( a s t r a g a l u s s i n i c u s ) 、 三叶草( t r i f o l i u r ar e p e n s ) ，苜蓿( m e d i c a g o s p p ) 、苕子( i i c i a s a t i v a ) 和大豆( g l y c i n e m a x ) 根瘤类菌体的繁殖特性。实验表明：在四种供试快生型根瘤菌和慢生型大豆 根瘤菌形成的类菌体之间，在形态、功能区分和繁殖特性等方面有着明显的区别。 在紫云英、苣蓿、三时草和苕子根瘤的类菌体组织细胞中，根瘤菌表现出两种不同 的形态，一种是已分化发育呈棒状、t 状或丫状的类菌体，能固氮，但已经失去了 繁殖能力；另一种为没有分化的小杆菌，它们在形态上与培养体的根瘤菌相同，能 够在供试条件下生长繁殖。而在大豆根瘤的含菌细胞中，类菌体没有明显的形态分 化而与培养体根瘤菌相似，它们既能固氮又保持了相当高的繁殖能力( 繁殖率高达 8 1 ) 。我院固氮研究室的研究还表明，渗透压保护无论对于大豆根瘤类菌体还是紫 云英等快生根瘤菌中的小杆菌的生长繁殖，都不是决定性的必要条件。即使在渗透 压保护条件下，快生根瘤菌类菌体也不能繁殖。1 9 8 5 年，j c z h o u 等运用同样的 方法发现了根瘤中特化类菌体不可以再繁殖，而小杆菌可以再繁殖，且繁殖率与根 瘤瘤龄和根瘤和根压碎汁的加入与否有关。这一结论的提出否定了前人的一切关于 类菌体可以再繁殖的结论，这是国人关于类菌体繁殖问题提出的自己的不同看法。 但是在1 9 8 9 年，周俊初等在三叶草，豌豆根瘤类菌体繁殖能力时发现少数成熟的 三叶草和豌豆根瘤的类菌体可以转化为活跃的大杆菌，然后进一步转变为正常的根 瘤小杆菌。转化成为根瘤小杆菌后就可以沿之前的结论小杆菌再繁殖。那么是不是 在曹燕珍等前人的研究中错过了特化类菌体转化成为小杆菌的过程，而直接只观察 到了成为小杆菌后的过程呢? 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 1 2 5 关于类菌体繁殖能力的近期研究进展 关于类菌体繁殖能力的早期争论，从上上个世纪一直持续到上个世纪九十年 代，但是关于根瘤菌的生活史却一直都没完全确定下来。在之后的近二十年问， 很少的学者从事这方面的研究，因此在这方面一直存在空缺。但由于这项工作具 有较高的研究意义，因此近年来，又有不少学者开始了对类菌体繁殖能力的研究。 2 0 0 1 年，j m u l l e r 等将百脉根置于暗室中得到处于衰败期的根瘤，将根瘤压 碎培养与置于暗室之前的根瘤压碎汁培养比较，发现处于衰败期的根瘤中类菌体 的繁殖率明显高于非衰败期的繁殖率，从而推断衰败的类菌体可以再分化成为有 活性的，再繁殖的细菌。在最近的关于此方面的研究中，p e t e rm c r g a c r t 将定型瘤 和不定型瘤对比来研究，发现不定型瘤中类菌体的大小和d n a 含量明显高于定型 瘤中类菌体的大小和含量。且不定型瘤中的类菌体失去了在繁殖的能力而定型瘤 中的类菌体却可以再繁殖。 总的说来，在近期的关于类菌体繁殖能力的研究中，研究者的观点基本上都 是支持了早期研究者的繁殖论，只是在前人的基础上有了一定的发展。但是，从 j m u l l e r 和p e t e rm c r g a c r t 的研究来看，他们也只是采用类菌体涂布平板得到实验 结果，并没有直接的观察到类菌体的生长。因此可以说这个实验结果还是缺乏一 定的说服力的。在这个方面的研究还有待后人更进一步的研究，以得到更加具有 说服力的证据来证明类菌体的繁殖性。 1 3 关于类菌体繁殖率的研究 从现在研究的情况来看，类菌体的繁殖论一直是占据主要地位的。众多学者也 基本上支持了这一种观点。那么就算类菌体可以再繁殖，但是也并不是所有的类菌 体都可以再繁殖，存在一个繁殖率的问题。 繁殖率就是可以繁殖的根瘤菌类菌体占类菌体总数的百分比。在研究过程中采 用细菌计数器对根瘤中类菌体进行计数，得到的类菌体数目作为根瘤中的类菌体总 数，而同时将根瘤汁稀释涂平板计数，得到的菌落数作为可以繁殖的类菌体数目， 两个数目之比值就是这个根瘤中类菌体的繁殖率。从之前的研究结果来看，不同瘤 龄的根瘤中类菌体的繁殖率是不相同的。1 9 8 5 年，j c z h o u 在研究三叶草根瘤中 类菌体繁殖能力时发现2 周的根瘤中类菌体的繁殖率基本为零，但随瘤龄的增长其 繁殖率是逐渐增大的，到1 2 周的瘤龄时其繁殖率已经达到了近6 0 ( 1 9 8 5 ) 。1 9 8 9 8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 年，周俊初等人又发现在快生型的大豆根瘤中得到类菌体的繁殖率在刚现瘤时低于 0 1 ，到1 0 周瘤龄时增加到4 0 以上。而百脉根的根瘤中类茵体的繁殖率随瘸龄 的增加繁殖率也是增强的，并且处于衰败期的根瘤中类菌体的繁殖率是明显强于固 氮期的根瘤的繁殖率。2 0 0 1 年，j m u l l e r 等将百脉根置于暗室中得到处于衰败期的 根瘤，将根瘤压碎培养与置于暗室之前的根瘤压碎汁培养比较，发现处于衰败期的 根瘤中类菌体的繁殖率明显高于非衰败期的繁殖率，从而推断衰败的类菌体可以再 分化成为有活性的，再繁殖的细菌。而这些现象都从侧面证实了处于衰败根瘤的类 菌体是可以再繁殖成为有活力的细菌的。 1 4 前言小结 类菌体作为根瘤菌研究学者的一个重要研究方向，其繁殖能力一直缺乏足够的 证据被广大根瘤菌研究者所认同。从最初的不繁殖论到繁殖论然后又到不繁殖论， 直到现在繁殖论有了新的突破。但是还一直都没有直接观察到单个类菌体繁殖到菌 落的情况，所以繁殖论也显得不是那么证据充分。曹燕珍等和周俊初等人的研究都 是观察到了植物细胞中的小杆菌的繁殖。但是他们的结果并不能排除在植物生长后 期根瘤中的类菌体发生转化的可能性。v m c e n t 认为在老根瘤中出现的小杆菌可能 来源于：1 侵入线内或含菌细胞外的小杆菌大量繁殖；2 土壤中根瘤菌或者其他 细菌的侵染和繁殖；3 由类菌体转化成为小杆菌。周俊初等在研究中发现，三叶 草老龄根瘤单个原生质体释放的类菌体和豌豆根瘤破碎液中的少数类菌体，循着从 类菌体运动的大杆菌一正常的根瘤小杆菌的模式进行生长繁殖，表明特化类菌体 在根瘤发育后期可以重新转化成为小杆菌回到土壤中，从而充实了根瘤菌生活史学 说。 1 5 本研究的目的及意义 小结中提到周俊初教授在研究三叶草根瘤中类菌体的繁殖能力时曾发现类菌体 可以转化成为小杆菌进而繁殖。本研究的目的在于通过显微观察和拍照找到类菌体 转化成为小杆菌再繁殖的直接证据，以证明类菌体的繁殖能力，充实根瘤菌生活史 学说，并为进一步通过生化方法和遗传学方法研究类菌体繁殖奠定基础。 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 2 材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 供试植物和根瘤菌 根瘤菌n g r 2 3 4 由华中农业大学固氮室引进并保存。 试植物大翼豆( m a c r o p t i l i u ml a t h y o i d e s ) 从云南林木工作总站购买，白灰毛豆 ( t e p h r o s i ac a n d i d a ) 从浙江发展园林有限公司购买，大豆( g l y c i n em a x ) 、扁豆 ( l a b l a b p u r p u r e u s ) 、豇豆( h g n au n g u c u l a t a ) 由华中农业大学生物固氮室提供。 2 1 2 培养基 y m a 培养基 甘露醇( 或蔗糖) 1 0 9 酵母粉 o 4 9 k 2 i - i p 0 4 0 5 9 m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 n a c l 0 1 9 c a c l 2 6 1 - 1 2 0 0 1 9 * r h 微量元素液4 m l 蒸馏水( d d i - 1 2 0 ) 1 0 0 0 m l p h 6 8 7 0 * r h 微量元素液配方 h 3 8 0 3 n a m n 0 4 d d h 2 0 l o 5 9 5 9 1 0 ( ) 呖1 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤苗特化类菌体繁殖能力的研究 j e n s e n 无氮植物营养液 c a h p 0 4 m g s 0 4 7 1 4 2 0 k h 2 p 0 4 n a c l f e c l 3 * g i b s o n 微量元素液 d h 2 0 p h 7 0 7 2 * g i b s o n 微量元素液配方 h 3 8 0 3 2 8 6 9 z n s 0 4 7 h 2 0 0 2 2 9 b i n s 0 4 4 h 2 0 2 0 3 9 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 00 1 2 6 9 c u s 0 4 5 h 2 00 0 8 9 d h 2 0 1 0 0 0 m l 2 1 3 化学试剂 0 1 酸性升汞溶液：先加很少量h c i 至l j h g c l 2 q a ，使之溶解，再加入双蒸水， 使h g c l 2 终浓度为0 1 。 2 1 4 培养条件 根瘤菌培养条件：摇床振荡培养为2 0 0 r m i n , 2 8 1 2 ，温箱培温度为2 8 ： 植物条件培养：光照培养室培养，温度 2 5 ，每天光照1 0 h r 。 1 1 罐 h艇忍瑶砒趣叫咖 l o o o 1 1 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文根瘤菌特化类菌体繁殖能力的研究 2 2 实验方法 2 2 1 砂子处理 细砂先自来水冲洗，以洗去砂子中的泥，砂子凉干后装于事先准备好的装好了 棉条的塑料水杯中，将装好了砂子的塑料水杯用纸扎好口子，将杯子放入大口的玻 璃瓶中，玻璃瓶里装x , j e n s e n 无氮植物营养液。将整个玻璃瓶于1 2 1 1 2 灭菌2 小时。 2 2 2 种子处理 种子表面灭菌及催芽：挑选颗粒饱满的植物种子，在灭菌平皿中，用9 5 的酒精 浸泡种子5 m i n ，以洗去表面蜡质。倾去酒精后，加入0 1 次氯酸钠浸泡3 m i n 进行 表面灭菌，倾去该溶液后，用无菌水洗涤6 8 次，以彻底洗去灭菌液。最后，加入 适量的无菌水浸泡种子2 小时，倾去无菌水，将泡涨的种子铺于略湿的平板中2 8 。c 避 光催芽1 2 天，避光催芽中间，每隔1 2 d , 时换水一次。 2 2 3 播种与管理 待催芽的种子根尖约长到l c m 时，即可播种。播种时将灭菌完成的砂钵用灭过 菌的镊子小心撕破杯子口上的纸，选取催芽后发芽较好的种子，将种子胚根向下插入 砂子中，使种子固定住。每